本文介绍了一种改良的染色质制备新方案，适用于从成年小鼠骨骼肌中提取染色质，以通过染色质免疫沉淀技术研究肌纤维中基因表达的调控机制。
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本文内容
摘要
摘要
我们描述了一种高效且可重复的小鼠成年骨骼肌染色质制备方案，该组织具有较强的物理抗性且富含结构蛋白。从小鼠成年肢体肌肉中分离出的肌肉组织，在低渗缓冲液中通过机械匀浆，或切碎与吹打相结合的方式进行物理破碎，随后对细胞裂解物进行甲醛固定。固定后的细胞核通过进一步的机械匀浆或吹打处理，并结合连续过滤步骤以去除细胞碎片，从而实现纯化。纯化的细胞核可立即进行超声处理，也可在冷冻后于后续阶段进行。所获得的染色质可高效地被超声打断，适用于染色质免疫沉淀实验，这一点已通过转录因子、RNA聚合酶II以及共价组蛋白修饰的检测结果得到验证。尽管样品中存在来自其他纤维相关卫星细胞和内皮细胞的染色质，但利用本方案制备的染色质所检测到的结合事件主要来源于肌纤维细胞核。因此，该方案特别适用于研究小鼠成年骨骼肌中的基因调控机制。
引言
染色质免疫沉淀（ChIP）联合定量聚合酶链式反应（qPCR）和高通量测序（ChIP-seq）已成为研究多种组织和细胞类型中基因表达转录调控及表观遗传调控的首选方法1。该技术可实现对全基因组范围内共价染色质修饰、组蛋白变体占据情况以及转录因子结合位点的系统性分析2,3。
尽管从培养细胞中进行染色质免疫沉淀（ChIP）已有成熟方法，但从哺乳动物组织中进行ChIP仍更具挑战性。为ChIP制备染色质涉及多个关键步骤，这些步骤需要针对每种组织和细胞类型进行优化。染色质可从培养细胞的细胞裂解物中制备，也可在纯化其细胞核后进行制备。对于哺乳动物组织而言，高效的裂解、甲醛固定以及细胞核的纯化是确保染色质最佳回收率的关键。此外，是否在细胞核纯化前或纯化后进行固定，需通过实验确定。尽管存在这些困难，ChIP已成功应用于肝脏、睾丸或脑组织4,5,6。对于骨骼肌而言，由于该组织物理抗性较强且富含结构蛋白，其破坏和细胞核的分离尤为困难。鉴于这一特殊性，为其他组织优化的方案在骨骼肌中往往无法获得满意结果。
本文介绍一种从小鼠骨骼肌组织中分离出适用于染色质免疫沉淀（ChIP）的染色质的实验方案，该方法包括对组织进行物理破碎、甲醛固定，随后分离细胞核并进行超声处理。通过针对多种转录因子、RNA聚合酶II以及共价组蛋白修饰开展ChIP-qPCR和ChIP-seq实验，验证了该方法制备适用于ChIP的染色质的高效性7。
这种新方法比之前报道的一种方案8快得多，原方案包含长时间的胶原酶消化步骤，在此期间，转录因子的基因组定位变化以及基因表达的改变可能发生。本方法能够快速分离并固定细胞核，因而特别适用于制备更真实反映天然基因组占据状态的染色质。此外，尽管已有其他用于从肌肉组织中分离染色质或提取蛋白质的方法被报道8,9,10，并用于特定基因的ChIP-qPCR实验，但尚未见使用这些方法获得的ChIP-seq数据。本文报道的方法适用于转录因子和组蛋白修饰的ChIP-seq，因此也应适用于3/4C或HiC染色质构象捕获应用。
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方案
小鼠的饲养遵循关于实验动物护理与使用的机构指南以及国家动物护理指南（欧洲委员会指令 86/609/CEE；法国法令第 87-848 号）。所有操作均经法国国家伦理委员会批准。
1. 肌肉组织的分离
- 通过颈椎脱位法处死一只6至8周龄的成年小鼠。用70%乙醇冲洗肢体进行消毒，使用尖头剪刀和镊子解剖后肢肌肉（腓肠肌、胫骨前肌、股四头肌）。
注意：一只小鼠应可获得约500 mg组织。 - 在含有1 mL冰冻低渗缓冲液的2 mL试管中，用尖头剪刀将肌肉剪切成均匀的小块（<2–3 mm3），然后将试管置于4 °C的台式振荡器上振摇5–10分钟。
2. 组织裂解
注意：所有缓冲液成分请参见表1。
- 将匀浆转移至一个14 mL圆底管中，并用5 mL冰冷的低渗缓冲液（不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物和PMSF）重悬。
- 使用松配合的Dounce匀浆器（在3分钟内研磨20–30次）或机械组织匀浆器，在14 mL圆底管中对剪碎的肌肉组织进行匀浆处理，持续15–30秒。
注意：此时可通过光学显微镜评估裂解效率，如有需要，可进一步进行破碎处理。
- 使用松配合的Dounce匀浆器（在3分钟内研磨20–30次）或机械组织匀浆器，在14 mL圆底管中对剪碎的肌肉组织进行匀浆处理，持续15–30秒。
- 将匀浆转移至15 mL离心管中，并用冰冷的低渗缓冲液定容至10 mL。在继续处理下一只小鼠之前，按以下方法对匀浆进行固定。
3. 固定
- 加入甲醛至终浓度为1%，在室温下振荡10分钟。
- 每管中加入甘氨酸至终浓度为0.125 M，以终止固定，在室温下振荡 5 - 10分钟。
4. 细胞核制备
注意：所有缓冲液配方请参见表1。
- 使用松散的玻璃匀浆器（5–10 次 strokes）均质化固定后的裂解液。
- 转移至 15 mL 离心管中，在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟，以收集细胞核和细胞碎片。
- 弃去上清液，将沉淀重悬于 5 mL 新鲜的低渗缓冲液中。将裂解液通过 70 µm 细胞筛过滤至 50 mL 管中，再将滤液通过 40 µm 细胞筛进行二次过滤。
- 将滤液转移至 15 mL 离心管中，在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟，获得细胞核沉淀。
注意：此时可立即进行超声处理，或将沉淀在液氮中速冻成干粉后于 -80 °C 保存。
5. 超声处理
- 评估细胞核沉淀的体积（机械法和Dounce匀浆法均约为50 µL），加入相当于细胞核压实体积3至4倍的超声破碎缓冲液，于4 °C使用超声破碎仪超声处理10至15分钟。
注意：染色质可按以下步骤（6）立即进行分析，也可冷冻后于-80 °C保存。
6. 超声处理后评估染色质片段大小
注意：所有缓冲液成分请参见表1。
- 为解除交联，取30 µL染色质置于1.5 mL离心管中，加入20 µL 5 M NaCl。加水至终体积为500 µL，65 °C过夜孵育。
- 次日，加入1 µL蛋白酶K（20 mg/mL储存液）、10 µL 2 M Tris（pH 6.8）和10 µL 0.5 M EDTA，在42 °C处理1小时。进行苯酚-氯仿/氯仿抽提，并加入1体积乙酸钠（3 M）和2体积100%乙醇，在-80 °C放置1小时或-20 °C过夜沉淀DNA。
- 在13,500 × g离心15分钟以沉淀DNA。弃去上清液，用预冷的70%乙醇充分洗涤沉淀，再离心5分钟。弃去上清液，将沉淀在空气中干燥。
- 将沉淀重悬于原始体积（30 µL）的TE缓冲液中。使用分光光度计通过260 nm/280 nm吸光度测定DNA浓度。取500 - 1,000 ng DNA与DNA分子量标记物分别上样至1.5%琼脂糖凝胶的不同泳道，进行电泳以评估染色质片段大小。
注意：片段大小应在200 - 500碱基对之间，不应检测到对应于未充分剪切或剪切不完全DNA的高分子量片段。如有需要，可对染色质溶液（步骤5）进行更长时间的超声处理，然后按上述方法重新分析，直至获得最佳片段大小。
7. 染色质免疫沉淀（ChIP）
注意：所有缓冲液成分请参见表1。
- 通过将1 mL 50%乙醇悬浮液中的Protein G Sepharose珠进行分装来封闭珠子。在台式离心机中以400 × g离心1分钟使珠子沉淀，用1 mL TE缓冲液洗涤，再以400 × g离心，重复洗涤一次。
- 第二次离心后，将珠子重悬于1 mL ChIP稀释缓冲液中，其中含25 µL BSA（储存液20 mg/mL）和20 µL酵母tRNA（储存液10 mg/mL）。在4 °C下旋转孵育（40–60 rpm）至少2小时，以封闭珠子，之后即可使用。
- 将50 µg染色质（第5步）用ChIP稀释缓冲液稀释8至10倍。加入50 µL已封闭的珠子悬浮液，在4 °C下旋转孵育2小时。在4 °C下以400 × g离心，获得预清除的染色质，转移至新管中。
- 进行免疫沉淀时，加入适量的一抗（例如，每10 µg染色质加入1–2 µg），在4 °C下旋转孵育过夜。
注意：抗体的最佳用量可参考供应商建议，或通过使用不同量抗体进行ChIP-qPCR实验，根据富集效果经验性确定。此外，根据所用抗体的亚型，可用Protein A Sepharose替代Protein G Sepharose。 - 次日加入已封闭的珠子，在4 °C下旋转孵育1小时（40–60 rpm）。以400 × g离心20–30秒使珠子沉淀，弃去上清，开始ChIP洗涤步骤。
- ChIP洗涤：依次使用以下缓冲液进行洗涤：低盐缓冲液洗涤一次，高盐缓冲液洗涤两次，LiCl缓冲液洗涤两次，最后用TE缓冲液洗涤两次。
- 每次洗涤在4 °C下旋转孵育10分钟（40–60 rpm），每次洗涤后在台式离心机中以400 × g离心20–30秒使珠子沉淀。
- 洗脱时，去除最后一次洗涤液，将珠子重悬于250 µL新配制的洗脱缓冲液中，在室温下振荡15分钟。
- 以400 × g离心，将洗脱液收集至新管中。此步骤重复两次，然后加入20 µL 5 M NaCl和1 µL RNase A（10 mg/mL），于4 °C过夜解交联，接着按第6步操作进行蛋白酶K处理及苯酚-氯仿/氯仿抽提。
- 将产物重悬于50 µL TE缓冲液中，按标准方案15取部分样品进行ChIP-qPCR，以评估ChIP实验质量。
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结果
为分离细胞核，我们对解剖并切碎的肌肉组织进行机械匀浆处理，匀浆时间分别为15秒或45秒，转速为18,000和22,000 rpm（参见材料表）。在所有条件下，细胞核均可从组织碎片中分离出来，但使用较低转速时得率最佳（图1A-B）。细胞核也可通过Dounce匀浆器处理3-5分钟制备（图1A，数据未显示），但机械匀浆是首选方法，因为仅需15秒即可获得最佳的细胞核得率，尤其在需要处理多个样本时可显著节省时间（图1B）。采用本方案，从500 mg组织（相当于1只小鼠的组织量）最多可分离得到2.7 × 107个细胞核，用于制备100 µg染色质。
为了优化固定细胞核中的染色质片段化，我们进行了5至...
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讨论
本文介绍了一种从成年小鼠骨骼肌制备染色质的新方案，并证明该染色质适用于染色质免疫沉淀（ChIP）实验，可检测肌纤维细胞核中转录因子的结合以及组蛋白的共价修饰。该方案包含多个关键步骤。第一步是组织破碎，可通过Dounce匀浆器或机械剪切实现。机械剪切速度更快且可重复性更高，因此是首选方法。然而，若缺乏合适的设备，也可采用Dounce法进行破碎，此时建议在进入固定步骤前，在显微镜下评估裂解效率。我们采用对完整组织裂解物进行固定，而非对分离的细胞核进行固定，这使得在较小体积和较短时间内进行超声处理时结果更具可重复性。此外，我们选择在组织破碎后对裂解物进行固定，而不是像Thomas et al.10所述那样在破碎前对组织进行预固定，因为预固定会导致匀浆效率降低。基于机械剪切的本方案也比其他已提出的方法（如胶原酶消化）更快，后者需要将分离的组织在37 °C下长时间孵育8。在此期间可能发生基因表达和转录因子结合状态的改变。因此，尽快固定细胞核对于更真实地捕获正常的生理状态至关重要。
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢IGBMC高通量测序平台的所有工作人员，该平台是 "法国基因组学" 由法国国家研究局（ANR10-INBS-09-08）资助的联合体以及IGBMC所有通用服务部门，特别是IGBMC动物设施的工作人员。本研究获得了法国国家科学研究中心（CNRS）、国家健康与医学研究院（INSERM）、法国肌萎缩症协会（AFM）、法国抗癌联盟（Ligue Nationale contre le Cancer）、法国国家研究局（ANR）通过“未来投资计划”（Investissements d'Avenir）项目（编号ANR-10-IDEX-0002-02）、Labex INRT（编号ANR-10-IDEX-0001-02）以及ANR-AR2GR-16-CE11-009-01提供的资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中未发挥任何作用。S.J. 受法国抗癌联盟和ANR-AR2GR-16-CE11-009-01资助，V.U. 受法国高等教育与研究部（Ministère de l'Enseignement et de la Recherche）资助。ID 是法国抗癌联盟认证的“标签化研究团队”（équipe labellisée）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| T 25 数字 ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| 蛋白酶抑制剂混合物-无EDTA | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose 微珠 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| 蛋白酶K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| 70 μm 细胞筛 | Corning BV | 431751 | |
| 40 μm 细胞筛 | Corning BV | 352340 | |
| 电子显微镜级甲醛 | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| 苯酚:氯仿:异戊醇 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| 酵母tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| 蓝色糖原 | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP 抗体 | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP 抗体 | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP 抗体 | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 聚焦式超声破碎仪 | Covaris E220 | ||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 其他物品 | |||
| 剪刀 | |||
| 松配合Dounce匀浆器 | |||
| 15 ml 和 50 ml 离心管 | |||
| 14 ml 圆底管 | |||
| 1.5 ml 和 2 ml Eppendorf管 | |||
| 70 μm 和 40 μm 细胞筛 (Corning) |
参考文献
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