方法文章

一种从慢性活动性EB病毒 感染患者建立NK和T细胞系的高效简便方法

DOI：

10.3791/56515

⸱

2018年3月30日

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1Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, 2MOE Key Laboratory of Major Diseases in Children, National Key Discipline of Pediatrics, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, 3State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

本文内容

摘要

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建立了一种高效获取慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）患者NK细胞和T细胞克隆的简易方法，该方法仅需少量外周血和低剂量IL-2。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

已有多种方法被用于从淋巴瘤或淋巴增殖性疾病患者中建立NK/T细胞系。这些方法通常需要使用饲养细胞、纯化的NK或T细胞，并采集多达10 mL的血液，或使用高剂量的IL-2。本研究提出一种高效且简便的新方法，仅需2 mL全血，通过在重组人IL-2（rhIL-2）存在下培养外周血单个核细胞（PBMC），即可建立NK和T细胞系。细胞可在两周内快速增殖，并可维持培养超过3个月。采用该方法，已成功建立了7株NK或T细胞系，成功率较高。该方法操作简便、结果可靠，适用于更多慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）或NK/T细胞淋巴瘤病例的细胞系建立。

引言

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EB病毒（EBV）普遍存在，不仅感染B细胞，还感染T细胞和自然杀伤（NK）细胞，从而导致多种EBV相关的NK/T淋巴细胞增殖性疾病（LPD）以及淋巴瘤/白血病，例如EBV相关性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症、痘疮样淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型以及侵袭性NK细胞白血病1,2,3。其中一种为严重的慢性活动性EB病毒感染（SCAEBV），主要发生于东亚地区，目前被认为是由EBV感染的T细胞或NK细胞克隆性扩增所致的一种淋巴细胞增殖性疾病4,5,6,7，但与传染性单核细胞增多症（IM）样症状不同，患者无明显免疫缺陷，而是表现为持续性或反复发热、肝脾肿大、淋巴结肿大、肝功能异常，以及外周血中EBV-DNA载量升高8,9。慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）患者的预后较差10,11....

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方案

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本研究经中国科学院遗传与发育生物学研究所伦理委员会批准，且研究方案遵循该机构关于人类福祉的指导方针。

注意：工作流程示意图参见图1。

1. CAEBV 患者外周血单个核细胞的分离

  1. 通过梯度法从2 mL慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）患者的全血中纯化原代外周血单个核细胞（PBMC）例如，Ficoll-plaque）密度梯度离心法，具体操作按照制造商说明书进行。或者，将冻存在液氮中的外周血单个核细胞（PBMC）用RPMI 1640培养基解冻。
  2. 加入2 µL台盼蓝（0.4%）至18 µL细胞悬液中，静置3分钟以染色细胞，将悬液转移至细胞计数板，使用自动细胞计数仪测定细胞浓度和活率。
  3. 将细胞悬液调整至密度为 2-3×106 每毫升细胞悬液中加入含20%人血清（56 °C热灭活）、2 mM L-谷氨酰胺和抗生素（100 µg/mL链霉素，100 U/mL青霉素）的完全RPMI 1640培养基。将1 mL外周血单个核细胞（PBMC）悬液接种至24孔细胞培养板的每个孔中。
  4. 每孔加入 150 U rhIL-2。
  5. 将培养皿置于5% CO₂培养箱中2 37 °C 培养箱中孵育。
  6. 第2天，在显微镜....

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结果

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在建立细胞系的培养3天后，多形性细胞开始出现（图2）。培养7天后，细胞增殖迅速，细胞数量和活力均以较高速度增加（图3）。培养10至14天后，可清晰观察到细胞形成的小细胞簇，此时细胞浓度可超过3-6 × 106。在此阶段，应将细胞按1:2或1:3比例传代至新的培养板孔中进行扩增。约一个月后，当细胞数量达到3-5×107时，即可进行保存。

另一个重要问题是确定细胞成功培养后的表型。我们的结果表明，T（L196）细胞和NK（M296）细胞可通过上述方法进行培养（图4），并且利用该技术可建立细胞系，因为这些细胞在良好状态下生长超过3个月。

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讨论

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本方案中，我们建立了一种从慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）患者全血中分离NK/T细胞系的新方法。与现有方法相比，该方法的主要优势在于操作简便、仅需少量血液样本，同时具有较高的成功率和良好的细胞活力。此外，该方法无需在培养前预先确定潜伏感染EB病毒的细胞类型，因为此类鉴定过程会消耗更多的血液样本并延长前期准备时间。相反，可在建立细胞系后通过流式细胞术对细胞系进行分析，并分选不同表型的细胞。同时，该方法仅需使用低剂量重组人IL-2（rhIL-2），且无需饲养细胞。利用该方法，我们已从8例CAEBV患者中成功建立了7株细胞系，并在一个月内完成冻存。其中未能成功建系的一例样本仍可维持存活超过5个月，但无明显增殖，其背后机制尚需进一步研究。

需要注意的是，细胞生长严格依赖于重组人IL-2的存在，这一结果与既往报道一致。20,21；若无外源性人IL-2，细胞将在3周内死亡。显然，高质量的IL-2对细胞增殖至关重要，尽管决定细胞增殖能力的具体因素 体外 仍需.......

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披露

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D.Z.、X.Z. 和 X.C. 是正在申请的专利的共同发明人，该专利涉及本方法在建立NK/T细胞系及本研究中所建立的细胞系方面的潜在用途。D.Z.、X.Z. 和 X.C. 宣布在本工作中不存在竞争性财务利益。其余作者声明他们不存在竞争性财务利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作得到中国科学院重点部署项目（KFZD-SW-205）、中国科学院战略生物资源技术支撑体系（CZBZX-1 和 ZSSB-004）以及国家自然科学基金（81401640）和  上海市自然科学基金（14ZR1434800）的资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
人 HLA-DR FITCBD560944FACS 用抗体
人 CD4 FITCBD555346FACS 用抗体
人/非人灵长类 CD8 PEBD557086FACS 用抗体
人 CD3 PEBD555340FACS 用抗体
人 CD16 FITC 3G8BD555406FACS 用抗体
人/非人灵长类 CD56 PE MY31BD556647FACS 用抗体
人 CD19 PE-Cy7BD560728FACS 用抗体
人 IL-2Roche11147528001
人血清MRCCCC118-125
CO2 培养箱SANYO
离心机TechcompCT6T用于离心
显微镜OLYMPUS CKX53CKX53
自动细胞计数仪CountstarIC 1000用于细胞计数
24 孔细胞培养板Corning Incorporated3524聚苯乙烯板
25 cm² 细胞培养瓶Nest707001聚苯乙烯
FBSGibco10270细胞培养基组分
RPMI 1640 培养基life22400089用于配制细胞培养基
L-谷氨酰胺Amresco374细胞培养基组分
100 倍链霉素-青霉素溶液 BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309细胞培养基组分
Ficoll paque plusGE Healthcare17-1440-03用于体外分离淋巴细胞
DMSOSigmaD2650用于细胞冻存
流式细胞仪BDBD FACSAria II
软件BDBD FACSDiva 软件用于 FACS 分析

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
  2. Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompro....

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NK T EB IL 2

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