基于蓝光照射诱导甲臜沉淀的DNA染色方法

摘要

该方法通过将凝胶浸泡在SYBR Green I/氮蓝四唑溶液中，然后暴露于阳光或蓝光光源下，实现对凝胶中DNA的选择性染色和定量。该过程可产生可见的沉淀物，且几乎不需要任何设备，非常适合野外使用。

摘要

DNA染色方法在生物医学研究中具有重要意义。我们设计了一种简单的方法，通过形成有色沉淀物，实现肉眼直接观察DNA。该方法通过将丙烯酰胺凝胶或琼脂糖DNA凝胶浸泡在含有1x（相当于2.0 µM）SYBR Green I（SG I）和0.20 mM硝基蓝四氮唑的溶液中，随后暴露于日光或特定的蓝光下，生成紫色的甲臜沉淀。此外，我们还利用耐氨苄青霉素的质粒在经本方法染色的琼脂糖凝胶中进行了DNA回收实验。与传统的使用紫外光照射SG I染色的方法相比，本方法获得的菌落数量更多。该方法快速、特异性强、对DNA无毒性，无需使用透射式紫外灯即可实现生物分子的“肉眼”观察，且成本低廉，适用于野外现场应用。基于上述优点，这种新型DNA染色方法在科研与工业领域均具有潜在的应用价值。

引言

随着生物化学与分子生物学的进步，涉及DNA的研究需要更优的技术来分析DNA。最早的DNA染色方法是银染法，该方法灵敏度很高，但缺乏选择性，且无法回收样品。随后，荧光DNA染色技术的发展实现了对DNA的选择性定量，并可实现样品回收。最早用于DNA定量的荧光染料之一是溴化乙锭¹，其具有致突变性²。然而，目前已有更安全、更灵敏的新型荧光染料，如GelRed和SYBR Green I（SG I）³；但这些荧光染料均需使用紫外（UV）透射仪或荧光计进行检测。

还有其他可用于直观染色DNA的技术，例如亚甲蓝⁴和结晶紫^5,6,7,8,9，但这些方法均存在灵敏度和选择性较低的问题。四氮唑盐是一类易被还原的有机化合物，还原后会形成不溶性的有色甲臜沉淀^10,11。最近研究表明，某些二价四氮唑盐因其带正电荷的四氮唑环能够与DNA结合¹²。

在最近的一项研究中¹³，提出了一种新的可见光染色技术，用于在聚丙烯酰胺凝胶中染色并定量DNA，该方法利用二价四氮唑盐——硝基蓝四氮唑（NBT）的还原反应，并结合荧光染料如溴化乙锭、GelRed、SYBR Green I 和 SYBR Gold。该反应在蓝光或日光下即可进行，与使用SG I结合紫外透射仪的方法相比，可实现更高质量的样品回收。本文的目的是提供一种基于四氮唑盐的染色技术的详细实验方案。

方案

1. 凝胶的制备与电泳运行

1. 使用 Sambrook 和 Russell 所述的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）配方制备非变性12%聚丙烯酰胺凝胶¹⁴ 但使用水代替SDS。
   1. 配制5 mL分离胶，需使用1.7 mL蒸馏水、2 mL丙烯酰胺/双丙烯酰胺（30/0.8% w/v）、1.3 mL 1.5 M Tris（pH 8.8）、0.05 mL 10%过硫酸铵和0.002 mL TEMED。
   2. 准备2 mL浓缩胶，需使用1.5 mL水、0.33 mL丙烯酰胺/双丙烯酰胺（30/0.8% w/v）、0.25 mL 1 M Tris（pH 6.8）、0.02 mL 10%过硫酸铵和0.002 mL TEMED。凝胶尺寸为7.3 cm × 8.2 cm × 0.075 cm（长 × 宽 × 厚）。
      注意： 使用厚度为 0.75 mm 的 15 孔梳子可获得最佳灵敏度。
2. 向一个1.5 mL微量离心管中加入适量的6x上样缓冲液和DNA样品例如 使用1 µL的6x上样缓冲液与5 µL的DNA样本混合。
3. 将凝胶放入垂直电泳槽中。
   1. 向电泳槽中加入 750 mL 1×TAE 缓冲液以同时运行 2 块凝胶。配制 1 L 50×TAE 缓冲液时，使用 442 g Tris 碱、57.1 mL 冰醋酸和 100 mL 0.5 M EDTA（pH 8.0），加蒸馏水定容至 1 L。
   2. 将样品加入凝胶中，在100 V电压下电泳运行2小时。
4. 或者，使用 Sambrook 中提供的配方制备 1x TAE 琼脂糖凝胶¹⁴.
   1. 向水平电泳槽中加入 300 mL 1x TAE 缓冲液。在 100 V 电压下电泳运行 45 分钟。

2. NBT-SG I 染色（图1）。

1. 丙烯酰胺凝胶染色。
   1. 配制溶液：0.1% w/v NBT 和 1.2x SG I。
      注意：可以使用溴化乙锭、GelRed 或 SYBR Gold 代替 SG I，但 SG I 的表现最佳。
   2. 将 16.75 mL 的 1.2x SYBR Green I 溶液倒入适当大小的容器中。
      注意：我们使用移液枪吸头盒的盖子作为容器，这些体积是根据该容器的尺寸计算得出，以确保完全覆盖凝胶；其尺寸为 11.6 cm × 7.6 cm × 2.6 cm（长 × 宽 × 深）。
   3. 将凝胶放入溶液中。加入 3.25 mL 的 0.1% w/v NBT 溶液，使最终浓度为 0.2 mM NBT 和 1x（相当于 2.0 µM）SG I。
   4. 用塑料薄膜密封容器，再用铝箔完全包裹容器，以隔绝环境光。
      注意：塑料薄膜用于防止溶液溅出，并避免铝箔与染色液发生反应。
   5. 在 60 rpm 的摇床上振荡 25 分钟。
   6. 移除铝箔和塑料封膜。暴露于阳光下，最长不超过 90 分钟。每 5 分钟检查一次，直至目标条带显现。
   7. 若使用蓝光照射，准备一块带有 3 个发光二极管（LED）的原型电路板，将 LED 置于距凝胶表面约 5 mm 处（需持续观察染色过程，因为所需时间取决于 LED 光源的强度）。
2. 琼脂糖凝胶染色。
   1. 按照第 1.4 节所述方法制备并电泳一块 1% 琼脂糖凝胶（尺寸为 1 cm × 6.2 cm × 7 cm；长 × 宽 × 深），然后按照步骤 2.1 的相同流程操作，但作如下修改：
   2. 将 41.9 mL 的 1.2x SG I 溶液倒入移液枪吸头盒的盖子中（尺寸为 11.6 cm × 7.6 cm × 2.6 cm；长 × 宽 × 深），再加入 8.1 mL 的 0.1% NBT 溶液。
   3. 用塑料薄膜密封容器，再用铝箔完全包裹容器，以隔绝环境光。
   4. 在 60 rpm 的摇床上振荡 1 小时。

3. 数据分析。

1. NBT-SG I 标准曲线。
   1. 以 1200 dpi 的分辨率扫描获得凝胶图像。
   2. 打开图像分析软件，使用图像编辑器校正图像，然后进行图像密度测定。
   3. 计算曲线下面积，绘制信号值/最大信号值（Signal/Signal_Max）相对于 DNA 浓度的图表。

4. DNA 回收。

1. 按照 Sambrook¹⁴ 中提供的配方，制备 1% 琼脂糖凝胶（使用 1x TAE 缓冲液）。
2. 向水平电泳槽中加入 300 mL 1x TAE 缓冲液。按照 图 2 所示方案，加入 4 µL 浓度为 100 ng/µL 的 pDJ100¹⁵ 质粒和 DNA marker。在 100 V 电压下电泳运行 1 小时。
3. 标记并称量两个 2 mL 微量离心管。
4. 将凝胶从中间切开，得到两个相同的半片，每半片均应包含 DNA marker 和样品质粒，以便比较不同的染色技术。图 2 显示了示意图。
5. 按照步骤 2 的方法，用 NBT-SG I 对其中一半凝胶进行染色。
   1. 使用洁净的手术刀切下质粒条带。将凝胶片段保存在一个管中并称重。
6. 用 50 mL 1x SG I 溶液对另一半凝胶进行染色，并在避光条件下缓慢振荡（60 rpm）1 小时。
   1. 将凝胶置于凝胶成像仪上，曝光 2 分钟。使用洁净的手术刀切下质粒条带。
   2. 将凝胶片段保存在另一个管中并称重。
      注意： 此处可暂停实验流程，将离心管保存于 -20 °C 条件下。
7. 使用 commercially available 的凝胶回收试剂盒进行质粒提取。

5. 质粒归一化。

1. 在1.5 mL离心管中，加入10 µL提取的质粒和60 µL I型水。混匀后转移至60 µL石英比色皿中，或直接取2 µL用于Nanodrop检测。
2. 在 230 至 320 nm 范围内测定吸收光谱。使用以下公式计算样品的质粒浓度：
   
   其中 D 是所应用的稀释倍数（此处为 70/10）， A_x 是吸收在 x nm，50 是用于将双链 DNA 转换为 µg/mL 的换算系数。
3. 将样品稀释至 9.1 ng/µL。
4. 转化 大肠杆菌 (E. coli) 感受态细胞 (例如 XL10 Gold）按照Inoue转化程序进行¹⁶ 使用5 µL稀释后的样品。
5. 统计培养皿上的菌落数量并记录稀释倍数。使用以下公式计算菌落形成单位（CFU）¹⁷:
   
   其中 D 是初始培养物所应用的稀释倍数。
6. 进行非配对 t 检验。

结果

在DNA所在位置会出现紫色的甲臜沉淀（经质谱法验证¹³）。实验中加载了DNA Marker以绘制标准曲线（图3）。该方法适用于聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶，但在琼脂糖凝胶中的显色强度较低且所需时间较长。然而，使用琼脂糖凝胶可通过市售试剂盒回收样品，且不影响后续提取过程。采用蓝光LED结合本方法回收的样品质量优于使用透射仪配合SG I染料所得的样品（图4）。

讨论

本文介绍了一种基于NBT还原和SG I染色的灵敏且新颖的DNA染色方法。该方案的关键步骤是凝胶在NBT-SG I溶液中的孵育时间以及NBT的浓度。由于琼脂糖凝胶比聚丙烯酰胺凝胶更厚，因此其染色时间更长。该方法在存在SDS时不适用，因为NBT会与SDS接触后发生沉淀。如果凝胶出现紫色背景，建议重新制备凝胶并减少光照时间。如果对琼脂糖凝胶染色后灵敏度不足，建议延长光照时间。如果灵敏度不足且凝胶中出现乳光状沉淀，则可能是SDS污染所致；此时应重新制备凝胶，并在加入染色试剂前进行充分漂洗。

沉淀反应通过蓝光照射发生，无论光源来自蓝色LED灯还是阳光中自然存在的蓝光。因此，该技术的一个局限性在于光源。如果没有光源，则需要一个蓝色光源；如果光源不均匀，则无法进行比较，出于同样原因，也无法实现定量分析。然而，所获得的结果在一定程度上依赖于所使用的光源。如果光源不稳定或不均匀（例如由于白天阳光强度的变化或蓝光源本身不均匀），则在不同时间对不同样品进行直接比较或定量将更加困难。

该方法无需特殊仪器即可观察DNA，非常适合在野外...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硝基蓝四氮唑	Gold Biotechnology	298-83-9	染色中使用的试剂
SYBR Green I 10000X	Thermo-Fisher	S7563	染色中使用的试剂
凝胶回收试剂盒	QIAGEN	28704	用于完整性检测中从凝胶中完整提取质粒
DNA Ladder	Thermo-Fisher	SM 1331	用于制作标准曲线以及在完整性检测中作为参考以切割目标条带
琼脂粉	Merck		用于制备LB-氨苄青霉素培养平板
氯化钠	Merck	1064045000	用于制备LB-氨苄青霉素培养平板
酵母提取物	Becton, Dickinson and Company	212750	用于制备LB-氨苄青霉素培养平板
蛋白胨	Merck	72161000	用于制备LB-氨苄青霉素培养平板
TEMED	AMRESCO	761	用于制备聚丙烯酰胺凝胶
过硫酸铵	Calbiochem	2310	用于制备聚丙烯酰胺凝胶
丙烯酰胺	invitrogen	15512-023	用于制备聚丙烯酰胺凝胶
双丙烯酰胺	SIGMA	146072	用于制备聚丙烯酰胺凝胶
Tris碱	Merck	1083821000	用于制备TAE缓冲液及非变性聚丙烯酰胺凝胶的Tris-HCl缓冲液
EDTA	J.T. Baker	8993-01	用于制备TAE缓冲液
乙酸	Merck	1,000,632,500	用于制备TAE缓冲液
琼脂糖	Merck	16802	用于制备TAE缓冲液
分光光度计	Tecan	infinite 200 pro	用于定量DNA质粒
纯水系统	Merck	Elix 100	用于制备I型水（ASTM标准），用于分光光度法和DNA稀释
蒸馏水		-	用于凝胶、培养基、染色及常规溶液配制
HCl	J.T. Baker	9535-03	用于制备非变性聚丙烯酰胺凝胶的Tris-HCl缓冲液
6X DNA上样染料	Thermo-Fisher	R0610
5 mm 蓝色LED	Jinyuan electronics	SP-021	完整性检测中使用的光源
面包板	KANDH	KH102	光源支撑及电路连接
9 V 电池	Duracell	-	用于为LED供电
水平电泳槽	Biorad	1704486EDU	用于完整性检测中琼脂糖凝胶的制备与电泳
垂直电泳装置	Biorad	1658002EDU	用于标准曲线中聚丙烯酰胺凝胶的电泳
电源	Biorad	1645050	用于为电泳提供电源