完整小鼠乳腺腺体的分离及其细胞外基质表达与腺体形态学分析

摘要

本文介绍了一种分离完整小鼠乳腺组织以研究细胞外基质（ECM）表达及导管形态的实验方案。从小鼠第4对腹部乳腺中获取8至10周龄未产雌性小鼠的乳腺组织，经中性缓冲甲醛固定后进行切片，并采用免疫组织化学方法对细胞外基质蛋白进行染色。

摘要

本实验的目的是采集雌性未产小鼠的第4对腹乳腺，以评估细胞外基质（ECM）的表达及导管结构。操作中使用梅奥剪刀在皮肤下方创建一个小腔隙，从而将皮下组织中的乳腺与下方的腹膜分离。借助3.5倍外科手术显微放大镜可更清晰地观察腺体。将皮张翻转并固定，以便识别完整的乳腺脂肪垫。使用解剖刀片在皮下层与腺体之间横向滑动，对每一对第4腹乳腺进行钝性解剖分离。采集后立即将其置于10%中性缓冲福尔马林溶液中，用于后续组织处理。完整切除整个腺体的优势在于，可最大程度避免遗漏导管上皮细胞与其他微环境细胞群体之间重要的组织层面相互作用，而这些信息在部分活检样本中可能被忽略。该方法的一个局限性在于使用固定组织的连续切片，这使得对导管形态发生和蛋白表达的分析仅限于腺体内的特定位置，因此难以获得导管结构和蛋白表达在三维（3D）空间中的变化情况。总体而言，该技术适用于需要完整小鼠乳腺组织进行下游研究的实验，例如发育过程中的导管形态发生或乳腺癌相关研究。

引言

乳腺癌的特征之一是存在显著程度的组织纤维化^1,2,3,4。这种非细胞成分被称为细胞外基质（ECM），在所有组织中均以不同程度存在，主要由纤维性和非纤维性胶原蛋白、弹性蛋白、糖蛋白以及被隔离于该基质中的多种信号分子构成的复杂网状结构组成。在稳态条件下，ECM 的沉积与降解受到严格调控⁵。在乳腺肿瘤发生过程中，ECM 的沉积与降解平衡被打破。因此，已有报道指出乳腺肿瘤会大量表达多种 ECM 蛋白，如胶原蛋白、纤连蛋白和腱生蛋白-C 等⁶。这些蛋白质的异常表达，以及基质交联模式的增加，已被证实可促进乳腺肿瘤的进展、转移及治疗耐药性^1,3,4,7,8,9。

方案

本方案中涉及动物实验的操作已通过费城骨科医学院机构动物护理和使用委员会的审查与批准，所有技术操作均在严格的伦理准则下进行。

1. 样品获取与处理

1. 选择合适的动物实验对象并放入 CO₂ 麻醉室。本实验使用 8–10 周龄雌性未产 B6.Cg-Cav1tmMIs/J 和 C57BL/6J 小鼠。
2. 开启气体流量至 30–40%。约 2 分钟后，当动物明显失去意识时，将气体阀门调至全压，再持续 5 分钟。
   注意：在停止输送 CO₂ 后，需观察动物至少 10 分钟，通过可见呼吸迹象（例如胸部运动）确认其死亡。若动物仍有生命体征，可将其重新放回 CO₂ 麻醉室。也可采用颈椎脱位法处死，但不推荐，因为血液可能积聚于乳腺周围，干扰后续解剖及实验结果。
3. 处死后，将尸体仰卧固定，并用 70% 乙醇充分浸润。
4. 用镊子夹住耻骨上方的皮肤，用小型手术剪刀剪开一小口。旋转剪刀，沿腹侧中线从尾端向头端剪开皮肤。
5. 使用较大的剪刀或止血钳，沿切口两侧钝性分离皮下筋膜，注意避免刺破腹膜。在切口两端的横向边缘处进行剪切。
6. 将皮肤瓣固定张开，并再次喷洒 70% 乙醇。
   注意：尽管使用 70% 乙醇有助于更清晰地区分腺体与周围皮下组织，但需注意避免因使用该溶液导致组织干燥。为防止干燥，....

结果

雌性小鼠有5对乳腺，具体包括一对颈乳腺（#1）、两对胸乳腺（#2和#3）、一对腹乳腺（#4）以及一对腹股沟乳腺（#5）。图1A）。在此，我们分离了第4对腺体，因为它们易于识别。在某些情况下，由于第4与第5对腺体难以区分，因此将两者一并分离。为获取完整的第4对腹部乳腺，将皮瓣固定并小心地与下方腹膜分离，从而暴露由箭头所示的第4对腺体位置（图1B). 小心切除第4对腺体，并检查是否存在任何残留的皮下或肌肉组织。尽管在我们分离的腺体中未发现此类组织（图1C），我们确实注意到，在未切除组织而直接切片的组织块中，经纤维连接蛋白染色的腺体显示出明显更多的皮下组织例如 浅层）（图1D）与含有100-.......

讨论

本文介绍了一种用于分离完整小鼠乳腺组织的方法，以便对细胞外基质（ECM）表达和导管形态进行后续组织学分析。在导管形态分析方面，该方法能够基于染色的组织切片快速评估导管结构。其他导管分析方法依赖于染料注射以实现导管树的可视化，而这些方法可能在技术上具有挑战性且耗时较长。

在乳腺癌中，已有报道称细胞外基质（ECM）存在异常^1,2,6,9。具体而言，ECM的丰度和/或交联模式的改变已被报道可影响肿瘤进展、转移及治疗耐药性^3,4,6,7,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
光学显微镜	Olympus	BX43
显微镜相机	Olympus	DP73
图像分析软件	Olympus	cellSens Entry software
	NIH	ImageJ
3.5x-R 外科手术显微放大镜	Rose Micro Solutions		根据研究人员的偏好选择放大倍数
梅奥剪刀	Medline	DYND04035
染色架	Fisher Scientific	121
染色皿	Fisher Scientific	112
科布林瓶（Coplin Jar）	Fisher Scientific	19-4
玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-550-15	根据组织大小选择合适尺寸
IHC EnVision+ 试剂盒（HRP，小鼠，DAB+）	Dako	K400611-2
苦味酸天狼星红染色试剂盒	Abcam	AB150681
醇溶伊红 Y	Sigma-Aldrich	HT110132
哈里斯苏木精染液	Sigma-Aldrich	HHS16
驴血清	EMD Millipore	S30
10% 中性缓冲福尔马林	Sigma-Aldrich	HT501128
二甲苯，试剂级	Sigma-Aldrich	214736
乙醇，200 证明	Sigma-Aldrich	792780	适用于分子生物学
磷酸盐缓冲液，1x	Gibco	10010023
柠檬酸钠	Fisher Scientific	S279-500
碳酸钙	Sigma-Aldrich	202932
永久封片介质	Dako	S1964
EuKitt 封片介质	Sigma-Aldrich	3989
纤连蛋白抗体	Abcam	AB23750
腱生蛋白-C 抗体	Abcam	AB108930
α-平滑肌肌动蛋白抗体	Abcam	AB124964
Dako Envision 双链系统 HRP	Dako	K4065