方法文章

改进的小鼠骨骼肌染色质沉淀的协议

DOI：

10.3791/56504

⸱

2017年11月6日

 ,  ,  , 
1Department of Functional Genomics and Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire

本文内容

摘要

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本文介绍了一种新的制备成年小鼠骨骼肌染色质的方法, 该方法适合于用染色质沉淀研究肌纤维的基因调控。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们描述了一个有效的和可复制的协议, 从成年小鼠骨骼肌的染色质制备, 一个具有高含量结构蛋白的身体抗性组织。从成年小鼠身上解剖肢体肌肉被机械化, 或切碎和 douncing 的组合, 在低渗缓冲液中, 在甲醛固定的细胞裂解。固定核通过机械化或 douncing 的进一步循环纯化, 并连续过滤去除细胞碎片。纯化后的核可以立即声或在冷冻后的后期进行。染色质可以有效地声, 适用于染色质沉淀实验, 如为转录因子、RNA 聚合酶 II 和共价键组蛋白修饰所获得的剖面所示。使用本协议所制备的染色质检测到的绑定事件主要是在肌纤维核中发生的, 尽管其他纤维相关的卫星和内皮细胞存在染色质。因此, 本议定书适用于研究成年小鼠骨骼肌的基因调控。

引言

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染色质沉淀 (芯片) 结合定量聚合酶链反应 (qPCR) 和高通量测序 (芯片序列) 已成为选择的方法研究转录和表观遗传调控的基因表达在各种组织和单元格类型1。这项技术允许基因组范围内共价染色质修饰, 蛋白的变体占用, 和转录因子绑定2,3。

虽然从培养细胞中执行芯片是很好的建立, 从哺乳动物组织芯片仍然是更具挑战性。为芯片准备染色质涉及几个关键步骤, 需要优化每一个组织和细胞类型。染色质可以从细胞裂解培养细胞或在其细胞核纯化后制备。在哺乳动物组织的情况下, 有效的裂解, 甲醛固定和纯化的细胞核是至关重要的, 以确保最佳的恢复染色质。此外, 选择是否修复核之前或之后, 他们的纯化必须实验确定。尽管有这些障碍, 芯片已成功地从组织, 如肝脏, 睾丸, 或大脑4,5,6。在骨骼肌肉的情况下, 破坏这种身体上的抗性组织, 它表现出高含量的结构蛋白, 和孤立的细胞核是特别具有挑战性的。鉴于这种特异性, 为其他组织优化的协议不会给骨骼肌肉带来令人满意的结果。

在这里, 我们描述了一个....

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方案

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根据国家动物保育指导方针 (欧洲委员会指令 86/609/中欧和东欧), 按照有关实验室动物的护理和使用的机构准则, 对老鼠进行了保存;法国法令 87-848)。所有程序均由法国国家伦理委员会批准.

1. 肌肉组织的分离

  1. 由颈椎脱位牺牲一成人6至8周大鼠。Sterlise 用70% 乙醇冲洗四肢, 用细点剪刀和镊子解剖后肢肌肉 (腓肠肌、胫骨前、四头肌).
    注意: 一只老鼠应该产生大约500毫克的组织.
  2. 将2毫升测试管中的肌肉剁碎, 其中含有1毫升的 ice-cold 低渗缓冲液, 以均匀制备小 (#60; 2-3 mm 3 ) 件使用细剪刀和离开管晃动在一个板凳顶部搅拌器在4和 #176; C 为 5-10 min.

2。组织裂解

注意: 对于所有的缓冲区组合, 请参阅 表 1 。

  1. 将匀浆转移到14毫升的圆底管和重5毫升的冷低渗缓冲液 (无 EDTA 蛋白酶抑制剂鸡尾酒和 PMSF).
    1. 使用松散的 dounce (3 分钟内 20-30 冲程) 或机械组织均质体在 15-三十年代的圆底14毫升管中必须碎肌肉组织.
      注: 在这个阶段, 可以通过光显微镜对裂解的效率进行评估, ....

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结果

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为了分离细胞核, 我们在15或四十五年代, 在1.8万和 2.2万 rpm 进行了解剖和碎肌组织的机械均质化 (参见材料表)。在所有条件下, 细胞核可以与组织的碎片分离, 但产量是最好的使用较低的速度 (图 1A-b)。原子核也可以由 douncing 为 3-5 min (图 1A, 和数据没有显示), 但机械均匀化是选择的方法, 因为最理想的产量的原子核可以实现在尽可能少的十五年代, 使时间的重要增益, 特别是如果必须处理多个示例 (图 1B)。使用该协议, 多达 2.7 x 107核从500毫克的组织 (相当于1鼠标的组织) 可以隔离, 以产生100µg 染色质。

为了优化染色质碎.......

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讨论

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在这里, 我们描述了一个新的协议, 从成年小鼠骨骼肌肉制备染色质, 并表明, 这种染色质是适用于芯片实验, 检测转录因子结合和共价键组蛋白修饰肌纤维核。此协议涉及几个关键步骤。第一种是组织破坏, 可以通过 dounce 或机械剪切来进行。机械剪切速度快, 重现性好, 因此是选择的方法。不过, 如果没有合适的仪器, 也可以由 douncing, 在进行固定步骤之前, 建议在显微镜下对裂解效率进行评估。固定的全组织裂解, 而不是固定的孤立核, 允许更多的可再生超声在较小的体积和短期内。我们还选择在中断后修复裂解, 而不是在中断之前修复组织, 如托马斯et al.所描述的那样。10预修复组织导致化效率降低。该协议的基础上, 机械剪切也比其他建议的解决方案, 如胶原酶消化, 这涉及长期孵化的解剖组织在37° c8。在此期间, 基因表达和转录因子结合的变化可能发生。因此, 尽可能快地修复细胞核是更忠实地捕捉正常生理状态的关键。

第二个关键步骤是从固定的裂解液中提纯原子核。为此, .......

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披露

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作者声明他们没有竞争的金融利益。

致谢

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我们感谢 IGBMC 高吞吐量测序设施的所有工作人员, 即 "法国 Génomique" 财团 (ANR10-INBS-09-08) 的成员和所有 IGBMC 一般事务人员, 特别是 IGBMC 动物设施的工作人员。这项工作得到了来自 CNRS、INSERM、AFM、甲国家组织勒癌症的赠款、法国全国基金在 Investissements 艾文莉标记 ANR-10-IDEX-0002-02、Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 和ANR-AR2GR-16-CE11-009-01资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或准备原稿方面没有作用。甲组织的支持下, 美国的 ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, 和五, U 由 Ministère de Enseignement 等研究。ID 是一个 ' équipe labellisée ' 的甲国立组织勒癌症。

....

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材料

名称<

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
T 25 数字式 ULTRA-TURRAXT 18 ULTRA-TURRAX0009022800
PMSFSIGMA-ALDRICH CHIMIE SARLP7626-25G
蛋白酶抑制剂混合物-不含 EDTA罗氏诊断11873580001
蛋白 G 琼脂糖珠SIGMA-ALDRICH CHIMIEP-3296
蛋白酶 KSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-2308
细胞过滤器 70um康宁 BV431751
细胞过滤器 40um康宁 BV352340
甲醛 EM 级Euromedex15710-S
Rnase AFischer Scientific12091039
苯酚：氯仿：异戊醇 25：24：1SIGMA-ALDRICH CHIMIEP3803
BSASIGMA-ALDRICH CHIMIEB4287-25G
酵母 tRNASIGMA-ALDRICH CHIMIER5636
糖原蓝AMIBIONAM9516
Pol II ChIP 抗体Santa CruzSC-9001
H3K27ac ChIP 抗体活性基序39133
Tead4 ChIP 抗体Aviva Systems Biology（ARP38276_P050）
IGEPALSIGMA-ALDRICH CHIMIEI-3021
E220 聚焦超声仪Covaris E220
/strong>公司目录号评论
其他项目
剪刀
松散的 Dounce
15 ml 和 50 ml falcon 管
14 ml 圆底管
1.5 ml 和 2 ml Eppendorf 管
70 μm 和 40 μm 细胞过滤器 （Corning）

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  2. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interac....

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重印与许可

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标签

DNA

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