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方法文章

小鼠耳蜗脱细胞方案在内耳组织工程中的应用

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DOI：

10.3791/56523

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2018年1月1日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, University of Kansas Medical Center, 2Stephenson School of Biomedical Engineering, University of Oklahoma, 3Department of Plastic Surgery, University of Kansas Medical Center

本文内容

摘要

本实验方案的目的是展示一种有效的方法，用于对小鼠耳蜗进行脱细胞和脱钙处理，以制备可用于组织工程应用的支架材料。

摘要

在哺乳动物中，负责听觉的机械感觉毛细胞缺乏再生能力，这限制了听力损失的治疗手段。目前再生医学的研究策略主要集中在移植干细胞或对内耳周围的支持细胞进行遗传操作，以促进受损毛细胞的替代，从而改善听力损失。然而，细胞外基质（ECM）可能在诱导和维持毛细胞功能方面发挥关键作用，但对此的研究仍不充分。利用耳蜗细胞外基质作为支架来培养成体干细胞，可能有助于揭示细胞外环境的组成与结构如何帮助细胞维持听觉功能。本文介绍一种从小鼠耳蜗中分离并去细胞化以制备可接受灌注成体干细胞的支架的方法。在本方案中，从小鼠耳蜗中分离组织，进行去细胞化和脱钙处理。随后，将来源于脐带的人华通胶细胞（hWJCs）小心地灌注到每个耳蜗中。将耳蜗用作生物反应器，细胞培养30天后进行分析处理。去细胞化的耳蜗保留了可识别的细胞外结构，但未检测到细胞或明显的DNA片段。灌注到耳蜗中的细胞侵入了耳蜗的大部分内外区域，并在30天内正常生长。因此，该方法可用于研究耳蜗细胞外基质对细胞发育和行为的影响。

引言

耳蜗是位于颞骨内的复杂螺旋结构，由外层的骨迷路和内层同心排列的膜迷路组成1。膜迷路包含三个充满液体的腔隙：前庭阶、中阶和鼓阶1。中阶内含有感觉上皮，其由多种细胞类型构成，其中特别重要的是感受声音刺激的感觉毛细胞（HC），它能将声波中的机械能转化为神经冲动2。暴露于声创伤3,4,5、药物6、疾病7,8以及衰老9等因素均可能导致毛细胞死亡，进而引起听觉功能损伤。在哺乳动物中，毛细胞的丢失是永久性的，而鸟类的毛细胞在受损后具有再生能力10。

尽管具体的实验方法各不相同，但当前许多研究工作都致力于恢复已丧失的毛细胞（HCs）。调控感觉上皮中的基因表达以及植入体外分化的干细胞是该领域的主要策略，此外也有研究尝试通过诱导方法将干细胞分化为耳蜗类器官11,12,13。这些方法要么直接依赖于干细胞，要么依赖于干细胞所使用的发育信号；然而，另一个共同且可能至关重要的因素是耳蜗自身的细胞外基质（ECM）14,15。

细胞外基质（ECM）不仅为细胞和组织提供物理支持，包括为细胞黏附、增殖、存活和迁移提供表面，还在毛细胞（HC）和螺旋神经节的发育过程中发挥关键作用15,16,17。天然存在的ECM可提供诱导性信号，可能引导细胞表型的确定以及/或者细胞的黏附、增殖和存活18。因此，将脱细胞耳蜗与培养的人脐带华通胶间充质干细胞（hWJCs）结合使用，为探索ECM在毛细胞再生中的作用提供了独特的机会。hWJCs是一种易于获取、无伦理争议的细胞类型，来源于人类脐带，其行为特性类似于间充质干细胞19。hWJCs已被证明能够向神经感觉细胞谱系分化20,21。因此，本实验方案详细描述了从C57BL小鼠尸体中分离耳蜗、对其进行脱细胞处理，并用hWJCs灌注，用于内耳组织工程的研究。

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方案

所有实验操作，包括动物安乐死，均按照堪萨斯大学医学中心（KUMC）批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）协议（ACUP #2014-2234）进行。

注意：人脐带华通氏胶细胞（HWJCs）取自已签署知情同意书患者的捐赠脐带，样本使用均依照堪萨斯大学人类受试者委员会批准的方案（KU-IRB #15402）进行。

1. 颞骨采集与耳蜗分离

  1. 用一把锋利的手术剪，在颅骨与第一颈椎之间剪断，处死一只已适当实施安乐死的15周龄小鼠，然后用70%乙醇喷洒头部进行消毒（图1A).
  2. 使用同一把锋利的手术剪沿正中矢状面将颅骨切开图 1B- C，虚线）。
  3. 使用镊子从颅骨中取出脑组织（图1D，箭头）。
  4. 通过听神经和前庭神经根的存在来识别颞骨图1E- F，箭头）位于颅骨内侧和耳道外侧图1F，箭头）。小心切割颅骨，以分离颞骨与颅骨其余部分（图1G).
    注意：在某些情况下，可能无需切割，即可小心地将颅骨周围骨骼从颞骨上剥离。
  5. 将精细镊子插入耳道开口处，深度约5 mm（图1H），以免尖端刺破耳蜗。轻轻敲开鼓室的骨壁（图1H，顶部红色阴影区域）发生断裂（图1I，红色虚线。
    注意：如有必要，可使用解剖显微镜辅助操作，以确保器械的准确定位和操作。
  6. 使用精细镊子将鼓泡的其余部分从颞骨上剥离，暴露耳蜗的骨迷路（图1J，红色方括号
  7. 放置一个足够大的培养皿以容纳颞骨（例如，在解剖显微镜视野下方放置一个直径30 mm或更大的培养皿，并加入足量磷酸盐缓冲液（PBS）以浸没颞骨例如0.5 至 1 mL
  8. 将去除鼓泡后的颞骨浸入PBS中，耳蜗的卵圆窗和圆窗朝上。
    注意：无需移除耳蜗中的前庭系统，因为前庭系统可作为良好的操作手柄，用于操控和定位耳蜗的结构图1I 和 图2B).
  9. 使用超细镊子移除穿过镫骨的镫动脉。
  10. 将超细镊子的一端从镫骨弓中穿过（此处为动脉穿过的部位），轻柔地向上提起镫骨。脱位的镫骨应随之从卵圆窗抬起。
  11. 使用超细镊子的一个尖端刺破卵圆窗和圆窗。
  12. 使用装有1× PBS的28.5号针头注射器，并连接内径0.28 mm、外径0.61 mm的导管，将导管置于卵圆窗上方（图2A - B).
    注意：可使用超细镊子调整管口位置，以确保准确放置。
    1. 每次耳蜗操作均需使用新的注射器和管路。
  13. 用 2 mL 含 10% 抗生素-抗真菌素（anti-anti）和 10% 青霉素-链霉素（pen-strep）的 PBS 溶液，经 5 分钟灌注耳蜗以去除外淋巴液。灌注速度过快或压力过高会损伤耳蜗内的精细结构。
    注意：手动推动注射器使液体灌注耳蜗是有效的，尽管也可选择使用灌注泵作为替代方法。
    1. 若进行手动灌注，使用一对精细的自闭合镊子固定耳蜗（图2A) 灌注过程中通过夹持颞骨的前庭部分。
      注意：尽管并非必需，但这样做可使双手均能自由操作器械；一只手可推动注射器（图2A）而另一人可适当地放置管路（图2B).
    2. 从这一步开始，需注意避免耳蜗不必要的空气暴露。将气泡引入液体空间会阻碍液体循环，而进一步干燥则会损伤耳蜗内部的精细结构。
  14. 使用精细镊子去除并弃去残留的肌肉组织和骨碎片。
  15. 如有需要，可将分离的耳蜗置于含10%抗-抗和10%青霉素-链霉素的PBS溶液中，4 °C保存最多七天，每48小时定期更换抗生素溶液。

2. 耳蜗处理

  1. 脱细胞化
    1. 对于每个耳蜗，向一个20 mL玻璃闪烁瓶中加入含1%十二烷基硫酸钠（SDS）的去离子（DI）水溶液，用于耳蜗的脱细胞处理。
    2. 使用剃刀片剪去一个塑料7 mL移液管的管尖，使其开口足够大，以便耳蜗顺利通过。
    3. 使用该移液管，轻柔地将耳蜗吸入管内，使其刚好通过剪切边缘数毫米。
    4. 将耳蜗排入盛有1% SDS溶液的闪烁瓶中。
    5. 使用移液管，在闪烁瓶中将2 mL含1% SDS的去离子（DI）水溶液反复通过耳蜗 。
    6. 将闪烁瓶放入旋转仪中，于室温下以10 rpm转速旋转72小时。
      1. 在72小时内每24小时更换一次1% SDS溶液。更换溶液时需注意，切勿使耳蜗暴露于空气中。
    7. 用去离子水对耳蜗进行三次洗涤，每次30分钟。洗涤步骤在用于SDS处理的同一闪烁瓶中进行；此时耳蜗已完成脱细胞化。
  2. 脱钙
    1. 从闪烁瓶中移除残留的去离子水，仅保留足够浸没耳蜗的液体量。
    2. 开始脱钙处理：向含有耳蜗的闪烁瓶中加入5 mL含10%乙二胺四乙酸（EDTA）（0.02 M）的去离子水溶液。
    3. 使用移液管，在闪烁瓶中将2 mL含10% EDTA的去离子水溶液反复通过耳蜗 。
    4. 将闪烁瓶重新放回旋转仪中，于室温下以10 rpm转速旋转72小时。在72小时内每24小时更换一次10% EDTA溶液。更换溶液时需注意避免耳蜗暴露于空气中。
    5. 用1× PBS缓冲液对耳蜗进行三次冲洗，每次2小时；此时耳蜗已完成脱钙处理。
  3. 保存
    1. 将耳蜗保存于含10%抗-抗（anti-anti）和10%青霉素-链霉素（pen-strep）的PBS溶液中，4 °C条件下最长可保存72小时。
      注：若定期更换抗生素溶液，可能实现更长时间的保存；但本方案未验证处理后耳蜗的长期保存效果。

3. 人脐带华通氏胶间充质干细胞的获取与扩增

  1. 根据先前发表的方案分离人华通氏胶细胞（hWJCs）22。简言之，将脐带切成3 cm长的节段。
  2. 用手术刀沿每个脐带节段纵向小心地做一浅切口，以展开并暴露脐带的华通氏胶。使用镊子去除血管。
  3. 用足量的磷酸盐缓冲液（PBS）（例如，在60 mm培养皿中使用40 mL）清洗脐带节段两次，使组织完全浸没。用手术刀将组织节段切碎。在100 mm培养皿中加入50 mL消化液（含0.2% II型胶原酶、1%青霉素-链霉素的低糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM））进行组织消化。
  4. 将组织置于消化液中，在5% CO2、37 °C的培养箱中以50 rpm的转速在摇床上过夜孵育。次日，用含2%抗生素-抗真菌剂的PBS将消化液按1:16比例稀释，并在室温（~27 °C）下以500 × g离心10分钟收集细胞。弃去上清液。
  5. 将细胞沉淀重悬于间充质干细胞生长培养基（MSCGM）中，并合并细胞。以7 × 103 个细胞/cm2 的密度接种于经组织培养处理的T-75培养瓶中。在MSCGM中培养HWJCs，并扩增至第5代用于实验。
    注意：传代时可将HWJCs继代至更大的T形培养瓶（例如，T-150、T-300），以提高实验用hWJCs的产量。

4. 将人脐带华通氏胶细胞注入脱细胞耳蜗

  1. 准备脱细胞耳蜗
    1. 采用无菌技术，将储存的耳蜗用 1× PBS 洗涤三次，每次 30 分钟。
    2. 将耳蜗转移至 24 孔板的各个孔中，并加入 1 mL 37 °C 预热的 MSCGM。
    3. 在接种细胞前，将耳蜗置于 5% CO2、37 °C 的细胞培养箱中孵育至少 1 小时。
  2. 消化 hWJCs 并重悬细胞
    1. 用 37 °C 预热的 1× PBS 洗涤 hWJCs 两次。
    2. 加入足量 37 °C 预热的含 0.5% EDTA 的胰蛋白酶，以覆盖细胞培养容器表面。
    3. 将 hWJCs 置于 5% CO2、37 °C 的细胞培养箱中孵育最多 5 分钟。
      1. 在倒置显微镜下观察细胞，确认约 90% 的细胞已从培养表面脱落。
        注：轻敲培养容器时发生移动的细胞表示已脱落；保持静止的细胞则尚未脱落。
      2. 轻轻敲击培养瓶侧面，以进一步松动仍附着的细胞。
    4. 采用无菌操作技术，将 hWJCs 从培养容器转移至一个 50 mL 圆底离心管中，管内含有与所用胰蛋白酶体积相等的 MSCGM。
    5. 在室温（约 27 °C）下以 500 × g 离心 5 分钟，使 hWJCs 沉淀。
    6. 吸除上清液，并将 hWJCs 重悬于 MSCGM 中，调整细胞浓度至 500,000 个细胞/mL。
  3. 灌注耳蜗
    1. 使用移液器将耳蜗转移至新的 24 孔板中。
    2. 向每个耳蜗滴加一滴 MSCGM，防止耳蜗干燥。
    3. 使用超细镊子小心调整耳蜗方向，使卵圆窗和圆窗朝上。
      注：直接操作耳蜗时需格外小心，因其极易受损。
    4. 使用连接导管的无菌 28.5 号胰岛素注射器，吸取 0.2 mL 重悬的 hWJCs（含 100,000 个细胞）。
    5. 用灭菌的细镊子将导管置于卵圆窗上方。
    6. 通过连接聚乙烯导管（外径：0.61 mm，内径：0.28 mm）的 28.5 号胰岛素注射器，在约 5 分钟内缓慢、轻柔地向耳蜗灌注 0.2 mL 重悬的 hWJCs。
    7. 灌注完成后，在含有耳蜗的孔中加入 0.8 mL 37 °C 预热的 MSCGM，使孔内总体积达到 1 mL。
    8. 对每个耳蜗重复步骤 4.3.3–4.3.7，每次均使用新的注射器和导管。
    9. 将灌注后的耳蜗置于 5% CO2、37 °C 的细胞培养箱中培养，每周更换培养基三次。

5. 耳蜗的采集与保存

注意：耳蜗可在灌注后30天内的任意时间点进行培养和收获。

  1. 为保存耳蜗，将样本置于含4%多聚甲醛的1×PBS溶液中，于4 °C在摇床上固定过夜。
  2. 固定后，用1×PBS溶液洗涤耳蜗3次，每次5分钟。
  3. 用乙醇逐步脱水，并使用脂肪族碳氢化合物溶剂透明处理，然后包埋于石蜡中。
  4. 使用切片机将样本切为10 µm厚度，并贴附于玻璃显微镜载片上。
    注意：样本现已准备好，可按照标准方案进行组织学或免疫组织化学处理。

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结果

通过本研究所介绍的方法，采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色检测DNA的存在与否，以评估耳蜗脱细胞是否成功。若在脱细胞耳蜗中未检测到DNA，则认为耳蜗已完全脱细胞。本实验使用先前未进行脱细胞或脱钙处理的小鼠原生耳蜗作为阳性对照，以展示C57BL小鼠耳蜗中传统存在的结构和细胞。未注入人脐带华通胶间充质干细胞（hWJCs）的脱细胞-脱钙耳蜗作为阴性对照。在组织切片的任何区域均未观察到可量化的DAPI染色细胞核（图3）。本研究中，两个耳蜗经脱细胞和脱钙处理后，注入了hWJCs。经hWJCs灌注的脱细胞-脱钙耳蜗在耳蜗内部以及耳蜗外骨壳表面均观察到大量DAPI染色的细胞核（表1）。经细胞灌注的第一个耳蜗在培养30天后的总估算细胞密度为113,759个细胞/耳蜗（图4 和 图5），第二个耳蜗为118,732个细胞/耳蜗（

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讨论

我们已成功证明，可通过脱细胞过程将内耳耳蜗中的天然细胞从耳蜗中去除，从而将耳蜗用作复杂且具有三维结构的组织支架。Santi et al.15 建立了最初的耳蜗脱细胞方法，并借助光片显微镜技术准确估算了多种耳蜗结构的体积23。这些早期研究为本文所介绍的组织工程与细胞培养技术奠定了坚实基础。脱细胞耳蜗可成功接种细胞，并进行长期培养。理论上，可采用多种动物来源的耳蜗与多种类型的细胞进行组合应用。这些组合使得本文所述技术可用于多种可能的实验设计，例如研究感觉上皮发育的组织工程应用14、新型药物制剂的药效测试24，以及耳蜗修复模型的构建25。然而，尽管这些技术具有广泛的应用前景，但仍存在一定的局限性。

当前技术的一个局限性在于灌注效果因个体而异。开发一种用于耳蜗的固定装置，并使用注射泵进行灌注，可能会提高该过程的准确性和成功率。此外，可通...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目由堪萨斯大学概念验证基金资助。我们感谢堪萨斯城（堪萨斯州）堪萨斯大学医学中心的护理人员在获取人脐带方面提供的帮助，同时感谢David Jorgensen在耳蜗培养方面的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Allegra X-14R 离心机Beckman-CoulterB08861
Intramedic 半刚性导管Becton Dickinson427401
New Brunswick Innova 2000 轨道摇床EppendorfM1190-0002
手术剪刀Fine Science Tools14060-10
精细镊子Fine Science Tools11370-40
超精细镊子Fine Science Tools18155-13
50 mL 锥形管Fisher Scientific12565271
培养皿Fisher ScientificFB087579B
U-100 胰岛素注射器Fisher Scientific14-829-1B
闪烁瓶Fisher Scientific03-341-73
旋转混匀仪Fisher Scientific88-861-049
移液管Fisher Scientific22-170-404
刀片Fisher Scientific12-640
抗生素-抗真菌剂Fisher Scientific15-240-062
青霉素-链霉素Fisher Scientific15-140-122
24 孔板Fisher Scientific07-200-84
SuperFrost PLUS 玻片Fisher Scientific12-550-15
移液管Fisher Scientific22-170-404
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂Fisher ScientificP36935
Clear-Rite 3Fisher Scientific22-046341
Thermo Scientific Forma Series II 3110 水套式 CO2 培养箱Fisher Scientific13-998-078
间充质干细胞生长培养基LonzaPT-3001
胰蛋白酶-EDTALonzaCC-3232
TPP T-75 培养瓶MidSciTP90076
TPP T-150 培养瓶MidSciTP90151
TPP T-300 培养瓶MidSciTP90301
解剖显微镜Nikon InstrumentsSMZ800
Nikon Eclipse Ts2R-FL 倒置显微镜Nikon InstrumentsMFA51010
NuAire II 级 A2 型生物安全柜NuAireNU-425-600
1X PBSSigma-AldrichP5368-10PAK
1% SDS 溶液Sigma-Aldrich436143-100G
10% EDTASigma-AldrichE9884-100G

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