本方案首先描述永久性植入膀胱导管并结合外部尿道括约肌电极的手术步骤，其次描述在已植入导管的清醒动物中测量膀胱及外部尿道括约肌功能的方法。
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本文内容
摘要
摘要
下尿路功能的评估主要通过啮齿类动物的膀胱测压功能分析进行。传统的膀胱测压通常在尿烷麻醉下作为终末性分析进行。众所周知，麻醉药物会影响膀胱功能。因此，本技术的目的是在轻度束缚的清醒大鼠中进行膀胱和尿道外括约肌的膀胱测压测量。为此，将一根膀胱导管植入膀胱顶部。随后，在尿道外括约肌两侧植入两根电极，并将接地电极缝合至无反应性的骨骼肌上。膀胱导管和三根电极最终经皮下隧道引至颈部区域，并固定于背带装置上。利用该技术，可在同一只动物身上多个时间点重复测量下尿路功能，以评估其下尿路功能状态。该技术的主要应用是在清醒的健康大鼠中，以及在疾病或损伤诱导后，对膀胱和尿道外括约肌功能进行同步随访观察。此外，还可用于在疾病/损伤评估过程中进行后续的下尿路功能监测，并用于治疗效果的评估。
引言
为了分析尿液储存和排尿功能及其功能障碍，大多数研究采用了啮齿类动物模型。排尿是通过反射的顺序激活而产生的，这些反射的协调对于有效排尿至关重要1。膀胱压力测定记录技术为在神经调控下分析膀胱功能提供了有价值的工具1。
大鼠的传统膀胱测压大多在麻醉状态下进行，通常使用乌拉坦2，且仅作为终末的单次分析，主要关注膀胱本身。然而，在某些病理状态下，例如神经源性下尿路功能障碍（NLUTD），不仅膀胱功能异常，膀胱出口即尿道外括约肌也存在功能障碍3,4。如果仅通过单次膀胱测压检查膀胱，将难以对NLUTD进行有效的随访评估。为了获得可与人类研究相比较的可靠结果，准确测量膀胱与尿道外括约肌的功能及其相互作用至关重要2。此外，必须在清醒大鼠中进行功能分析，因为麻醉极有可能改变膀胱功能2,5,6。在清醒动物中获得良好的膀胱测压记录，是识别膀胱正常功能与功能障碍的基础7。
所使用的动物膀胱测压站（例如，Catamount 膀胱测压站（CCS））是一种用于在清醒的小动物中进行膀胱测压分析的装置8。通过永久性膀胱导管和植入的体表尿道括约肌电极，可在较长时间内重复进行测量2。因此，CCS 为啮齿类动物模型中的非神经源性及神经源性下尿路功能障碍（NLUTD）评估提供了有价值的工具，尤其适用于在短期或中期随访过程中病理机制可能发生改变的情况。此外，该方法通过使用固定装置对清醒大鼠进行膀胱测量，实现了伪影较少的膀胱测压分析。
本文介绍了在清醒大鼠中永久植入膀胱导管和尿道外括约肌电极的手术方法，以及进行膀胱测压的测量技术。
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方案
本文所述所有实验程序均经奥地利政府动物研究伦理委员会（Bundesministerium für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft, WF / V /3b）批准，并符合实验室动物护理与使用协会（Association for Assessment of Laboratory Animal Care）关于动物使用的指南。本实验所用大鼠为12周龄雌性Lewis大鼠。整个实验过程中均需使用无菌器械。
1. 材料准备
- 导管的制备
- 根据动物体型，将导管（聚乙烯管 PE-50）剪成适当长度（20 至 25 cm）。
注意：预留额外长度，以便穿引和操作。 - 用打火机将一端加热扩口，形成圆滑的末端。检查导管末端是否已形成合适开口且端部钝化。
- 将一段2 mm长的硅胶管套在导管上，使其刚好位于扩口端下方。
- 根据动物体型，将导管（聚乙烯管 PE-50）剪成适当长度（20 至 25 cm）。
- 电极的制备
- 准备一根20–25 cm长的聚四氟乙烯涂层钢丝（长度根据动物体型适当调整）。
- 准备一段2 cm长的银丝，将其末端拧绞，留出一个小环。在一端去除2 mm的聚四氟乙烯绝缘层。将拧绞后的银丝末端焊接到去除了绝缘层的钢丝上。
- 在焊接区域涂上普通指甲油。在涂层区域套上一段4 mm长的聚乙烯管，并用加热的压钳封口。
2. 动物准备
- 麻醉
- 使用经机构批准的适用于全身麻醉的适当麻醉混合剂。
- 配制麻醉混合剂，包含美托咪定（0.15 mg/kg）、咪达唑仑（0.08 mg/kg）和芬太尼（0.01 mg/kg），使用1 mL注射器配合27号针头进行肌肉注射。
- 手术准备
- 使用电动剃刀剃除腹部毛发，范围包括生殖区及肩胛水平的背部区域。
- 先用70%乙醇对腹部和颈部区域进行消毒，随后使用聚维酮碘溶液交替擦洗3次。
3. 膀胱导管植入
- 使用手术刀切开皮肤，手术剪剪开腹肌，于第三和第四乳头水平处行低位正中切口（长度约2至2.5 cm）。
- 将腹壁向头尾方向牵拉以暴露膀胱，并将镊子背部置于膀胱后方固定其位置，防止移位。
- 使用带圆锥尖针头的6-0不可吸收单股缝线，在膀胱顶部行荷包缝合。
- 在荷包缝合线内用手术刀尖或18G针头切开膀胱顶部，以便插入膀胱导管（参见方案步骤1）。
- 将预先充满无菌生理盐水（0.9%氯化钠溶液）的导管插入膀胱，并小心回拉导管，直至导管扩大的开口端恰好位于膀胱顶部下方。
- 收紧荷包缝线固定导管，并在导管体部再缝一固定结扎线以加强固定。
- 通过导管缓慢注入无菌生理盐水（0.9%氯化钠溶液）充盈膀胱，检查膀胱顶部是否有渗漏。
4. 尿道括约肌电极植入
- 准备三个用于植入的电极（参见方案步骤1）。
- 使用彩色永久性记号笔标记其中一个电极，以便后续识别未来的无效电极。用70%乙醇对电极进行消毒。
注意：导管不适用于高温和化学灭菌程序。应采用冷灭菌法对电极进行24小时灭菌。 - 使用手术剪刀将腹部切口向耻骨方向延长，直至耻骨联合，但不要切断耻骨联合。
- 识别尿道，并使用精细镊子在尿道两侧钝性分离出 pockets，注意避免损伤血管或神经。
- 在此操作区域内，寻找靠近尿道的合适脂肪囊。
- 使用6-0不可吸收单股缝线将电极双侧固定于相应的脂肪囊上。
注意：电极的最终位置应位于尿道中段区域的双侧。 - 用6-0不可吸收单股缝线将两个电极绑在一起。
- 将标记的无效电极缝合固定于靠近尿道的腹壁肌肉上。用单根缝线将三个电极绑扎固定在一起。
5. 隧道效应
- 在肩胛骨之间做一个小的皮肤切口，用于穿线。
- 将电极导线穿过皮下至颈部，并检查其最终位置是否正确；穿线后确认电极的位置。
- 将膀胱导管穿至肩胛骨水平——穿线过程中需注意膀胱，避免其扭转；为此，可在导管即将进入膀胱顶部时用手固定导管，以防止膀胱扭转。
- 使用4-0多股可吸收缝线连续或间断缝合腹肌；皮肤切口采用间断褥式缝合关闭。
- 将动物充分拉伸至最大长度，使电极导线和导管达到最大程度的伸展。
- 用埋入式缝线将导管和电极导线固定于肩部肌肉上。
- 使用4-0缝线单针缝合关闭皮肤。
6. 安装接头
- 将背带从动物头部套入，并将前肢拉至两条硅胶带之间的末端位置，完成背带装配。在手术前，应根据动物体重向供应商确认背带尺寸是否合适。
- 将膀胱导管经皮下穿至背带中央孔，电极导线则通过钻头制备的定制孔道穿出，孔径需与电极导线尺寸相匹配。
- 通过牵拉硅胶带来调整背带松紧度，确保背带不过于松弛，同时保留适当空间，以维持大鼠的活动能力。
- 使用扎带固定硅胶带。
- 将膀胱导管剪裁至背带上方3 cm处，连接至23-G堵头，最后将其固定于背带上。
7. 电极连接器的制造
- 准备三个小型热缩管（用不同颜色区分零电极），并准备另外两个尺寸合适的较大热缩管。
- 将电极导线剪至合适长度，确保后续能顺利插入母插头且不会过松或过短。剥除三根导线的聚四氟乙烯绝缘层（约 2 mm），并将裸露的钢丝拧成一股。
- 将较大的热缩管套在所有导线上，再分别为三根导线单独套上小热缩管，并用特定颜色的热缩管标识零电极。
- 将电极焊接到三芯公插头上，将零电极置于中间位置，并在焊接区域上方分别热缩三个小热缩管。
- 在三个小热缩管末端处收缩第一个大热缩管，再将最后一个大热缩管收缩固定在公插头边缘。
- 将公插头连接至固定在背带上的母连接器，并用一段胶带加固以确保安全。
8. 术后护理
- 清洁手术区域，并使用聚维酮碘进行消毒。
- 将动物置于加热垫上直至苏醒，并根据当地动物护理指南，在术中和术后给予0.9%氯化钠溶液以补充水分。
- 皮下注射镇痛药（美洛昔康 1 mg/kg）和抗生素（磺胺多辛 200 mg，甲氧苄啶 40 mg，15 mg/kg）的混合注射液。每日两次给予镇痛药（早晚各一次），每日一次给予抗生素，连续五天。
- 在随后的整个随访期间，以相同剂量继续使用抗生素，每周注射两至三次。
- 每日检查背心是否合适，并检查手术区域，特别是颈部区域。若背心过紧，可小心牵拉硅胶带进行调整。
- 每周定期冲洗导管一次，以防止堵塞。
9. 膀胱压力测定测量的准备工作
- 术后第六天进行首次膀胱测压测量。
注意：过早测量可能受到镇痛药物和/或导管植入引起的尿路上皮刺激的影响。 - 打开主电源开关、计算机和肌电图放大器。
- 用室温加热的0.9%氯化钠溶液填充注射泵。从泵端开始，按自上而下的顺序依次打开三通接头，并冲洗管路。
注意：仔细检查是否有残留气泡，因为气泡会影响膀胱测压测量结果。
10. 校准
- 启动尿流率计软件程序，进入校准界面。
- 关闭通向泵和动物的三通连接器。
- 打开与压力计相连的阀门，并在程序中点击“归零”按钮。
- 调节压力计压力至 100 mmHg，在程序中按下 100 mmHg 按钮，然后按“确认”以保存校准设置。窗口将自动关闭。
- 关闭通向压力计的阀门，打开从泵通向动物的三通连接器，准备进行测量。
11. 动物数据库（Animal DB）
- 为了登记动物，请为该动物分配一个简洁的编号。
- 输入更多信息，例如脊髓损伤日期、治疗开始时间、导管植入日期、实验分组以及动物出生日期。
- 要最终记录数据，请点击 "store record" 并保存至文件。
12. 录制前的测量设置
- 通过按下启动按钮来启动软件程序。
- 选择动物，然后按下去皮重按钮并归零压力。
注意：将动物放入固定装置时需格外小心，确保没有电缆被卡住，否则可能导致肌电图（EMG）电缆的导线脱落。
13. 动物准备
- 移除导管塞，并将肌电图插头从背心上断开。
- 将大鼠放入固定器中。关闭固定器，并用夹子锁紧背心。
- 将导管和肌电图插头从固定器中引出。
- 将固定器置于猫眼仪（catamount unit）中。将尾巴穿过管道，并用胶带固定管道以避免移动。
- 将雄性肌电图插头连接到记录用的雌性肌电图连接器上。
- 再次按下零压按钮，然后将导管连接到灌注/记录管上。在软件中检查压力。
注意：基线压力应为正值，约 5–10 cm H2O。如果压力为负值，应将导管与套管断开，按下零压按钮，然后重新连接导管。
14. 记录
- 如果导管和肌电图电缆已连接，请按下“运行泵”和“记录”按钮。
- 根据实验需求调整填充速度，单位为 μL/min。
- 在记录本中注明记录开始的时间和室温。
- 要停止膀胱测压记录，请先按下“运行泵”按钮停止泵，然后再次按下“记录”按钮。
注意：泵将关闭，泵上的绿色指示灯也会熄灭。 - 断开导管连接，并使用23G堵头塞住导管末端。断开肌电图电缆连接。
- 打开固定器前部，引导大鼠离开固定器。
注意：操作大鼠时应小心谨慎，并注意观察导线，避免电缆缠绕。 - 将导管重新插入背心装置中。将肌电图插头重新插入背心装置，并用胶带缠绕插头固定。
注意：如果动物存在病理性下尿路疾病，应在实验结束时手动排空膀胱，以避免膀胱过度扩张。 - 将动物放回其原有饲养笼中。
- 通过按下“退出”按钮关闭程序。
- 清洁固定器和烧杯。
- 关闭三通接头至泵和动物出口的通路。
- 通过主开关关闭计算机、肌电图单元和整个系统。
注意：数据保存在名为 "Logged data" 的独立文件夹中，子文件夹以被测大鼠的编号命名。单次记录按日期分类存放在对应大鼠编号的文件夹内。
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结果
显示清醒状态下膀胱压力测定过程的示意图如下所示 图1 膀胱导管植入的内部解剖结构如图所示 图2手术大约需要2小时。术后镇痛和抗生素治疗按照方案所述，可覆盖术后5天内的疼痛和感染预防。此后未观察到任何疼痛迹象。每日需对腹部、腹部缝线及颈部缝线进行两次仔细检查，以确保动物健康。术后前5天应每日检查背心情况（位置与松紧度），之后需定期检查。腹部缝线可在术后第10天拆除th 术后第几天
术后前10天使用柔软的非木质垫料，以避免发生炎症。垫料每周至少更换两次，以进一步降低炎症风险。动物采用单只饲养，因为群养会增加同笼动物咬伤套管、导管或电极线的风险。
导管应每周至少冲洗一次，可在进行尿动力学测量时进行，...
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讨论
本方案描述了在清醒、轻度束缚的大鼠中进行永久性导管和尿道括约肌电极植入的手术步骤，以及膀胱压力测定记录技术，包括对膀胱和外尿道括约肌的同步分析。
手术过程中的关键步骤包括仔细植入膀胱导管，避免漏液和过度操作。此外，将电极精确地双侧植入尿道外括约肌周围，对于准确测量尿道外括约肌功能至关重要。植入后对术区进行仔细检查，对于维持动物健康同样必不可少。随访期间使用抗生素可有效预防导管相关感染以及尿路感染的发生。
在进行膀胱测压时，经过预先抓握适应的动物会比未经过处理的大鼠更为平静和放松，因此膀胱测压记录的结果可能会有所不同。此外，固定装置为大鼠提供了一个具有黑暗前端的封闭空间，使其感觉更舒适，从而降低应激水平。在其他已发表的清醒状态下膀胱测压研究中，大鼠可在测量笼内自由活动。然而，这种方法在测量过程中更容易产生伪迹，可能延长记录时间，并增加动物的应激程度。在健康大鼠中，理想的膀胱测压结果可在随访期间的多个时间点重复获得。在膀胱测压过程中，常见的问题包括导管扭曲或操作步骤未按顺序执行。如果出现技术或软件故障，强烈建议重新初始化膀胱测压系...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者没有需要致谢的内容。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚乙烯导管 PE 50 | Becton Dickinson | 427411 | 导管 |
| Prolene 6-0 (BV-1, 9.3 mm, 3/8c) | Ethicon | EH7403H | 缝合线 |
| 特氟龙涂层钢丝 | Cooner wire | AS631 | 电极材料 |
| 银丝 0.250 mm | World Precision Instruments | AGW1030 | 电极材料 |
| Rotilabo - PVC 管 | Carl Roth | 97241 | 固定装置 |
| Vicryl rapide 4-0 (P-3, 13 mm, 3/8c) | Ethicon | V4940H | 缝合线 |
| Quick Connect 单通道固定装置 | SAI Infusion Technologies | QCH-23CW | 固定装置 |
| 热缩管 | ChiliTec | 17894 | 电极焊接 |
| 焊锡丝 Pb60 Sn40 | Stannol | LD0029 | 电极焊接 |
| 助焊剂 157 | Castolin Eutectin | 157 0150 | 电极焊接 |
| Conn Unshrouded Header HDR 3 POS, 2.54mm Solder ST Thru-Hole Box | Preci-dip | 801-87-050-10-001101 | 电极焊接 |
| Conn Socket Strip SKT 50 POS 2.54mm, Solder ST Thru-Hole Box | Preci-dip | 890-18-003-10-001101 | 电极焊接 |
| 大鼠膀胱压力测定套装（包含泵、天平、压力传感器及膀胱压力分析硬件） | Catamount Research and Development Inc. | CAT-CYT-R | |
| 带主动前置放大器的差分放大器 | AD instruments | DP-311 | 肌电放大器 |
| 中号大鼠固定器（适用于 200–300 g 大鼠） | emka Technologies | HLD-RM | |
| Uro Dyn 软件 | Zürich of University | 基于 MTA | |
| 雌性大鼠（Lewis 品系），12 周龄 | Charles River, Sulzfeld, Germany | 实验动物 |
参考文献
- Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol Urodyn. 30, 636-646 (2011).
- Schneider, M. P., et al. A novel urodynamic model for lower urinary tract assessment in awake rats. BJU Int. 115, Suppl 6. 8-15 (2015).
- Cruz, C. D., Cruz, F. Spinal cord injury and bladder dysfunction: new ideas about an old problem. Scientific World Journal. 11, 214-234 (2011).
- de Groat, W. C., Yoshimura, N. Plasticity in reflex pathways to the lower urinary tract following spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 123-132 (2012).
- Matsuura, S., Downie, J. W. Effect of anesthetics on reflex micturition in the chronic cannula-implanted rat. Neurourol Urodyn. 19, 87-99 (2000).
- Cannon, T. W., Damaser, M. S. Effects of anesthesia on cystometry and leak point pressure of the female rat. Life Sci. 69, 1193-1202 (2001).
- Patra, P. B., Thorneloe, K. S. Enhanced sensitivity to afferent stimulation and impact of overactive bladder therapies in the conscious, spontaneously hypertensive rat. J Pharmacol Exp Ther. 338, 392-399 (2011).
- Herrera, G. M., Meredith, A. L. Diurnal variation in urodynamics of rat. PloS One. 5, e12298(2010).
- Chang, H. Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. Am J Physiol Renal Physiol. 295, F1248-F1253 (2008).
- Yaksh, T. L., Durant, P. A., Brent, C. R. Micturition in rats: a chronic model for study of bladder function and effect of anesthetics. Am J Physiol. 251, R1177-R1185 (1986).
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