用于内耳组织工程的 Decellularizing 小鼠耳蜗协议

Summary

本协议的目的是演示一种有效的方法, decellularize 和 decalcify 小鼠耳蜗作为组织工程应用的支架使用。

Abstract

在哺乳动物, mechanosensory 的毛细胞, 促进听力缺乏再生能力, 这是有限的治疗听力损失。目前的再生医学战略的重点是移植干细胞或在内耳周围的支持细胞的遗传操作, 以鼓励更换受损的干细胞, 以纠正听力损失。然而, 细胞外基质 (ECM) 在诱导和维持毛细胞功能方面可能起着至关重要的作用, 而且尚未得到很好的研究。利用耳蜗 ECM 作为培养成体干细胞的支架, 可以为细胞外环境的组成和结构对维持听觉功能的支持提供独特的见解。在这里, 我们提出了一种方法, 分离和 decellularizing 耳蜗从小鼠使用作为支架接受灌注成体干细胞。在当前的协议中, 耳蜗是从被安乐死的小鼠、细胞和脱中分离出来的。之后, 人沃顿的果冻细胞 (hWJCs), 从脐带被隔离, 仔细地灌注到每个耳蜗。耳蜗被用作生物反应器, 细胞被培养30天后进行分析处理。细胞耳蜗保留可辨认的胞外结构, 但没有揭示细胞的存在或 DNA 的明显片段。耳蜗内灌注的细胞侵入耳蜗的大部分内部和外部, 在30天的时间内没有发生任何事件。因此, 目前的方法可以用来研究如何耳蜗 ECM 影响细胞的发展和行为。

Introduction

耳蜗是一种复杂的螺旋结构, 在颞骨中发现。它是由外骨迷宫和同心, 内膜迷宫¹组成。膜迷宫包括三流体空间: scala vestibuli, scala 媒体, 和 scala 索¹。scala 媒介安置感觉上皮, 由许多细胞类型组成, 但感觉毛细胞 (HC), 传感器机械能在音波到神经冲动², 是特别感兴趣的。接触到声学创伤^3,4,5, 药物治疗⁶, 疾病^7,8, 和老化⁹都可以通过 HC 死亡导致听觉功能受损。哺乳动物的毛细胞丢失是永久性的, 不像禽 HCs, 它可以在受伤后再生¹⁰。

各种当代研究努力试图恢复失去的 HCs, 虽然具体的实验方法有所不同。在体外分化的感觉上皮和干细胞植入的基因表达的操作是该领域的主要方法, 尽管寻求将干细胞分化成耳蜗 organoids 的诱导方法已经已尝试^11,12,13。每种方法要么直接依赖干细胞, 要么是干细胞所使用的发育线索;但是, 第二个共享的和潜在的关键元素是耳蜗自身的 ECM^14,15。

ECM 不仅为细胞和组织提供物理支持, 包括细胞黏附、增殖、存活和迁移的表面, 而且在 HCs 和螺旋神经节的发育中起关键作用^{15,16 ,17}。自然发生的 ECM 提供诱导信号, 可以指导细胞表型的确定和/或细胞黏附, 增殖, 和生存¹⁸。因此, 利用细胞耳蜗结合培养 hWJCs 提供了一个独特的机会, 以探索的作用, ECM 和 HC 再生。HWJCs 是一种容易获得的, 争议细胞类型, 从人类脐带中分离出来, 表现得像间充质干细胞¹⁹。HWJCs 已经显示了区分感觉神经细胞谱系的能力^20,21。因此, 目前的协议细节的隔离, 细胞, 并灌注耳蜗从 C57BL 鼠胴体与 hWJCs 的内耳组织工程。

Protocol

所有程序, 包括动物安乐死, 都是根据批准的机构动物保护和使用委员会 (IACUC) 议定书 (针灸学 #2014-2234) 在堪萨斯大学医学中心 (KUMC) 进行的。

注: HWJCs 是从人类脐带中分离出来的, 这些患者提供了知情同意, 并按照堪萨斯大学人类科目委员会 (KU-IRB #15402) 批准的协议使用了标本。

1. 颞骨收获与耳蜗隔离

1. 斩首一个适当的安乐死, 15 周大的老鼠通过切割头骨和第一个颈椎之间的一条锋利的外科剪刀, 然后喷雾下来的头与70% 乙醇消毒 (图 1A)。
2. 用同样锋利的外科剪刀 (图 1B-c, 虚线) 在 mid-sagittal 平面上对头骨。
3. 使用一对钳 (图 1D, 箭头) 从颅骨中取出脑组织。
4. 通过存在的听觉和前庭神经根 (图 1E-F, 箭头) 的内部头骨和耳管从外部 (图 1F, 箭头) 来识别颞骨。仔细地切开头骨从头骨的剩下的人分离世俗骨头 (图 1G)。
   注意: 在某些情况下, 它可能可以微妙地撬开颅骨周围的骨骼, 而不需要切割。
5. 将细钳插入耳道的开口大约5毫米 (图 1H), 所以这些小贴士不会冒险刺穿耳蜗。轻轻地打开大的骨骼 (图 1H, 顶部红色阴影区域), 以便它断开 (图 1I, 红色虚线)。
   注: 如有必要, 解剖显微镜可以帮助这一过程, 以确保仪器的准确放置和操作。
6. 使用细钳, 撬开大从颞骨的其余部分, 露出骨迷宫的耳蜗 (图 1J, 红色括号)。
7. 在解剖范围视野下放置一个足够大的培养皿以容纳颞骨 (例如, 30 毫米或更大), 并填充足够的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 来覆盖颞骨 (如例如, 0.5 到1毫升)。
8. 淹没世俗骨头与大去除在 PBS 与耳蜗的卵形和圆的窗口朝向。
   注意: 从耳蜗中取出前庭系统是不必要的, 因为前庭系统很好地充当了操纵和定向耳蜗功能的手柄 (图 1I和图 2B)。
9. 使用超细钳, 取出镫动脉, 穿过镫。
10. 插入一个尖端的超细钳通过拱镫的地方, 动脉通过, 并微妙地解除镫向上。关节镫应该从椭圆形窗口中抬起。
11. 用一个尖端的超细钳, 刺穿椭圆形和圆形窗口。
12. 使用 1x PBS 填充28.5 口径注射器与油管 (内径0.28 毫米, 外径 0.61 mm) 连接, 定位油管在椭圆形窗口 (图 2A -b)。
    注: 管子的开口可以使用超细镊子来操纵, 以确保准确的放置。
    1. 为每个耳蜗使用新鲜的注射器和导管。
13. 灌注2毫升的10% 抗生素抗 (防) 和10% 青霉素-链霉素 (笔链球菌) 在 PBS 通过耳蜗超过5分钟, 以消除淋巴。灌注太快, 压力过大会损害耳蜗内的细微结构。
    注: 手动驾驶注射器灌注通过耳蜗的液体是有效的, 尽管灌注泵可以作为替代品使用。
    1. 如果手动灌注, 使用一对优良的, 自闭钳, 以稳定的耳蜗 (图 2A) 在灌注过程中抓住颞骨的前庭部分。
       注: 虽然不需要, 这留下双手自由处理仪器;一只手可以驱动注射器 (图 2A), 而另一个则可以适当定位油管 (图 2B)。
    2. 从这一步向前, 小心避免暴露耳蜗不必要的空气。将气泡引入流体空间会堵塞流体循环, 进一步干燥会破坏耳蜗内的细微结构。
14. 用细钳去除和丢弃剩余的肌肉组织和骨碎片。
15. 如有必要, 在4° c 的10% 防和10% 笔链球菌感染溶液中, 在 PBS 中贮存隔离耳蜗七天, 每48小时定期更换抗生素溶液。

2. 人工耳蜗加工

1. 细胞
   1. 对于每一个耳蜗, 填补一个20毫升玻璃闪烁瓶与1% 十二烷基硫酸钠 (SDS) 溶液在去 (DI) 水, 这是用来 decellularize 耳蜗。
   2. 用剃刀刀片将塑料7毫升的转移吸管的尖端切掉, 这样开口就足够大, 足以让耳蜗通过。
   3. 使用转移吸管, 轻轻地将耳蜗拉入吸管, 使其刚好通过几毫米的截边。
   4. 将耳蜗排出 1% SDS 溶液填充的闪烁小瓶。
   5. 在去 (DI) 水中循环2毫升的 1% SDS, 通过在闪烁瓶中使用转移吸管的耳蜗。
   6. 将闪烁小瓶放入转子, 并允许闪烁瓶在室温下以 10 rpm 旋转72小时。
      1. 在72小时内每24小时更换 1% SDS 溶液。改变 SDS 时要注意不要让耳蜗暴露在空气中。
   7. 用 DI 水冲洗耳蜗三次, 每次30分钟。

在用于 SDS 费用的相同闪烁瓶中进行洗涤;在这个阶段, 耳蜗是细胞的。

脱

1. 从闪烁瓶中取出剩余的 DI 水, 只留下足够的时间使耳蜗被淹没。
2. 开始脱, 增加5毫升的10% 乙酸酸 (EDTA) (0.02 米) 在 DI 水中的闪烁瓶含有的耳蜗。
3. 使用转移吸管, 通过闪烁瓶中的耳蜗在 DI 水中循环2毫升 10% EDTA。
4. 将闪烁瓶放回转子, 并允许闪烁瓶在室温下以 10 rpm 旋转72小时。在72小时内每24小时改变 10% EDTA 溶液。在改变溶液时要小心, 这样耳蜗就不会暴露在空气中。
5. 用 1x PBS 冲洗耳蜗3次, 每次2小时;在这个阶段, 耳蜗是脱的。

存储

1. 在4° c 的 PBS 中, 在10% 防、10% 笔链球菌感染溶液中储存耳蜗 72 h。
   注: 定期更换抗生素溶液可能会延长贮存期;但是, 已处理的耳蜗的扩展存储尚未在本协议中得到验证。

3. 采购和扩大 hWJCs

1. 根据以前发布的协议²²隔离 hWJCs。简单地, 将脐带分成3厘米的部分。
2. 小心地用手术刀在每个脐带段上做一个浅切口, 展开并露出沃顿的脐带果冻。用镊子取出血管。
3. 用足够的 PBS (例如, 40 毫升在60毫米的培养皿中) 冲洗脐段, 以淹没组织。用手术刀切碎的组织片段。在 low-glucose Dulbecco 氏改良的鹰培养基 (DMEM) 中, 用50毫升消化培养基 (0.2% 型2胶原酶, 1% 青霉素-链霉素) 在100毫米培养皿中消化组织。
4. 在 5% CO₂, 37 ° c 恒温箱中, 在一个轨道振动器上, 在 50 rpm 的夜间将组织放入消化介质中。第二天, 在 PBS 的2% 种抗生素抗中, 稀消化培养基的比例为 1:16, 在室温 (~ 27 ° c) 下离心 500 x g 的颗粒细胞, 为10分钟丢弃上清。
5. 骨髓间充质干细胞生长培养基 (MSCGM) 和重组细胞重颗粒。在组织培养中处理 T-75 烧瓶的密度为 7 x 10³细胞/cm²的平板细胞。文化 HWJCs 在 MSCGM, 并扩大到通过5的实验。
   注: HWJCs 可 sub-cultured 为更大的 T 型烧瓶 (如, T-150, T-300), 传代, 以提高 HWJCs 的实验产量。

4. 将 hWJCs 注入细胞耳蜗

1. 准备细胞耳蜗
   1. 使用无菌技术, 在 1x PBS 中洗涤储存的耳蜗三次, 每次30分钟。
   2. 将耳蜗转化为24孔板的独立井, 并加入1毫升的37° c 5ml MSCGM。
   3. 孵育耳蜗在 5% CO₂, 37 ° c 细胞培养孵化器为至少 1 h 在注入细胞之前。
2. 离解 hWJCs 和重
   1. 清洗 hWJCs 与37° c 5ml 1x PBS 两次。
   2. 添加足够的37° c 5ml 胰蛋白酶与 0.5% EDTA 覆盖细胞血管表面。
   3. 孵育 hWJCs 5 分钟, 在 5% CO₂, 37 ° c 细胞培养孵化器。
      1. 通过倒置显微镜观察细胞, 验证90% 的细胞是否与细胞培养表面分离。
         注意: 当培养容器被轻轻拍打时移动的细胞已经分离。保持静止的细胞, 没有分离。
      2. 轻轻地敲击烧瓶的两侧, 以进一步去除附着的细胞。
   4. 采用无菌技术, 将 hWJCs 从培养容器转移到50毫升的圆锥管, 其中含有相当于 MSCGM 的体积, 以用于游离细胞的胰蛋白酶。
   5. 在室温 (〜27° c) 下, 离心在 500 x g 的 hWJCs 为5分钟。
   6. 吸气上清, 和重 hWJCs 在 MSCGM 的浓度为50万细胞/毫升。
3. 灌注耳蜗
   1. 转移耳蜗到一个新的24井板使用转移吸管。
   2. 在每个耳蜗上加一滴 MSCGM, 防止耳蜗干燥。
   3. 用超细镊子巧妙地定位耳蜗, 使椭圆形和圆形的窗户朝上。
      注意: 当耳蜗容易受损时, 直接处理耳蜗时要格外小心。
   4. 使用一个无菌28.5 口径胰岛素注射器与连接的油管, 绘制0.2 毫升悬浮 hWJCs (10万细胞)。
   5. 使用灭菌的细钳, 放置在椭圆形窗口的油管。
   6. 微妙和缓慢灌注的耳蜗与0.2 毫升的悬浮 hWJCs 使用28.5 口径胰岛素注射器连接到聚乙烯管 (外径: 0.61 毫米, 内径: 0.28 毫米) 在大约5分钟。
   7. 灌注后, 将0.8 毫升的37° c 5ml MSCGM 到含有耳蜗的井中, 使井内总容积增加到1毫升。
   8. 对每一个耳蜗重复步骤 4.3. 3-4. 3.7, 每次使用新鲜的注射器和导管。
   9. 放置灌注耳蜗在 5% CO₂, 37 ° c 细胞培养孵化器, 并改变媒体每周三次。

5. 耳蜗的采集和保存

注: 耳蜗可在任何时间点培养和收获30天 post-perfusion。

1. 为了保存耳蜗, 在一个摇摆平台上, 在4° c 的晚上, 在 1x PBS 中修复4% 甲醛。
2. 固定后, 用 1x PBS 清洗耳蜗三次, 每次5分钟。
3. 在石蜡包埋之前, 用乙醇和脂肪烃溶剂逐渐将耳蜗脱水。
4. 截面样品的厚度为10µm 使用切片和安装在玻璃显微镜幻灯片。
   注: 样品现在可以使用标准的协议进行组织学或免疫组织化学处理。

Results

使用这里提出的方法, 成功的细胞耳蜗评估通过检查是否存在或没有 DNA 通过 4, 6-diamidino-2-吲 (DAPI) 染色。如果在细胞耳蜗内没有发现 DNA, 耳蜗被认为是完全细胞的。以前的实验中, 没有经过细胞或脱的原生耳蜗被用作一种阳性对照, 用以说明传统上在 C57BL 鼠耳蜗中发现的结构和细胞。细胞-脱耳蜗, 没有任何 hWJCs 注入, 被用作负控制。在组织切片的任何区域 (图 3) 均未观察到可量化的 DAPI 染色细胞核。两个耳蜗是细胞和脱, 然后注入 hWJCs 为当前项目。细胞-脱耳蜗灌流 hWJCs 被观察到有许多 DAPI 染色核内耳蜗和成长的骨外壳外的耳蜗 (表 1)。第一耳蜗细胞的总估计细胞密度为113759细胞/耳蜗后30天的培养 (图 4和图 5) 和第二个耳蜗是118732细胞/耳蜗后30天的文化 (

Discussion

我们已经成功地证明, 原生耳蜗细胞可以通过细胞的过程从耳蜗中移除, 这使得耳蜗的使用成为一个复杂的三维组织支架。桑蒂et al。¹⁵开发了 decellularizing 耳蜗的初始方法, 并通过光片显微镜²³精确估计了许多耳蜗结构的体积。这种早期的工作为组织工程和细胞培养技术提供了强有力的基础。细胞耳蜗可以成功地注入细胞, 然后培养一段长时间。从理论上讲, 耳蜗从大量的动物中可以与同样广泛的细胞类型结合使用。这些组合允许在这里提出的技术被用于许多可能的实验设计, 如组织工程应用, 检查感觉上皮细胞发育¹⁴, 新药药物检测的新药物,²⁴, 并开发人工耳蜗修复模型²⁵。然而, 尽管这些技术具有广泛的适用性, 但它们并非没有限制。

目前技术的局限性之一是, 灌注是基于个体的变量。开发一个持有人, 为耳蜗, 并使用注射器泵进行显影可能...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allegra X-14R 离心机	Beckman-Coulter	B08861
Intramedic 半刚性管	Becton Dickinson	427401
New Brunswick Innova 2000 轨道沙尺	Eppendorf	M1190-0002
手术剪刀	精细科学工具	14060-10
精细镊子	精细科学工具	11370-40
超细镊子	Fine Science Tools	18155-13
50 mL 锥形管	Fisher Scientific	12565271
培养皿	Fisher Scientific	FB087579B
U-100 胰岛素注射器	Fisher Scientific	14-829-1B
闪烁瓶	Fisher Scientific	03-341-73
旋转器	Fisher Scientific	88-861-049
移液管	Fisher Scientific	22-170-404
剃须刀片	Fisher Scientific	12-640
抗生素-抗真菌剂	Fisher Scientific	15-240-062
青霉素-链霉素	Fisher Scientific	15-140-122
24 孔板	Fisher Scientific	07-200-84
SuperFrost PLUS 玻璃显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
移液管	Fisher Scientific	22-170-404
ProLong Gold 抗淬灭封固剂，含 DAPI	Fisher Scientific	P36935
Clear-Rite 3	Fisher Scientific	22-046341
Thermo Scientific Forma 系列 II 3110 水接头 CO2 培养箱	Fisher Scientific	13-998-078
间充质干细胞生长培养基		Lonza PT-3001
胰蛋白酶-EDTA	Lonza	CC-3232
TPP T-75 培养瓶	MidSci	TP90076
TPP T-150 培养瓶	MidSci	TP90151
TPP T-300 培养瓶	MidSci	TP90301
解剖显微镜	尼康仪器	SMZ800
尼康 Eclipse Ts2R-FL 倒置显微镜	尼康仪器	MFA51010
NuAire II 类，A2 型生物安全柜	NuAire	NU-425-600
1X PBS	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
1% SDS 溶液	Sigma-Aldrich	436143-100G
10% EDTA	Sigma-Aldrich	E9884-100G