从小鼠骨骼肌中改进的染色质免疫沉淀实验方案

摘要

本文介绍了一种改良的染色质制备新方案，适用于从成年小鼠骨骼肌中提取染色质，以通过染色质免疫沉淀技术研究肌纤维中基因表达的调控机制。

摘要

我们描述了一种高效且可重复的小鼠成年骨骼肌染色质制备方案，该组织具有较高的结构蛋白含量且物理抗性强。从小鼠成年肢体肌肉中分离出的肌肉组织，在甲醛固定细胞裂解物之前，通过机械匀浆或切碎与吹打相结合的方式，在低渗缓冲液中进行物理破碎。固定后的细胞核通过进一步的机械匀浆或吹打以及连续过滤步骤进行纯化，以去除细胞碎片。纯化的细胞核可立即进行超声处理，也可在冷冻后于后续阶段进行。所获得的染色质可高效地被超声打断，适用于染色质免疫沉淀实验，这一点已通过转录因子、RNA聚合酶II以及共价组蛋白修饰的检测结果得到验证。尽管样品中存在来自其他与肌纤维相关的卫星细胞和内皮细胞的染色质，但利用本方案制备的染色质所检测到的结合事件主要来源于肌纤维内的细胞核。因此，该方案特别适用于研究小鼠成年骨骼肌中的基因调控。

引言

染色质免疫沉淀（ChIP）联合定量聚合酶链式反应（qPCR）和高通量测序（ChIP-seq）已成为研究多种组织和细胞类型中基因表达转录调控及表观遗传调控的首选方法¹。该技术可实现对全基因组范围内共价染色质修饰、组蛋白变体占据情况以及转录因子结合位点的系统性分析^2,3。

尽管从培养细胞中进行染色质免疫沉淀（ChIP）已有成熟方法，但从哺乳动物组织中进行ChIP仍更具挑战性。为ChIP制备染色质涉及多个关键步骤，这些步骤需要针对每种组织和细胞类型进行优化。染色质可从培养细胞的细胞裂解物中制备，也可在纯化其细胞核后进行制备。对于哺乳动物组织而言，高效的裂解、甲醛固定以及细胞核的纯化至关重要，以确保染色质的最佳回收率。此外，是否在细胞核纯化前或纯化后进行固定，需通过实验确定。尽管存在这些困难，ChIP已成功应用于肝脏、睾丸或脑组织^4,5,6。对于骨骼肌而言，由于该组织物理抗性强且富含结构蛋白，其破坏及细胞核的分离尤为困难。鉴于这一特殊性，为其他组织优化的实验方案在骨骼肌中往往无法获得满意结果。

本文介绍一种从小鼠骨骼肌组织中分离出适用于染色质免疫沉淀（ChIP）的染色质的实验方案，该方法包括对组织进行物理破碎、甲醛固定，随后分离细胞核并进行超声处理。通过针对多种转录因子、RNA聚合酶II以及共价组蛋白修饰开展ChIP-qPCR和ChIP-seq实验，验证了该方法制备适用于ChIP的染色质的高效性⁷。

与先前报道的方案相比，该新技术的速度显著提高⁸，此前的方法包含长时间的胶原酶消化步骤，在此期间，转录因子的基因组定位变化以及基因表达的改变可能发生。本方法能够快速分离并固定细胞核，因而特别适用于制备更真实反映天然基因组占据状态的染色质。此外，尽管已有其他用于从肌肉组织中分离染色质或提取蛋白质的方法被报道^8,9,10，并用于特定基因的ChIP-qPCR实验，但尚未有使用这些方法获得的ChIP-seq数据被报道。本文所述方法适用于转录因子和组蛋白修饰的ChIP-seq，因此也应适用于3/4C或HiC染色质构象捕获应用。

方案

小鼠的饲养遵循机构关于实验动物护理和使用的指导原则，同时符合国家动物护理指南（欧洲委员会指令86/609/CEE；法国法令第87-848号）。所有操作程序均经法国国家伦理委员会批准。

1. 肌肉组织的分离

1. 通过颈椎脱位法处死一只6至8周龄的成年小鼠。用70%乙醇冲洗肢体进行消毒，使用尖头剪刀和镊子解剖后肢肌肉（腓肠肌、胫骨前肌、股四头肌）。
   注意：一只小鼠应可获得约500 mg组织。
2. 在含有1 mL冰冻低渗缓冲液的2 mL试管中，用尖头剪刀将肌肉剪切成均匀的小块（<2–3 mm³），然后将试管置于4 °C的台式振荡器上摇动5–10分钟。

2. 组织裂解

注意：所有缓冲液配方请参见表1。

1. 将匀浆转移至一个14 mL圆底管中，并用5 mL冰冷的低渗缓冲液（不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物和PMSF）重悬。
   1. 使用松散配合的Dounce匀浆器（在3分钟内研磨20–30次）或机械组织匀浆器，在14 mL圆底管中对剪碎的肌肉组织进行匀浆处理，持续15–30秒。
      注意：此时可通过光学显微镜评估裂解效率，如有需要，可进一步进行破碎处理。
2. 将匀浆液转移至15 mL离心管中，并用冰冷的低渗缓冲液定容至10 mL。在继续处理下一只小鼠之前，按以下方法对匀浆液进行固定。

3. 固定

1. 加入甲醛至终浓度为1%，在室温下振荡10分钟。
2. 每管中加入甘氨酸至终浓度为0.125 M，以终止固定，在室温下振荡 5 - 10分钟。

4. 细胞核制备

注意：所有缓冲液成分请参见表1。

1. 使用松散的玻璃匀浆器（5 - 10 次 strokes）均质化固定后的裂解液。
   1. 转移至 15 mL 离心管中，在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟，以收集细胞核和细胞碎片。
2. 弃去上清液，将沉淀重悬于 5 mL 新鲜的低渗缓冲液中。将裂解液通过 70 µm 细胞滤网过滤至 50 mL 管中，再将滤液通过 40 µm 细胞滤网进行二次过滤。
3. 将滤液转移至 15 mL 离心管中，在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟，获得细胞核沉淀。
   注意：此时可立即进行超声处理，或将沉淀在液氮中速冻成干粉后于 -80 °C 保存。

5. 超声处理

1. 评估细胞核沉淀的体积（机械法和Dounce匀浆法均约为50 µL），加入相当于细胞核压实体积3至4倍的超声缓冲液重悬，然后在4 °C条件下使用超声破碎仪超声处理10 - 15分钟。
   注意：染色质可立即按以下步骤（6）进行分析，也可冷冻后于-80 °C保存。

6. 超声处理后评估染色质片段大小

注意：所有缓冲液成分请参见表1。

1. 为解除交联，取30 µL染色质置于1.5 mL离心管中，加入20 µL 5 M NaCl，加水至终体积为500 µL，65 °C过夜孵育。
   1. 次日，加入1 µL蛋白酶K（20 mg/mL储存液）、10 µL 2 M Tris（pH 6.8）和10 µL 0.5 M EDTA，在42 °C处理1小时。进行苯酚-氯仿/氯仿抽提，并加入1体积乙酸钠（3 M）和2体积100%乙醇，在-80 °C放置1小时或-20 °C过夜沉淀DNA。
2. 在13,500 × g离心15分钟以沉淀DNA。弃去上清液，用预冷的70%乙醇充分洗涤沉淀，再离心5分钟。弃去上清液，将沉淀在空气中干燥。
3. 将沉淀重悬于原始体积（30 µL）的TE缓冲液中。使用分光光度计通过260 nm/280 nm吸光度测定DNA浓度。取500–1,000 ng DNA与DNA分子量标记物分别上样至1.5%琼脂糖凝胶的不同泳道，进行电泳以评估染色质片段大小。
   注意：片段大小应在200–500碱基对之间，不应检测到对应于未充分剪切或剪切不完全DNA的高分子量片段。如有需要，可对染色质溶液（步骤5）进行更长时间的超声处理，然后按上述方法重新分析，直至获得最佳片段大小。

7. 染色质免疫沉淀（ChIP）

注意：所有缓冲液成分请参见表1。

1. 用1 mL含乙醇的50% Protein G Sepharose珠悬液分装至离心管中，于台式离心机中400 × g离心1分钟，沉淀珠子；弃上清，加入1 mL TE缓冲液重悬，400 × g离心后弃上清，重复洗涤一次。
   1. 第二次离心后，加入含有25 µL BSA（储存液20 mg/mL）和20 µL酵母tRNA（储存液10 mg/mL）的1 mL ChIP稀释缓冲液重悬。将珠子在4 °C下旋转孵育（40 - 60 rpm）至少2小时以进行封闭，随后使用。
   2. 将50 µg染色质（步骤5）用ChIP稀释缓冲液稀释8至10倍。加入50 µL封闭的磁珠悬液，4°C下旋转孵育2 h（40–60 rpm）。在4°C下以400 × g离心，获得预清除的染色质，转移至新离心管中。
2. 进行免疫沉淀时，加入适量的一抗（例如，每10 µg染色质加入1-2 µg，并在4 °C下旋转孵育过夜。
   注意：抗体的最佳用量可参考供应商推荐，或通过使用不同量的抗体进行ChIP-qPCR实验，直至观察到最佳富集效果，从而经验确定。此外，根据所用抗体的亚型，蛋白G Sepharose可替换为蛋白A Sepharose。
3. 第二天加入封闭的磁珠，4 °C下旋转孵育1小时（40 - 60 rpm）。在400 × g离心20 - 30秒使磁珠沉淀，弃去上清液，开始ChIP洗涤步骤。
4. ChIP 洗涤：使用以下缓冲液进行洗涤，顺序为：低盐缓冲液洗涤一次，高盐缓冲液洗涤两次，LiCl 缓冲液洗涤两次，最后用 TE 缓冲液洗涤两次。
   1. 每次洗涤在 4 °C 下旋转（40 - 60 rpm）10 分钟，然后在台式离心机中以 400 × g 离心 20 - 30 秒，使磁珠沉淀，每次洗涤之间均需完成此步骤。
5. 洗脱时，去除最后一次洗涤液，将磁珠重悬于250 µL新鲜配制的洗脱缓冲液中，室温振荡孵育15分钟。
6. 在400 × g离心，将洗脱液收集至新离心管中。重复此步骤两次，然后加入20 µL 5 M NaCl和1 µL RNase A（10 mg/mL），过夜解交联，接着按步骤6进行蛋白酶K处理，以及苯酚-氯仿/氯仿抽提。
7. 用50 µL TE缓冲液重悬，按标准方案取等分试样用于ChIP-qPCR¹⁵ 以检测 ChIP 的质量。

结果

为分离细胞核，我们对已解剖并切碎的肌肉组织进行机械匀浆处理，匀浆时间分别为15秒或45秒，转速为18,000和22,000 rpm（见材料表）。在所有条件下，细胞核均可与组织碎片分离，但使用较低转速时得率最佳（图1A-B）。细胞核也可通过Dounce匀浆器处理3至5分钟制备（图1A，数据未显示），但机械匀浆是首选方法，因其可在短短15秒内获得最佳细胞核得率，尤其在需要处理多个样本时可显著节省时间（图1B）。采用本方案，从500 mg组织（相当于1只小鼠的组织量）最多可分离出2.7 × 10⁷个细胞核，用于制备100 µg染色质。

为了优化固定细胞核的染色质片段化，我们进行了5至20分钟的超声处理。在该设备设置下（见材料表），10分钟的超声处理最为理想，可获得平均片段大小为250 bp的染色质（图2）。此步骤应根据所使用的超声仪类型进行实验优化。

为了评估上述方案所制备的肌肉染色质质量，针对转录因子、组蛋白修饰或RNA聚合酶II（Pol II）开展了ChIP-qPCR和ChIP-seq实验。在有或无地塞米松（Dex）处理的情况下，对糖皮质激素受体（GR）进行ChIP-qPCR，结果显示在已知受Dex和GR调控的Redd1和Murf1基因的调控元件处，Dex依赖性的GR富集显著增强¹¹，而在作为阴性对照的睾丸特异性Prm1启动子区域则未检测到信号（图3A）。

针对组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（H3K27ac）的染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）显示，在肌纤维中具有活性的Desmin（Des）启动子区域存在显著富集，而相对于基因间区的阴性对照区域则无此现象（图3B）。H3K27ac的ChIP-seq分析显示，Des基因座整个区域均具有高水平的该修饰信号，这是受“超级增强子”调控的组织特异性身份基因的典型特征¹²（图4A）。类似地，RNA聚合酶II（Pol II）的ChIP-seq分析也显示该基因座存在高水平的转录活性Pol II信号。

转录因子 Tead4 的染色质免疫沉淀定量 PCR，该因子在成肌分化中发挥重要作用^13,7，揭示了其在先前描述的结合位点上的富集情况 Ccnd1 和 Ifrd1 基因图3C）。重要的是，使用在肌纤维中特异性失活 Tead4 的小鼠所制备的染色质进行实验时，富集程度降低Tead4^skm-/-)⁷ (图3C）。对Tead1和Tead4的ChIP-seq数据进行分析，结果显示两者均可结合于启动子区域的一个位点 Kdm5a 使用野生型肌肉的染色质时可检测到该基因的信号，而使用Tead4突变肌肉的染色质时，Tead4信号消失，但Tead1、H3K27ac或Pol II信号未消失 Tead4^skm-/- 小鼠（图4B）。类似地，Tead1 和 Tead4 结合并作用于下游的一个调控元件 Adssl1 基因在野生型肌肉的染色质中可见，而使用突变型染色质时，Tead4 结合则选择性丧失 Tead4^skm-/- 肌肉（图4C这些观察结果表明，ChIP-seq 数据中检测到的 Tead4 信号来源于肌纤维中的结合。

为了确定与肌纤维相关的其他细胞类型对ChIP-seq结果的贡献，我们检测了在肌肉卫星细胞中活跃的Vcam1基因以及作为肌肉内血管内皮细胞标志物的Pecam1基因处的H3K27ac和Pol II信号。与在Des或Adssl1基因处观察到的高水平信号相比，Vcam1和Pecam1基因处的H3K27ac和Pol II信号水平显著更低（图4A和图4C）。肌纤维表达基因的信号水平与在相关组织中表达的基因之间存在显著差异，表明使用上述方案制备的染色质进行ChIP所检测到的信号主要来源于肌纤维内的结合事件。

图 1：从小鼠成年肌肉组织中纯化细胞核。 (A) 通过机械匀浆（18,000 rpm，45 秒）和Dounce匀浆（30次冲打/3分钟）获得的组织裂解物用台盼蓝染色后，在数字显微镜下观察，并以20倍放大倍数拍摄图像。比例尺 = 100 µm。 (B) 从500 mg组织（相当于1只小鼠）中，在指定条件下制备后获得的细胞核数量，条件包括机械匀浆15秒或45秒（18,000和22,000 rpm）以及Dounce匀浆3分钟。误差线表示均值 ± 标准误（S.E.M.），机械匀浆组n = 3只小鼠，Dounce匀浆组n = 3只小鼠。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：染色质片段大小的验证。 按图示对分离的细胞核进行超声处理，时间分别为5、10、15或20分钟。经去交联和纯化后，在溴化乙锭存在下通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小。M为DNA大小标记物。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：染色质用于 ChIP-qPCR 分析。 (A) 小鼠接受腹腔注射溶剂或地塞米松（10 mg/kg），1.5 小时后从小腿肌肉中提取染色质。在 GR 靶基因 Redd1 和 Murf1 处的 ChIP 富集程度以沉淀输入量的百分比表示，并与阴性对照鱼精蛋白启动子（Prm1）进行比较。 (B) 使用 H3K27ac 和 IgG 对照抗体进行 ChIP 实验，检测结蛋白（Desmin）启动子区域，并与基因间阴性对照区域进行比较。 (C) 在野生型小鼠和骨骼肌特异性 Tead4 敲除小鼠（Tead4^skm-/-）的肌肉染色质上进行 Tead4 ChIP 实验，检测 Ccnd1 和 Ifrd1 启动子区域的 Tead4 结合位点，并与对照基因间区域进行比较。所有实验中，每组使用来自 3 只小鼠的染色质样本混合，误差线表示三次技术重复的均值 ± 标准误（Student's T 检验）。P 值 <0.001**，<0.0001 ***；NS，无显著性差异。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：肌纤维染色质的基因组特征。 (A) 来自加州大学圣克鲁兹分校基因组浏览器的指定基因座截图，显示在肌纤维中高表达的 Desmin 基因处 H3K27ac 和 Pol II 水平显著高于分别在卫星细胞和内皮细胞中表达的 Vcam1 和 Pecam1 基因。 (B) 指定基因座的 UCSC 截图，显示在野生型 (WT) 肌肉染色质中 Tead1 和 Tead4 以及 H3K27ac 和 Pol II 的结合情况，与 Tead4^skm-/- (MT) 肌肉相比，后者中观察到 Tead4 结合的选择性丢失。所示的 ChIP-seq 数据可在 GEO 数据库中以编号 GSE82193 获取。 请点击此处查看该图的放大版本。

缓冲液名称	成分
低渗缓冲液	10 mM HEPES-KOH (pH 7.3)
	10 mM KCl
	5 mM MgCl2
	0.1% NP-40
	0.1 mM PMSF（现配）
	蛋白酶抑制剂混合物（PIC）1×（现配）
超声缓冲液	1% SDS
	10 mM EDTA
	20 mM Tris-HCl pH 8
	150 mM NaCl
	0.1% 脱氧胆酸钠
	1% Triton X-100
	现配加入 0.1 mM PMSF
	PIC 1×
ChIP 稀释缓冲液	0.01% SDS
	1.1% Triton X-100
	1.2 mM EDTA
	16.7 mM Tris HCl pH 8
	167 mM NaCl
	现配加入 0.1 mM PMSF
	PIC 1×
低盐缓冲液	0.1% SDS
	1% Triton X-100
	500 mM EDTA
	20 mM Tris HCl pH 8
	150 mM NaCl
高盐缓冲液	0.1% SDS
	1% Triton X-100
	500 mM EDTA
	20 mM Tris HCl pH 8
	500 mM NaCl
LiCl 缓冲液	250 mM LiCl
	1% NP-40
	1 mM EDTA
	10 mM Tris HCl pH 8
洗脱缓冲液	1% SDS
	100 mM NaHCO3
Tris-EDTA (TE) 缓冲液	50 mM Tris HCl pH 8
	1 mM EDTA

表1：缓冲液组成。

讨论

本文介绍了一种从成年小鼠骨骼肌制备染色质的新方案，并证明该染色质适用于染色质免疫沉淀（ChIP）实验，可检测肌纤维细胞核中转录因子的结合以及组蛋白的共价修饰。该方案包含多个关键步骤。第一步是组织破碎，可通过Dounce匀浆器或机械剪切实现。机械剪切速度更快且可重复性更高，因此是首选方法。然而，若缺乏合适的设备，也可采用Dounce匀浆法，此时建议在进入固定步骤前，在显微镜下评估裂解效率。我们采用对完整组织裂解物进行固定，而非对分离的细胞核进行固定，这使得在较小体积和较短时间内进行超声处理更具可重复性。此外，我们选择在组织破碎后对裂解物进行固定，而不是如Thomas et al.¹⁰所述在破碎前对组织进行预固定，因为预固定会导致匀浆效率降低。基于机械剪切的本方案也比其他已提出的方法（如胶原酶消化）更快，后者需要将分离的组织在37 °C下长时间孵育⁸。在此期间可能发生基因表达和转录因子结合状态的改变。因此，尽快固定细胞核对于更真实地捕获正常的生理状态至关重要。

第二个关键步骤是从固定的裂解液中纯化细胞核。为此，需将固定后的裂解液依次通过70 µm细胞滤网以去除较大碎片，再通过40 µm细胞滤网以清除细小碎片，从而避免滤网堵塞并最大化获得的细胞核产量。经滤网纯化后，对细胞核进行超声处理，并在解除交联后测定DNA片段大小。通常从小鼠两只后肢组织制备的样品可获得约100 µg染色质。将最多3只小鼠的裂解液合并可减少制备过程中的损失，从而提高产量。该方法效率较高，可回收高达75%的基因组DNA作为染色质（数据未显示）。

旨在评估转录因子结合和表观遗传修饰的ChIP实验表明，该方案适用于研究肌纤维核中的基因调控。从染色质中获得了强而稳定的Pol II和H3K27ac的ChIP-seq信号，从而能够通过其特有的H3K27ac和Pol II图谱鉴定肌纤维身份相关基因⁷。与卫星细胞或内皮细胞中表达的基因相比，肌纤维核中高表达基因上的H3K27ac和Pol II水平显著更高，表明信号主要来源于肌纤维核。这一点也通过使用在肌纤维中特异性失活Tead4的小鼠来源的染色质进行ChIP实验时Tead4信号的消失而得到证实。然而，仍可检测到弱但明显高于背景水平的卫星细胞标志物信号，例如Vcam1、Pax7（数据未显示），表明这些细胞的染色质也存在。 我们预计，本方案应适用于其他使用甲醛固定的染色质的技术，如3C/4C和HiC染色质构象捕获技术。未来，结合使用本方案进行转录因子和染色质修饰的ChIP-seq分析与染色质构象捕获技术，将有助于深入理解肌纤维中基因调控机制，以及这些机制如何受到生理刺激（如运动、禁食、高脂饮食、去神经支配）或疾病状态的影响，特别是利用模拟X连锁中心核肌病等疾病的基因修饰小鼠所提取的染色质开展相关研究¹⁴。

总之，这种低成本且省时的实验方案可用于分离肌纤维细胞核，分离后的细胞核可立即进行超声处理，或在 -80 °C 冻存以供后续使用。采用本方案制备的染色质已获得了来自肌纤维的首个全基因组范围的 ChIP-seq 数据⁷，并将促进未来对该组织中基因调控的研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
T 25 数字型 ULTRA-TURRAX	T 18 ULTRA-TURRAX	0009022800
PMSF	SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL	P7626-25G
蛋白酶抑制剂混合物（无EDTA）	Roche Diagnostics	11873580001
Protein G Sepharose 微珠	SIGMA-ALDRICH CHIMIE	P-3296
蛋白酶K	SIGMA-ALDRICH CHIMIE	P-2308
70 μm 细胞筛	Corning BV	431751
40 μm 细胞筛	Corning BV	352340
电子显微镜级甲醛	Euromedex	15710-S
RNase A	Fischer Scientific	12091039
苯酚:氯仿:异戊醇 25:24:1	SIGMA-ALDRICH CHIMIE	P3803
BSA	SIGMA-ALDRICH CHIMIE	B4287-25G
酵母tRNA	SIGMA-ALDRICH CHIMIE	R5636
蓝色糖原	AMIBION	AM9516
Pol II ChIP 抗体	Santa Cruz	SC-9001
H3K27ac ChIP 抗体	Active Motif	39133
Tead4 ChIP 抗体	Aviva Systems Biology	(ARP38276_P050)
IGEPAL	SIGMA-ALDRICH CHIMIE	I-3021
E220 聚焦式超声破碎仪	Covaris E220
名称	公司	目录编号	备注
其他物品
剪刀
松配合Dounce匀浆器
15 ml 和 50 ml 离心管
14 ml 圆底管
1.5 ml 和 2 ml Eppendorf 管
70 μm 和 40 μm 细胞筛（Corning）