本文介绍了一种分离完整小鼠乳腺组织以研究细胞外基质（ECM）表达及导管形态的实验方案。从小鼠第4对腹部乳腺中获取8至10周龄未产雌性小鼠的乳腺组织，经中性缓冲甲醛固定后进行切片，并采用免疫组织化学方法对细胞外基质蛋白进行染色。
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摘要
摘要
本实验的目的是采集雌性未产小鼠的第4对腹乳腺，以评估细胞外基质（ECM）的表达及导管结构。操作中使用梅奥剪刀在皮肤下方创建一个小腔隙，从而将皮下组织中的乳腺与下方的腹膜分离。借助3.5倍外科手术显微放大镜可更清晰地观察腺体。将皮张翻转并固定，以便识别完整的乳腺脂肪垫。使用解剖刀片在皮下层与腺体之间横向滑动，对每一对第4腹乳腺进行钝性解剖分离。采集后立即将其置于10%中性缓冲福尔马林溶液中，用于后续组织处理。完整切除整个腺体的优势在于，可最大程度避免遗漏导管上皮细胞与其他微环境细胞群体之间重要的组织层面相互作用，而这些信息在部分活检样本中可能被忽略。该方法的一个局限性在于使用固定组织的连续切片，这使得对导管形态发生和蛋白表达的分析仅限于腺体内的特定位置，因此难以获得导管结构和蛋白表达在三维（3D）空间中的变化情况。总体而言，该技术适用于需要完整小鼠乳腺组织进行下游研究的实验，例如发育过程中的导管形态发生或乳腺癌相关研究。
引言
乳腺癌的特征之一是存在显著程度的组织纤维化1,2,3,4。这种非细胞成分被称为细胞外基质（ECM），在所有组织中均以不同程度存在，主要由纤维性和非纤维性胶原蛋白、弹性蛋白、糖蛋白以及被隔离于该基质中的多种信号分子构成的复杂网状结构组成。在稳态条件下，ECM 的沉积与降解受到严格调控5。在乳腺肿瘤发生过程中，ECM 的沉积与降解平衡被打破。因此，已有报道指出乳腺肿瘤会大量表达多种 ECM 蛋白，如胶原蛋白、纤连蛋白和腱生蛋白-C 等6。这些蛋白质的异常表达，以及基质交联模式的增加，已被证实可促进乳腺肿瘤的进展、转移及治疗耐药性1,3,4,7,8,9。
为评估细胞外基质（ECM）成分和导管形态，需分离完整乳腺组织。本研究采用雌性未产、缺乏小窝蛋白-1（caveolin-1）的小鼠，该蛋白是一种跨膜蛋白，已被证实与侵袭性乳腺肿瘤特征相关10,11,12，同时使用雌性未产的B6对照小鼠。通过对这些组织进行组织学处理和染色，可鉴定多种细胞外基质蛋白，并对导管形态进行表征。
总体而言，分离完整乳腺组织使研究人员能够研究在外界或内在因素作用下组织层面的形态学或细胞变化。该技术的局限性在于其分析依赖于二维（2D）组织切片，而非三维（3D）视角，而后者能更全面地呈现导管树复杂形态的全貌。鉴于乳腺组织中细胞间及细胞与细胞外基质（ECM）间相互作用的复杂性，分离完整的乳腺组织对于高效分析小鼠乳腺不同区域的导管形态和蛋白质表达具有显著优势。
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方案
本方案中涉及动物实验的操作已通过费城骨科医学院机构动物护理和使用委员会的审查与批准，所有技术操作均在严格的伦理准则下进行。
1. 样品获取与处理
- 选择合适的动物实验对象并放入 CO2 麻醉室。本实验使用 8–10 周龄雌性未产 B6.Cg-Cav1tmMIs/J 和 C57BL/6J 小鼠。
- 开启气体流量至 30–40%。约 2 分钟后，当动物明显失去意识时，将气体阀门调至全压，再持续 5 分钟。
注意：在停止输送 CO2 后，需观察动物至少 10 分钟，通过可见呼吸迹象（例如胸部运动）确认其死亡。若动物仍有生命体征，可将其重新放回 CO2 麻醉室。也可采用颈椎脱位法处死，但不推荐，因为血液可能积聚于乳腺周围，干扰后续解剖及实验结果。 - 处死后，将尸体仰卧固定，并用 70% 乙醇充分浸润。
- 用镊子夹住耻骨上方的皮肤，用小型手术剪刀剪开一小口。旋转剪刀，沿腹侧中线从尾端向头端剪开皮肤。
- 使用较大的剪刀或止血钳，沿切口两侧钝性分离皮下筋膜，注意避免刺破腹膜。在切口两端的横向边缘处进行剪切。
- 将皮肤瓣固定张开，并再次喷洒 70% 乙醇。
注意：尽管使用 70% 乙醇有助于更清晰地区分腺体与周围皮下组织，但需注意避免因使用该溶液导致组织干燥。为防止干燥，应在不超过 4 分钟的时间内完成腺体分离。作为 70% 乙醇的替代方案，研究者也可使用通用隔离缓冲液（如 1× PBS）以避免组织脱水。 - 定位目标乳腺组织，将 #4 手术刀片沿皮肤瓣内侧滑动，将乳腺及其相关的皮下脂肪从真皮层完整切割分离。
注意：使用 3.5 倍外科手术放大镜有助于更清晰地观察腺体结构。 - 立即将新分离的腺体浸入含有 10:1（固定液:组织体积）的 10% 中性缓冲福尔马林溶液的锥形管中，固定 24–48 小时。
注意：根据研究目的，也可选用其他多种替代固定剂，如用于基因组研究的多聚甲醛、乙醇，或商业化的 RNA 保存缓冲液。 - 按照机构规定的流程进行石蜡包埋，或将样品送至外包服务商进行处理、包埋及切片/载玻片制备。组织切片厚度为 5 µm。
注意：由于腺体周围存在过量脂肪组织，建议在切片和染色前先去除 100–200 µm 的组织。
2. 组织染色
- 免疫组织化学
- 将待染色的切片置于58 ˚C的加热板上1小时，以熔化石蜡。
警告：熔化的石蜡可能会从载玻片上流下。需密切监控，或在载玻片下方放置吸水纸以收集流下的石蜡。
注意：此步骤并非必需，可选择跳过。如果结果未达预期，重新加入此步骤可能有助于改善结果。 - 将切片置于盛有100%二甲苯的切片架中，孵育30分钟，确保完全浸没；重复一次。
注意：此时应进行肉眼检查，以确保组织切片中无脂肪组织和石蜡残留。若仍可见脂肪组织或石蜡，应将玻片重新浸入二甲苯中。操作时需谨慎，尽量减少二甲苯暴露时间，以免引起组织收缩。 - 在含有100%乙醇的切片缸中复水组织，每次10分钟，重复一次。
- 将切片转移至含有95%乙醇的切片缸中，孵育10分钟。重复一次。
- 将载玻片移至含有75%乙醇的染色缸中，放置5分钟。
- 将载玻片转移至含有50%乙醇的玻片缸中，孵育5分钟。
- 将10 mM柠檬酸钠溶液（pH 6.0）在电热板或微波炉中煮沸，倒入考普林瓶中。
警告：加热溶液时需密切监控，注意防止暴沸。容器将变得非常烫，应使用防护措施以避免烫伤。 - 将切片缓慢放入考普林瓶中，确保完全浸没，于100 °C孵育10分钟以恢复表位。取出后小心干燥切片。
- 用疏水性标记笔在组织周围画出屏障。加入足量内源性酶阻断剂（过氧化氢和叠氮化钠，可商业获取），以覆盖组织，孵育10分钟。
- 将载玻片浸入1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，孵育10分钟。
- 加入足量的10%驴血清至1×PBS中以覆盖组织，在湿盒中室温孵育1小时。
注意：实验可在此处暂停，将载玻片置于湿润孵育盒中于 4 °C 过夜保存。尽管驴血清被发现可产生最佳染色效果，研究者也可尝试其他血清（如牛血清白蛋白（BSA）、山羊血清或马血清）以确定最佳条件。若使用 BSA，研究者应在使用前新鲜配制。 - 倾去切片上多余的封闭液，将用1%血清适当稀释的一抗直接加至切片上，确保组织被溶液均匀覆盖。在湿盒中室温孵育30分钟。
注意：此步骤可根据需要延长孵育时间，将湿盒置于 4 °C 保存。务必设置适当的阴性对照切片（例如 无一抗的切片，已知抗原阴性组织 等等。）在此步骤中。 - 小心地用约1 mL去离子水冲洗载玻片2O过组织，于1×PBS中孵育5分钟，期间更换一次PBS。
- 弃去多余的PBS，加入足量的辣根过氧化物酶标记物以覆盖组织，在湿盒中孵育30分钟。
注意：在此步骤中，研究者可选择使用荧光标记的二抗进行荧光染色。若需进行荧光染色，应相应调整下述步骤。 - 小心地用约1 mL去离子水冲洗载玻片2O过组织，用1×PBS更换一次，孵育5分钟。
- 按照制造商建议的比例配制二氨基联苯胺（DAB）显色液，并用涡旋振荡器混匀。
注意：除本方案所用试剂盒外，市面上还可购得多种即用型试剂盒。 - 从切片上倾去多余的缓冲液，直接向组织滴加2-3滴（10–50 µL）显色剂，于湿盒中孵育5分钟。用约1 mL去离子水轻轻冲洗切片2O 过组织。
警告：DAB显色剂具有高度毒性。避免染色剂与皮肤直接接触，并将废液收集至危险废物容器中。
- 将待染色的切片置于58 ˚C的加热板上1小时，以熔化石蜡。
- 苏木精和伊红（H&E)
- 染色剂孵育后的最后一次漂洗完成后，将切片浸入 Harris 苏木精液中 2-2.5 分钟。用自来水轻轻冲洗切片 1-2 分钟。
注意：避免将水流直接喷射到组织上。 - 将切片浸入分化液（100 mL 70%乙醇中含0.25 mL盐酸）中2-3秒。用自来水轻轻冲洗切片约1-2分钟。
- 将载玻片浸入蓝色试剂（100 mL 自来水中含 4.5 mg 碳酸钙，pH 调至 9.4）中 60 秒。用 95% 乙醇冲洗载玻片 30 秒。
- 将载玻片浸入醇溶伊红Y染液中染色2-3分钟。
- 在95%乙醇中更换两次，每次1分钟，对组织进行脱水。
- 在100%乙醇中脱水1次，每次1分钟。
- 用无绒布小心擦干载玻片。向载玻片滴加1滴（约100–200 µL）合成性、非水性、树脂基封片介质，然后加盖盖玻片。
注意：如果选择了不同的染色方法，可能需要使用不同的封片介质。例如，如果研究者选择了荧光标记的二抗，则更适合使用水溶性封片剂。 - 让载玻片在室温下静置过夜。
- 染色剂孵育后的最后一次漂洗完成后，将切片浸入 Harris 苏木精液中 2-2.5 分钟。用自来水轻轻冲洗切片 1-2 分钟。
- 苦味酸-天狼星红（PSR）染色
- 选择待染色的切片，并按照免疫组织化学实验方案进行至第6步（50%乙醇浸泡）。
- 将切片浸入PSR染液中染色1小时。
- 将载玻片浸入0.5%乙酸中1-2秒，重复两次以分化染色。
- 用95%乙醇分两次脱水，每次1分钟。
- 用100%乙醇脱水组织，更换一次，持续1分钟。
- 用100%二甲苯短暂浸泡约3-4秒以清除玻片。
- 用无绒布小心擦干载玻片。向载玻片滴加1滴（约100–200 µL）合成性、非水性、树脂基封片介质，盖上盖玻片。
3. 样品分析
- 导管分析
- 选择经 α-SMA 染色的切片。使用配备相机连接镜头的光学显微镜，以 20 倍放大倍数采集具有代表性的图像。
- 使用 ImageJ（NIH）区分并计数每张图像中的导管。可手动计数，也可为单个导管分配数值评分。若要进行数值评分，打开 ImageJ 后选择 Plugins，然后选择 Analyze，并从下拉菜单中选择 Cell Counter。点击 Initialize，然后高亮 Type 1 以开始标记导管。完成后，选择 Results 查看导管计数结果。
注意：务必确认结构为导管而非血管。 - 在“设置测量”选项中，勾选“周长”和“面积”".
- 使用手绘多边形工具，在每个导管的肌上皮区室（通过α-SMA染色辅助识别）周围绘制轮廓。选择“测量”功能，记录周长和面积。
- 再次使用自由多边形工具，在管腔内部沿导管上皮的顶端侧绘制一条线。选择“测量”以记录周长和面积。
- 用肌上皮区室的周长减去管腔区室的周长，以得到导管上皮的周长。用肌上皮区室的面积减去管腔区室的面积，以得到导管上皮的面积。
- 免疫组织化学分析
- 将明场图像上传至分析软件，例如 ImageJ 或 FIJI Suite。
注意：本方案概述了使用 ImageJ 及 IHC Toolbox 插件进行染色分析的步骤。 - 从插件菜单中打开 IHC 工具箱。在 "选择模型" 下拉框打开后，选择适当的染料（即 H-DAB，PSR 等等。）。选择 "颜色" 选择分离染色。这将打开一个结果窗口。
注意：如果目标蛋白位于细胞外或胞质空间，或与质膜结合，则该方法适用。如果目标蛋白位于细胞核内，应选择 "细胞核" 将提示插件分析图像中呈阳性染色的细胞核。 - 使用颜色选择滑块，确保准确分离染色区域，避免包含背景信号或过度排除染色信号。
注意：如果自动模式无法检测到染色区域或未能生成可接受的图像，请在已识别的染色区域上绘制一个方形感兴趣区域（ROI）。在 IHC Toolbox 窗口中，选择 "训练" 以引导插件指向适当的目标。 - 将图像转换为16位。前往 图像 → 类型 → 16 位
- 对图像进行阈值处理。前往 图像 → 调整 → 自动阈值。
- 通过在图像的标尺上直接绘制一条线形感兴趣区域（ROI），然后指定其长度，以设定图像测量比例尺。要设置比例尺，请前往 分析 → 设置比例尺 输入每个期望长度单位所对应的像素数量（例如 每50 µm 120像素
- 测量所得区域的面积和平均灰度值。前往 分析 → 设置测量 并单击以收集测量数据 分析 → 测量。
- 将明场图像上传至分析软件，例如 ImageJ 或 FIJI Suite。
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结果
雌性小鼠有5对乳腺，具体包括一对颈乳腺（#1）、两对胸乳腺（#2和#3）、一对腹乳腺（#4）以及一对腹股沟乳腺（#5）。图1A）。在此，我们分离了第4对腺体，因为它们易于识别。在某些情况下，由于第4与第5对腺体难以区分，因此将两者一并分离。为获取完整的第4对腹部乳腺，将皮瓣固定并小心地与下方腹膜分离，从而暴露由箭头所示的第4对腺体位置（图1B). 小心切除第4对腺体，并检查是否存在任何残留的皮下或肌肉组织。尽管在我们分离的腺体中未发现此类组织（图1C），我们确实注意到，在未切除组织而直接切片的组织块中，经纤维连接蛋白染色的腺体显示出明显更多的皮下组织例如 浅层）（图1D）与含有100-...
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讨论
本文介绍了一种用于分离完整小鼠乳腺组织的方法，以便对细胞外基质（ECM）表达和导管形态进行后续组织学分析。在导管形态分析方面，该方法能够基于染色的组织切片快速评估导管结构。其他导管分析方法依赖于染料注射以实现导管树的可视化，而这些方法可能在技术上具有挑战性且耗时较长。
在乳腺癌中，已有报道称细胞外基质（ECM）存在异常1,2,6,9。具体而言，ECM的丰度和/或交联模式的改变已被报道可影响肿瘤进展、转移及治疗耐药性3,4,6,7,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢 April Wiles 和 Roger Broderson 博士在动物尸检和腺体分离方面的协助。本研究的资金由费城骨科医学院衰老相关慢性疾病研究中心提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 光学显微镜 | Olympus | BX43 | |
| 显微镜相机 | Olympus | DP73 | |
| 图像分析软件 | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R 外科手术显微放大镜 | Rose Micro Solutions | 根据研究人员的偏好选择放大倍数 | |
| 梅奥剪刀 | Medline | DYND04035 | |
| 染色架 | Fisher Scientific | 121 | |
| 染色皿 | Fisher Scientific | 112 | |
| 科布林瓶（Coplin Jar） | Fisher Scientific | 19-4 | |
| 玻璃盖玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | 根据组织大小选择合适尺寸 |
| IHC EnVision+ 试剂盒（HRP，小鼠，DAB+） | Dako | K400611-2 | |
| 苦味酸天狼星红染色试剂盒 | Abcam | AB150681 | |
| 醇溶伊红 Y | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| 哈里斯苏木精染液 | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| 驴血清 | EMD Millipore | S30 | |
| 10% 中性缓冲福尔马林 | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 二甲苯，试剂级 | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| 乙醇，200 证明 | Sigma-Aldrich | 792780 | 适用于分子生物学 |
| 磷酸盐缓冲液，1x | Gibco | 10010023 | |
| 柠檬酸钠 | Fisher Scientific | S279-500 | |
| 碳酸钙 | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| 永久封片介质 | Dako | S1964 | |
| EuKitt 封片介质 | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| 纤连蛋白抗体 | Abcam | AB23750 | |
| 腱生蛋白-C 抗体 | Abcam | AB108930 | |
| α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision 双链系统 HRP | Dako | K4065 |
参考文献
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227(2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38(2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11(2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr Protoc Neurosci. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067(2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
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