方法文章

钌基线粒体钙摄取抑制剂的合成与评价

DOI：

10.3791/56527

⸱

2017年10月26日

 , 
1Department of Chemistry and Chemical Biology, Cornell University

本文内容

摘要

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本文介绍了一种钌基线粒体钙摄取抑制剂的合成、纯化与表征方法，并演示了其在通透化哺乳动物细胞中评估药效的实验方案。

摘要

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我们详细描述了一种线粒体钙摄取抑制剂[(OH2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+的合成与纯化方法。该化合物的优化合成以[Ru(NH3)5Cl]Cl2为起始原料，在密闭容器中使用1 M NH4OH进行反应，得到绿色溶液。通过阳离子交换色谱法完成纯化。该化合物经紫外-可见吸收光谱和红外光谱表征，并确认其纯度。其线粒体钙摄取抑制活性在通透化的HeLa细胞中通过荧光光谱法进行评估。

引言

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线粒体钙是调控多种对正常细胞功能至关重要的生理过程的关键调节因子，包括能量生成和细胞凋亡。1,2,3 线粒体钙单向转运体（MCU）是一种定位于线粒体内膜的离子转运蛋白，负责调控钙离子向线粒体基质内的流入。4,5,6 针对MCU的化学抑制剂是研究该转运蛋白及线粒体钙功能与细胞作用的重要工具。化合物[(HCO2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(O2CH)]3+（Ru360）是目前已知少数具有选择性的MCU抑制剂之一，其报道的Kd值为24 µM。7,8,9,10 该复合物常作为商业化的三联吡啶红（ruthenium red, RuRed）中的常见杂质存在；RuRed是一种三钌双-µ-氧桥接的六价阳离子化合物，分子式为[(NH3)5Ru(µ-O)Ru(NH3)4(µ-O)Ru(NH3)5)]6+，也曾被用作钙摄取抑制剂。尽管Ru360可从商业途径获得，但其价格极为昂贵。此外，Ru360的合成与分离过程因纯化步骤困难以及表征方法不明确而面临挑战。

我们最近报道了合成 Ru360 类似物 [(OH2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5 的替代方法11。该化合物抑制线粒体钙单向转运体（MCU）的亲和力较高，与 Ru360 相似。在本实验方案中，我们将描述该化合物最有效的合成路线，起始原料为 [Ru(NH3)5Cl]Cl2。文中详细说明了使用强酸性阳离子交换树脂纯化产物的步骤，并列出了该操作中常见的问题。我们还提供了化合物的表征方法和纯度评估手段，并阐述了一种检测其阻断线粒体钙摄取功效的简便方法。

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方案

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注意：本合成过程中使用了浓酸和浓碱。进行反应时，应采取所有适当的安全措施，包括使用工程控制设备（通风橱）和个人防护装备（PPE），如安全眼镜、手套、实验服、长裤和封闭式鞋履。

1. [(OH2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5 的制备

  1. [Ru(NH₃)₆]³⁺的合成3)5Cl]Cl2 12
    1. 溶解 1.00 g RuCl3·nH2O（按重量计40% Ru，4.1 mmol）溶于5 mL H2O. 将深棕色溶液冷却至 0 °在冰浴中冷却。逐滴加入11 mL（0.23 mol）80%水合肼溶液。初始反应剧烈，有气体产生，得到棕色溶液。将所得溶液在室温下搅拌16小时，最终溶液呈深红色。
      警告：肼具有急性毒性和致癌性。此外，该试剂的无水形式具有爆炸性。操作时务必使用适当的个人防护装备和通风橱。切勿将这些溶液浓缩至干。
    2. 向该溶液中加入约5-10 mL浓盐酸，调节pH至2。此时溶液呈黄棕色。
    3. 将该溶液在105℃加热 °C，同时搅拌1–2小时。溶液中将析出黄色固体。当不再有明显沉淀生成时，停止加热。
    4. 让反应混合物冷却至室温，然后放入0 ℃ °在冰浴中冷却10分钟。通过减压过滤收集黄色固体，并分别用5 mL乙醇和二乙醚各洗涤一次。
    5. 将粗产物完全溶解于15–25 mL热水中。取10 mL浓盐酸溶液置于滤瓶中，并将其置于冰浴中冷却。将黄色溶液过滤至预冷的盐酸溶液中，以促使淡黄色纯品固体析出。过滤所得沉淀，并依次用0.5 M盐酸、乙醇和乙醚各5 mL洗涤。
    6. 使用红外光谱表征该化合物。通过在 3226 cm⁻¹ 处识别伸缩振动频率来验证纯度。-1，1604 cm-1，1297 cm-1，以及 801 cm-1在2069 cm⁻¹处的一种常见微量杂质-1 被分配给 [Ru(NH3)5N2]Cl3.
  2. [(OH2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4（OH2)]Cl5
    1. 溶解 100 mg (0.34 mmol) [Ru(NH3)5Cl]Cl2 在50 mL的1 M NH₄Cl溶液中4OH置于200 mL厚壁圆底耐压反应瓶中。用塞子松松地盖住烧瓶，并将反应混合物在75 ℃下加热 °在6小时内升温至C。停止加热，在室温下搅拌4天，得到深绿色溶液。
      注意！加热密闭容器会导致压力积聚。务必使用适合耐压的安全玻璃器皿。本反应中密封容器的目的是尽量减少气态 NH 的损失。3因此，应将塞子 loosely 放置，以释放多余压力。
  3. 阳离子交换色谱纯化
    1. 在25 mL烧杯中，加入5 g阳离子交换树脂（例如Dowex 50WX2 200-400目（H⁺型））+ 在10 mL 0.1 M HCl中溶解。
    2. 将该浆液装入一个10 mL层析柱（直径10 mm，高15 cm），柱上连接50 mL溶剂储液器。用约20–30 mL的0.1 M HCl洗涤树脂，直至流出液无色。
    3. 回到步骤1.2.1中分离得到的绿色反应溶液。向该溶液中加入浓HCl，调节pH至2，此时溶液颜色变为棕色。
    4. 将此酸化溶液用移液器轻轻加至1.3.2步骤中制备好的阳离子交换树脂柱顶部。待洗脱液完全流尽后，继续加入溶液。重复此过程，直至全部溶液加完。树脂顶部将变为深棕色至黑色，树脂体积略有缩小。
    5. 使用玻璃珠覆盖树脂顶部，以防止添加新溶液时扰动树脂。
    6. 用20 mL 1 M HCl洗脱层析柱。
    7. 用1.5 M盐酸溶液增加浓度洗脱柱子（≈ 50 mL）。此时将有黄色溶液开始从层析柱中流出。将 HCl 浓度提高至 2 M，继续洗脱，直至洗脱液无色或呈极淡的黄绿色。此过程共需 150–200 mL 洗脱液体积。
    8. 将 HCl 浓度提高至 2.5 M（20–50 mL），用试管分段收集洗脱液。再将 HCl 浓度升至 3 M。产物将以绿色至棕色溶液的形式从柱中洗脱。可能会有红棕色组分开始从柱中流出，这些组分为被氧化的钌红杂质，切勿与绿色至棕色组分混合收集。
  4. [(OH的表征与纯度验证2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5
    1. 检测步骤 1.3.8 中获得的所有组分的紫外-可见光谱。为完成此操作，加入 100 µ将给定组分的 L 加入 2 mL 3 M NH3 中，混匀后进行紫外-可见光谱分析。含有纯产物的组分在 360 nm 处呈现强吸收峰，在 600 nm 处吸收较弱。480 nm 处的吸收表明存在氧化型钌红，533 nm 处的吸收则分别指示钌红杂质的存在。
    2. 合并含有纯产物的馏分，并通过旋转蒸发将溶液蒸干。产物为绿色至棕色固体。产率通常为5-15 mg（10-20%）。通过将乙醇蒸气扩散至该化合物的水溶液中，可获得适合X射线衍射分析的单晶。
    3. 通过紫外-可见光谱法在 pH 7.4 的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中分析化合物以验证其纯度。可通过测定 360 nm 与 600 nm 处吸收峰强度的比值来评估纯度。纯品的该比值为 31，而不纯的样品比值将较小。
    4. 通过红外光谱法对样品进行固态分析。诊断性吸收峰位于 3234 cm⁻¹。-1，3151 cm-1，1618 cm-1，1313 cm-1，以及 815 cm-1常见的杂质谱带出现在 1762 cm⁻¹-1 和 1400 cm-1，为NH的特征4Cl. Ruthenium red 可通过 1404 cm⁻¹ 处的谱带进行鉴定-1，1300 cm-1，1037 cm-1 和 800 cm-1.
  5. 利用荧光光谱法评估线粒体钙离子摄取的抑制作用
    注意！以下实验操作涉及哺乳动物细胞。应在经过认证适用于生物安全等级2（BSL2）研究的生物安全柜中进行操作。
    ​注意：[(OH2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5 在本节中将简称为[Ru]
    1. 配制含葡萄糖的缓冲盐溶液（BGSS）作为检测培养基。BGSS 是一种包含 110 mM KCl、1 mM KH2PO4，1 mM MgCl2，20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），5 mM 琥珀酸钠，30 µM 乙二醇双(β-氨基乙基醚-N,N,N',N'四乙酸（EGTA）。除EGTA外，将其他成分混合并调节pH至7.4，加入EGTA后再次调节pH至7.4。配制50 mL检测培养基时，加入0.5 mL浓度为1 mg/mL的葡萄糖。
    2. 在500 cm²培养瓶中培养HeLa细胞2 在含10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，置于含5% CO₂的湿化培养箱内的培养皿中2 37℃ °C. 将生长在100 mm培养皿中的HeLa细胞接种至500 cm²培养瓶中进行扩增2 培养皿。大培养皿中的总培养基体积为115 mL。每个大培养皿可获得约1800万细胞，足以进行两次荧光光谱实验。
      1. 将细胞培养至融合度达到90-95%。移除培养基，用15 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。加入15 mL含1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS，孵育10分钟以使细胞脱落。将细胞转移至14 mL圆底离心管中
    3. 使用台盼蓝和血细胞计数板，在倒置显微镜下对细胞进行计数，计算细胞总数以及达到每1.8 mL培养基中含有750万个细胞所需的培养基体积。将细胞以5310 × g离心10分钟 × g. 小心倾去上清液，加入计算好的体积的BGSS。轻柔重悬细胞。
      1. 对于本实验，配制 40 mM 皂苷（digitonin）的二甲基亚砜（DMSO）储存液，以及 1 mM Calcium Green-5N 的 H2O和10 mM CaCl2 在 H2O. [Ru] 储备液用纯水配制，浓度范围为1-3 mM。
        ​注意：Calcium Green-5N 对光敏感，需避光保存并尽量减少光照暴露。
    4. 将荧光分光光度计设置为激发波长506 nm，发射波长532 nm，并将比色皿支架温度控制在37℃ °C. 准备一个带搅拌子或搅拌轮的丙烯酸比色皿，加入1.5.2步骤中制备的1.8 mL细胞悬液，1.8 µL 十二烷基麦芽糖苷溶液，3.6 µL 钙绿-5N（溶液），和 9 µL [Ru]（配制1 mM 储存液，5 µM 终浓度）。在荧光计中孵育细胞 15 分钟。
      1. 将数据读取为激发/发射比值，而非原始吸收值。这种做法可最大限度地减少因光源强度波动而产生的误差。
      2. 在不添加[Ru]的情况下进行第一次样品分析，以测定加入CaCl的影响2 细胞反应
      3. 使用1.5.4节所述设置在荧光计上开始分析。等待约2分钟以建立稳定的发射基线，然后加入1.8 µL of CaCl2 (10 µM 终浓度）。加入 CaCl 后，发射强度将立即增强。2，随后随着钙离子进入线粒体，信号将在数分钟内逐渐衰减。等待衰减过程完成（≈5 分钟）。加入额外的钙脉冲，以确定未经 [Ru] 处理的细胞的线粒体钙摄取反应。
    5. 在另一支含有5的比色皿中 µM [Ru]，按照上述1.5.4.3中的描述重复实验。在抑制剂存在的情况下，发射强度将增加，但不会衰减。该现象表明线粒体钙离子摄取被阻断。

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结果

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本方法描述了从已知的三价钌起始原料[Ru(NH3)5Cl]Cl2出发，合成线粒体钙摄取抑制剂[(OH2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5的步骤。[Ru(NH3)5Cl]Cl2通过红外光谱进行表征，其振动模式分别位于3200 cm-1、1608 cm-1、1298 cm-1和798 cm-1（图1）。在2069 cm-1处的小杂质峰可归因于[Ru(NH3)5N2]Cl3。该Ru(III)化合物与1 M NH

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讨论

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线粒体钙离子摄取抑制剂[(OH2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5可由已知的三价钌起始原料[Ru(NH3)5Cl]Cl2合成，具体方法如本实验方案所述。[Ru(NH3)5Cl]Cl2的合成过程简单，易于实现。将RuCl3在水合肼中搅拌16小时后，需用HCl将溶液pH值调节至2。pH值的降低对于获得目标产物至关重要。如需要，可通过在HBr中回流代替HCl，对本合成方法进行修改以制备[Ru(NH3)5Br]Br2。

在合成线粒体钙摄取抑制剂的过程中，我们观察到一些可减少不期望副产物生成的策略。值得注意的是，保持反应瓶加盖对该反应的成功至关重要；如果反应瓶敞口，会生成包括钌红（RuRed）在内...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露

致谢

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本研究由康奈尔大学资助。本工作使用了康奈尔材料研究中心共享设施，该设施通过美国国家科学基金会MRSEC项目（资助号DMR-1120296）获得支持。S.R.N. 感谢美国国家科学基金会研究生研究奖学金（资助号DGE-1650441）的支持，并感谢Dave Holowka博士在钙离子实验中提供的帮助。本文所表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者（或作者们）的观点，不一定反映美国国家科学基金会的立场。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
三氯化钌水合物Pressure Chemical3750
浓盐酸J.T. Baker9535
浓氨水Mallinckrodt Chemical WorksA669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 目Alfa Aesar13945
Calcium Green 5NInvitrogenC3737
皂苷Aldrich260746
DMSOAldrich471267
EGTAAldrichE3889
KClUSB20598
KH2PO4AldrichP3786
MgCl2Fisher ScientificM33-500
HEPESFluka54466
琥珀酸钠Alfa Aesar33386
EDTAJ.T. Baker8993-01
葡萄糖AldrichG5000
200 mL 圆底烧瓶ChemGlassCG-1506-14
玻璃塞ChemGlassCG-3000-05
10 mm × 15 cm 带储液器的玻璃层析柱定制 — 类似于 Chemglass 层析柱类似于 CG-1203-20
DMEMCorning10-017-CV
FBSGibco10437028
PBSCorning21-040-CV
圆底 Falcon 管Fisher Scientific14-959-11B 
500 cm2 培养皿Corning431110
台盼蓝ThermoFisher Scientific15250061
血细胞计数板AldrichZ359629
丙烯酸比色皿VWR 58017-875
紫外-可见分光光度计Agilent Model Cary 8454 
荧光分光光度计SLM Model 8100C
红外光谱仪Bruker Hyprion FTIR 配备 ATR 附件
离心机ALC Model PM140R
倒置光学显微镜VWR 89404-462

参考文献

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