使用实时 PCR 检测血清和血浆中的拷贝数

摘要

本文描述了采用实时PCR方法对血清或血浆DNA进行拷贝数变异分析的过程。该方法适用于预测去势抵抗性前列腺癌患者的药物耐药性，但也可为其他疾病提供有价值的信息。

摘要

血清和血浆中的游离DNA（cfDNA）已被证明是癌症诊断、预后评估、疗效监测以及预测治疗耐药性的信息丰富且无创的生物标志物来源。基于雄激素受体（AR）基因拷贝数（CN）增加是转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）中常见事件的假设，我们提出在cfDNA中分析该事件，作为潜在的预测性生物标志物。

我们采用两种不同的实时PCR检测方法和两个参考基因（RNaseP 和 AGO1）对cfDNA中的AR拷贝数（CN）进行了评估。每次检测组合使用60 ng的DNA量。为获得更准确的结果，我们采用数字PCR验证了AR拷贝数的增加。拷贝数变异分析已被证实可用于预测转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）治疗耐药性，但也可能适用于其他患者群体中的不同用途。基于cfDNA的拷贝数分析具有多项优势：具有非侵入性、操作快速简便，且仅需少量血清或血浆样本即可开展。

引言

血液中循环的游离DNA（cfDNA）已被证明是癌症诊断、预后评估、疗效监测以及治疗耐药性预测的理想生物标志物来源^1,2。许多研究已证实，组织中的DNA改变（如突变、拷贝数变异、表观遗传修饰）与相应血浆样本中检测到的改变具有良好的一致性¹，表明循环肿瘤DNA（ctDNA）能够有效反映原发性和转移性肿瘤组织的基因组改变³。对ctDNA的研究使得重建特定癌基因的基因组重排和拷贝数变异（CNVs）成为可能⁴，从而识别潜在的转移性克隆和亚克隆细胞。ctDNA在临床中尤其适用于癌症治疗的动态监测，因其携带与特定靶向治疗相关的特异性突变和拷贝数变异^5,6。此外，ctDNA检测避免了组织活检的需要，能够在特定癌症治疗过程中以非侵入性方式在不同时间点获取检测结果。

关于前列腺癌，循环游离雄激素受体（AR）拷贝数变异（CNV）与阿比特龙和恩杂鲁胺治疗反应之间存在显著相关性，表明血浆游离DNA（cfDNA）中的AR基因拷贝数（CN）可能是预测治疗耐药性的有前景的生物标志物

方案

该方案包括从血清或血浆样本中分离DNA，以进行实时PCR拷贝数分析。实验步骤包括DNA提取、DNA定量控制（分光光度法）以及针对特定目标的实时PCR。在图1中，列出了实验流程和时间安排的概要。

该方案遵循 IRST 人类研究伦理委员会的指南。

1. 血清采集与处理

1. 采集约 5 mL 全血至不含抗凝剂的血清管中以获取血清。处理前将血样管保持在 4 °C。
2. 在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 15 分钟。
3. 小心将血清转移至 2 mL 管中。
4. 弃去采血管，并立即将上清液在 -80 °C 冻存，直至使用。

2. 血浆采集与处理

1. 采集约 10 mL 全血至含 EDTA 的血浆管中以获取血浆。将试管完全填满后，轻轻倒置 8 次。在处理前将血液样本管保持在 4 °C 环境中。
2. 在室温下以 1,800 × g 离心 15 分钟，离心时离心机不启用刹车功能。
3. 小心地将上层血浆转移至 2 mL 离心管中。重复转移操作，每次需在白细胞层上方至少保留 1 mL 上清液。
   注意：仅转移上清液的上层部分可降低细胞或细胞碎片污染的风险。

结果

所有分析样本的总cfDNA浓度均可通过分光光度法测定，其中血清样本的中位浓度为6.12 ng/µL（范围：2.00 - 23.71 ng/µL），血浆样本的中位浓度为3.21 ng/µL（范围：2.31 - 8.49 ng/µL）。我们共对115个样本进行了实时PCR实验分析。

通过使用高扩增或低扩增AR患者的混合血清DNA以及健康供体的DNA来评估检测灵敏度，后者也用作拷贝数分析的校准样本。如图2所示，在含有AR扩增的患者DNA与健康供体DNA混合后，当患者DNA比例低至0.375%时，仍可充分检测到AR拷贝数的增加（图2）。因此，该方法能够检测到极低水平的拷贝数扩增。对每位患者拷贝数检测中的ΔCt标准差进行了计算（中位数 ± 标准差 = 0.1，范围：0.00 - 0.36）。.......

讨论

AR 拷贝数分析在血清和血浆样本中代表了一种新的无创方法，可用于对去势抵抗性前列腺癌（CRPC）患者进行分层。最近的研究表明，在接受阿比特龙和恩杂鲁胺治疗的CRPC患者中，无论是在化疗前还是化疗后，AR 拷贝数均能够预测治疗结局^7,8,9,10。

本方法的主要优势在于其实验流程极为简便，仅包括DNA提取、一次实时PCR分析以及简单的数据分析。此外，该检测可在1个工作日内快速完成，且成本低廉（每个样本约20美元）。我们已证实，该方法具有高度可重复性，所得结果与更昂贵且精确的方法（包括数字PCR^7,8）的结果一致。此外，我们在经阿比特龙治疗的血浆样本中，使用靶向NGS方法检测到的<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD Vacutainer 血清管	Becton Dickinson	367814	用于血清的全血采血管
BD Vacutainer EDTA 管	Becton Dickinson	366643	用于血浆的全血采血管
无水乙醇	VWR		用户也可使用其他公司的产品
TaqMan 拷贝数检测	Thermo Fisher Scientific	4400291	预设计并已验证的含 FAM 荧光染料的检测。我们使用了以下检测：AR_assay1: hs04107225 和 AR_assay2: hs04511283
TaqMan 拷贝数检测（修饰版）	Thermo Fisher Scientific	4467084	经修饰加入 VIC 荧光染料的预设计检测：AGO1: Hs02320401_cn
TaqMan 拷贝数参考检测（人源，RNase P）	Thermo Fisher Scientific	4403326
TaqMan 通用 PCR 主混合液	Thermo Fisher Scientific	4326708	实时 PCR 用主混合液
QIAamp DNA Mini Kit (50)	Qiagen	51304	DNA 提取试剂盒
MicroAmp 96 孔板	Thermo Fisher Scientific	N8010560	用于实时 PCR 的板
NanoDrop 1000 分光光度计	Thermo Fisher Scientific	-	用户也可使用其他分光光度法来定量 DNA
7500 Fast 实时 PCR 系统	Applied Biosystem	-	用户也可使用其他实时 PCR 仪器
CopyCaller 软件	Applied Biosystem	-	用于拷贝数分析的软件