本文介绍了一种钌基线粒体钙摄取抑制剂的合成、纯化与表征方法，并演示了其在通透化哺乳动物细胞中评估药效的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
我们详细描述了一种线粒体钙摄取抑制剂[(OH2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+的合成与纯化方法。该化合物的优化合成以[Ru(NH3)5Cl]Cl2为起始原料，在密闭容器中使用1 M NH4OH进行反应，得到绿色溶液。通过阳离子交换色谱法完成纯化。该化合物经紫外-可见吸收光谱和红外光谱表征，并确认其纯度。其线粒体钙摄取抑制活性在通透化的HeLa细胞中通过荧光光谱法进行评估。
引言
线粒体钙是调控多种对正常细胞功能至关重要的生理过程的关键调节因子，包括能量生成和细胞凋亡。1,2,3 线粒体钙单向转运体（MCU）是一种定位于线粒体内膜的离子转运蛋白，负责调控钙离子向线粒体基质内的流入。4,5,6 针对MCU的化学抑制剂是研究该转运蛋白及线粒体钙功能与细胞作用的重要工具。化合物[(HCO2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(O2CH)]3+（Ru360）是目前已知少数具有选择性的MCU抑制剂之一，其报道的Kd值为24 µM。7,8,9,10 该复合物常作为商业化的三联吡啶红（ruthenium red, Ru....
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方案
注意：本合成过程中使用浓酸和浓碱。进行反应时，应采取所有适当的安全措施，包括使用工程控制设备（通风橱）和个人防护装备（PPE），如护目镜、手套、实验服、长裤和封闭式鞋履。
1. [(OH2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5 的制备
- [Ru(NH3)5Cl]Cl2的合成3)5Cl]Cl2 12
- 溶解 1.00 g RuCl3·nH2O（按重量计含40% Ru，4.1 mmol）溶于5 mL H2O. 将深棕色溶液冷却至 0 °在冰浴中冷却。逐滴加入11 mL（0.23 mol）80%水合肼溶液。初始反应剧烈，伴有气体释放，得到棕色溶液。将所得溶液在室温下搅拌16小时，最终溶液呈深红色。
警告：肼具有急性毒性和致癌性。此外，该试剂的无水形式具有爆炸性。操作时务必使用适当的个人防护装备和通风橱。切勿将这些溶液浓缩至干。 - 向该溶液中加入约5-10 mL浓盐酸，调节pH至2。此时溶液呈黄褐色。
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- 溶解 1.00 g RuCl3·nH2O（按重量计含40% Ru，4.1 mmol）溶于5 mL H2O. 将深棕色溶液冷却至 0 °在冰浴中冷却。逐滴加入11 mL（0.23 mol）80%水合肼溶液。初始反应剧烈，伴有气体释放，得到棕色溶液。将所得溶液在室温下搅拌16小时，最终溶液呈深红色。
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结果
本方法描述了一种线粒体钙摄取抑制剂[(OH2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5的合成路线，起始原料为[Ru(NH3)5Cl]Cl2，这是一种已知的三价钌起始物料。[Ru(NH3)5Cl]Cl2通过红外光谱进行表征，其振动峰位于3200 cm-1、1608 cm-1、1298 cm-1和798 cm-1（图1）。在2069 cm-1处的微小杂质峰可归因于[Ru(NH3)5N2]Cl3。该Ru(III)化合物与1 .......
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讨论
线粒体钙离子摄取抑制剂[(OH2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5可由已知的三价钌起始原料[Ru(NH3)5Cl]Cl2合成，具体方法如本实验方案所述。[Ru(NH3)5Cl]Cl2的合成过程简单，易于实现。将RuCl3在水合肼中搅拌16小时后，需用HCl将溶液pH值调节至2。pH值的降低对于获得目标产物至关重要。如需要，可通过在HBr中回流代替HCl，对本合成方法进行修改以制备[Ru(NH3)5Br]Br2。
在合成线粒体钙摄取抑制剂的过程中，我们观察到一些可减少不期望副产物生成的策略。值得注意的是，保持反应瓶加盖对该反应的成功至关重要；如果反应瓶敞口，会生成包括钌红（RuRed）在内.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
本研究由康奈尔大学资助。本工作使用了康奈尔材料研究中心共享设施，该设施通过美国国家科学基金会MRSEC项目（资助号DMR-1120296）获得支持。S.R.N. 感谢美国国家科学基金会研究生研究奖学金（资助号DGE-1650441）的支持，并感谢Dave Holowka博士在钙离子实验中提供的帮助。本文所表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者（或作者们）的观点，不一定反映美国国家科学基金会的立场。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 三氯化钌水合物 | Pressure Chemical | 3750 | |
| 浓盐酸 | J.T. Baker | 9535 | |
| 浓氨水 | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 目 | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| 皂苷 | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| 琥珀酸钠 | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| 葡萄糖 | Aldrich | G5000 | |
| 200 mL 圆底烧瓶 | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| 玻璃塞 | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm × 15 cm 带储液器的玻璃层析柱 | 定制 — 类似于 Chemglass 层析柱 | 类似于 CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 圆底 Falcon 管 | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 培养皿 | Corning | 431110 | |
| 台盼蓝 | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| 血细胞计数板 | Aldrich | Z359629 | |
| 丙烯酸比色皿 | VWR | 58017-875 | |
| 紫外-可见分光光度计 | Agilent Model Cary 8454 | ||
| 荧光分光光度计 | SLM Model 8100C | ||
| 红外光谱仪 | Bruker Hyprion FTIR 配备 ATR 附件 | ||
| 离心机 | ALC Model PM140R | ||
| 倒置光学显微镜 | VWR | 89404-462 |
参考文献
- De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
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