一种从慢性活动性EB病毒 感染患者建立NK和T细胞系的高效简便方法

摘要

建立了一种高效获取慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）患者NK细胞和T细胞克隆的简易方法，该方法仅需少量外周血和低剂量IL-2。

摘要

已有多种方法被用于从淋巴瘤或淋巴增殖性疾病患者中建立NK/T细胞系。这些方法通常需要使用饲养细胞、纯化的NK或T细胞，并采集多达10 mL的血液，或使用高剂量的IL-2。本研究提出一种高效且简便的新方法，仅需2 mL全血，通过在重组人IL-2（rhIL-2）存在下培养外周血单个核细胞（PBMC），即可建立NK和T细胞系。细胞可在两周内快速增殖，并可维持培养超过3个月。采用该方法，已成功建立了7株NK或T细胞系，成功率较高。该方法操作简便、结果可靠，适用于更多慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）或NK/T细胞淋巴瘤病例的细胞系建立。

引言

EB病毒（EBV）普遍存在，不仅感染B细胞，还感染T细胞和自然杀伤（NK）细胞，从而导致多种EBV相关的NK/T淋巴细胞增殖性疾病（LPD）以及淋巴瘤/白血病，例如EBV相关性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症、痘疮样淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型以及侵袭性NK细胞白血病^1,2,3。其中一种为严重的慢性活动性EB病毒感染（SCAEBV），主要发生于东亚地区，目前被认为是由EBV感染的T细胞或NK细胞克隆性扩增所致的一种淋巴细胞增殖性疾病^4,5,6,7，但与传染性单核细胞增多症（IM）样症状不同，患者无明显免疫缺陷，而是表现为持续性或反复发热、肝脾肿大、淋巴结肿大、肝功能异常，以及外周血中EBV-DNA载量升高^8,9。慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）患者的预后较差^10,11，其发病机制及EBV在其中的作用尚不明确。因此，来源于EBV相关NK/T淋巴细胞增殖性疾病和淋巴瘤的细胞系作为细胞模型，对于阐明EBV诱导NK或T细胞增殖的机制及其与白血病或淋巴瘤高发之间的关系具有重要意义。

迄今为止，已采用不同技术建立了多种细胞系^{12,13,14,15,16}。人NK细胞系NK-YS来源于NK细胞淋巴瘤/白血病，通过与小鼠基质细胞系共培养作为饲养细胞，并在含20 U/mL浓度的重组人IL-2（rhIL-2）的条件下建立¹⁵。KAI3是另一株NK细胞系，来源于患有严重蚊虫过敏或慢性活动性EB病毒感染（SCAEBV）的患者，采用自体EB病毒转化的B细胞（即淋巴母细胞样细胞系，LCL）作为饲养细胞，并添加100 U/mL的rhIL-2建立¹⁶。SNK6和SNT8则通过向鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者的肿瘤组织中添加高剂量rhIL-2（700 U/mL）而获得¹²。采用类似技术，SNK-1细胞系由CAEBV患者外周血单个核细胞（PBMC）去除T细胞后，添加700 U/mL的rhIL-2培养建立^13,17。SNT13和SNT15则是通过去除CD4+和CD8+细胞后建立的¹⁸。迄今为止，所有来自EBV相关NK/T淋巴增殖性疾病的T细胞和NK细胞系均采用该方法建立¹⁹。

上述现有方法的缺点包括使用饲养细胞、需要高剂量的IL-2、需使用多达10 mL全血，或需纯化NK/T细胞，而在临床实践中，由于在开始培养前必须验证EBV潜伏感染的细胞类型，这些步骤均极具挑战性。由于CAEBV主要发生在亚洲儿童中，10 mL血液在所有地区均不易获取。在本研究中，我们开发了一种新的简便方法，仅需2 mL全血、低剂量重组人IL-2（rhIL2），无需饲养细胞，即可通过培养CAEBV患者的外周血单个核细胞（PBMC）高效建立NK和/或T细胞系。该方法的成功率高，已被证实具有高效性和节省时间的优势。

方案

本研究经中国科学院遗传与发育生物学研究所伦理委员会批准，且研究方案遵循该机构关于人类福祉的指导方针。

注意：工作流程示意图参见图1。

1. CAEBV 患者外周血单个核细胞的分离

1. 通过梯度法从2 mL慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）患者的全血中纯化原代外周血单个核细胞（PBMC）例如，Ficoll-plaque）密度梯度离心法，具体操作按照制造商说明书进行。或者，将冻存在液氮中的外周血单个核细胞（PBMC）用RPMI 1640培养基解冻。
2. 加入2 µL台盼蓝（0.4%）至18 µL细胞悬液中，静置3分钟以染色细胞，将悬液转移至细胞计数板，使用自动细胞计数仪测定细胞浓度和活率。
3. 将细胞悬液调整至密度为 2-3×10⁶ 每毫升细胞悬液中加入含20%人血清（56 °C热灭活）、2 mM L-谷氨酰胺和抗生素（100 µg/mL链霉素，100 U/mL青霉素）的完全RPMI 1640培养基。将1 mL外周血单个核细胞（PBMC）悬液接种至24孔细胞培养板的每个孔中。
4. 每孔加入 150 U rhIL-2。
5. 将培养皿置于5% CO₂培养箱中₂ 37 °C 培养箱中孵育。
6. 第2天，在显微镜下观察细胞形态（200倍放大）；当细胞呈明亮且圆形时，表明细胞状态良好。

2. 细胞扩增与活细胞计数

1. 在显微镜下观察细胞形态（200倍放大），并在更换培养基前通过细胞计数监测细胞生长状态：取18 µL细胞悬液加入2 µL台盼蓝（0.4%），计算细胞浓度（见1.2节，图2）。
2. 弃去24孔板中每孔500 µL培养基，加入500 µL新鲜的完全培养基，每孔添加150U重组人IL-2（rhIL-2）。
3. 按照步骤2.2的方法，每周更换两次培养基。
4. 绘制细胞生长曲线（图3）。
5. 当活细胞浓度超过5×10⁶/mL时，将细胞以每孔1-2×10⁶个细胞/mL的浓度传代至新的孔中。该过程需要2-4周。

3. 通过流式细胞术进行细胞表型分析

1. 当细胞扩增后，收集 1×10⁶ 个细胞以确定细胞系的表型。在室温下以 240 x g 离心 5 分钟（NK/T 细胞将沉淀至管底）。
2. 弃去上清液，加入 7 mL PBS 重悬沉淀。在室温下以 240 x g 离心 5 分钟。重复一次。
3. 向每管中加入 200 µL 人血清，充分混匀，并在室温下孵育 10 分钟。
4. 在室温下以 240 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，用冷 PBSA（PBS + 0.2% BSA）将细胞重悬至 1×10⁶/mL。将细胞分至 5 支管中，每管含 2×10⁵ 个细胞。
5. 在 4 °C 下以 240 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 PBSA 缓冲液或含 10 µL PE（或 PE-Cy7）和 10 µL FITC 标记抗体的 PBSA 重悬细胞，在冰上染色 T 或 NK 细胞的细胞受体，如 图 4 所示。仅用 PBSA 缓冲液重悬的细胞作为阴性对照。
6. 在冰上避光孵育细胞与抗体 20–30 分钟。
7. 用冷 PBSA 洗涤细胞两次，最后用 300 µL 冷 PBSA 重悬细胞。
8. 使用流式细胞仪分析细胞表型。
   1. 在 "创建工作表" 条件下设置流式细胞仪。使用点图（dot plot）设置实验模板，显示前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）。
   2. 加载同型对照管，优化 FSC 和 SSC 电压，并调整 FSC 阈值，以去除碎片信号，同时不干扰目标细胞群。删除除 FSC、SSC、FITC、PE 和 PE-Cy7 之外的所有参数。
   3. 在每组双色分析中，使用同型对照和单一阳性对照进行补偿调节。
   4. 加载样本，创建 HLA-DR 对 CD19、CD4 对 CD8、CD56 对 CD16 以及 CD3 对 CD16 的点图，以显示不同细胞亚群。
      注：使用 PBMC 进行补偿调节，采用阴性/同型对照和单一阳性对照。常规使用流式细胞仪进行双色免疫荧光分析，以检测表面标志物的表达。所用抗体包括：抗 HLA-DR、抗 CD4、抗 CD16 与异硫氰酸荧光素（FITC）偶联、抗 CD8、抗 CD56、抗 CD3 与藻红蛋白（PE）偶联，以及抗 CD19 与 PE-Cy7 偶联。

4. NK/T 细胞的扩增与冷冻保存

1. 完成细胞表型分析后更换培养基。小心移除一半的上清液，避免触碰培养板底部的细胞。向细胞培养板中加入等体积含有300 U/mL重组人IL-2（rhIL-2）的新鲜培养基。
2. 每3天更换一半培养基（同2.2步骤），直至显微镜下可清晰观察到细胞簇（图2）。该过程通常需要2-3周。
3. 将同一条系的不同孔中的细胞混合后，从24孔板转移至T25培养瓶。当培养基变黄时，将培养基体积加倍，直至总体积达到10-15 mL，并加入终浓度为150 U/mL的rhIL-2。
4. 在培养2-3周、肉眼可见细胞团块后，于冻存前24小时更换培养基。使用细胞计数仪测定细胞浓度。
5. 将细胞悬液在240 × g条件下离心5分钟，用冷冻保存液重悬细胞沉淀，细胞密度为5-10 × 10⁶ 个细胞/mL，冷冻保存液含90%胎牛血清和10%二甲基亚砜（DMSO）。以每分钟降低1 °C的速率将样本降温至-80 °C，随后直接转移至液氮中保存。

结果

在建立细胞系的培养3天后，多形性细胞开始出现（图2）。培养7天后，细胞增殖迅速，细胞数量和活力均以较高速度增加（图3）。培养10至14天后，可清晰观察到细胞形成的小细胞簇，此时细胞浓度可超过3-6 × 10⁶。在此阶段，应将细胞按1:2或1:3比例传代至新的培养板孔中进行扩增。约一个月后，当细胞数量达到3-5×10⁷时，即可进行保存。

另一个重要问题是确定细胞成功培养后的表型。我们的结果表明，T（L196）细胞和NK（M296）细胞可通过上述方法进行培养（图4），并且利用该技术可建立细胞系，因为这些细胞在良好状态下生长超过3个月。

讨论

本方案中，我们建立了一种从慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）患者全血中分离NK/T细胞系的新方法。与现有方法相比，该方法的主要优势在于操作简便、仅需少量血液样本，同时具有较高的成功率和良好的细胞活力。此外，该方法无需在培养前预先确定潜伏感染EB病毒的细胞类型，因为此类鉴定过程会消耗更多的血液样本并延长前期准备时间。相反，可在建立细胞系后通过流式细胞术对细胞系进行分析，并分选不同表型的细胞。同时，该方法仅需使用低剂量重组人IL-2（rhIL-2），且无需饲养细胞。利用该方法，我们已从8例CAEBV患者中成功建立了7株细胞系，并在一个月内完成冻存。其中未能成功建系的一例样本仍可维持存活超过5个月，但无明显增殖，其背后机制尚需进一步研究。

需要注意的是，细胞生长严格依赖于重组人IL-2的存在，这一结果与既往报道一致。^20,21；若无外源性人IL-2，细胞将在3周内死亡。显然，高质量的IL-2对细胞增殖至关重要，尽管决定细胞增殖能力的具体因素 体外 仍需...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人 HLA-DR FITC	BD	560944	FACS 用抗体
人 CD4 FITC	BD	555346	FACS 用抗体
人/非人灵长类 CD8 PE	BD	557086	FACS 用抗体
人 CD3 PE	BD	555340	FACS 用抗体
人 CD16 FITC 3G8	BD	555406	FACS 用抗体
人/非人灵长类 CD56 PE MY31	BD	556647	FACS 用抗体
人 CD19 PE-Cy7	BD	560728	FACS 用抗体
人 IL-2	Roche	11147528001
人血清	MRC	CCC118-125
CO2 培养箱	SANYO
离心机	Techcomp	CT6T	用于离心
显微镜	OLYMPUS CKX53	CKX53
自动细胞计数仪	Countstar	IC 1000	用于细胞计数
24 孔细胞培养板	Corning Incorporated	3524	聚苯乙烯板
25 cm² 细胞培养瓶	Nest	707001	聚苯乙烯
FBS	Gibco	10270	细胞培养基组分
RPMI 1640 培养基	life	22400089	用于配制细胞培养基
L-谷氨酰胺	Amresco	374	细胞培养基组分
100 倍链霉素-青霉素溶液 BioRoYeeBRY-2309	BioRoYee	BRY-2309	细胞培养基组分
Ficoll paque plus	GE Healthcare	17-1440-03	用于体外分离淋巴细胞
DMSO	Sigma	D2650	用于细胞冻存
流式细胞仪	BD	BD FACSAria II
软件	BD	BD FACSDiva 软件	用于 FACS 分析