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方法文章

基于蓝光照射诱导甲臜沉淀的DNA染色方法

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DOI：

10.3791/56528

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2018年1月28日

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1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile

本文内容

摘要

该方法通过将凝胶浸泡在SYBR Green I/氮蓝四唑溶液中，然后暴露于阳光或蓝光光源下，实现对凝胶中DNA的选择性染色和定量。该过程可产生可见的沉淀物，且几乎不需要任何设备，非常适合野外使用。

摘要

DNA染色方法在生物医学研究中具有重要意义。我们设计了一种简单的方法，通过形成有色沉淀物，实现肉眼直接观察DNA。该方法通过将丙烯酰胺凝胶或琼脂糖DNA凝胶浸泡在含有1x（相当于2.0 µM）SYBR Green I（SG I）和0.20 mM硝基蓝四氮唑的溶液中，随后暴露于日光或特定的蓝光下，生成紫色的甲臜沉淀。此外，我们还利用耐氨苄青霉素的质粒在经本方法染色的琼脂糖凝胶中进行了DNA回收实验。与传统的使用紫外光照射SG I染色的方法相比，本方法获得的菌落数量更多。该方法快速、特异性强、对DNA无毒性，无需使用透射式紫外灯即可实现生物分子的“肉眼”观察，且成本低廉，适用于野外现场应用。基于上述优点，这种新型DNA染色方法在科研与工业领域均具有潜在的应用价值。

引言

随着生物化学与分子生物学的进步，涉及DNA的研究需要更优的技术来分析DNA。最早的DNA染色方法是银染法，该方法灵敏度很高，但缺乏选择性，且无法回收样品。随后，荧光DNA染色技术的发展实现了对DNA的选择性定量，并可实现样品回收。最早用于DNA定量的荧光染料之一是溴化乙锭1，其具有致突变性2。然而，目前已有更安全、更灵敏的新型荧光染料，如GelRed和SYBR Green I（SG I）3；但这些荧光染料均需使用紫外（UV）透射仪或荧光计进行检测。

还有其他可用于直观染色DNA的技术，例如亚甲蓝4和结晶紫5,6,7,8,9，但这些方法均存在灵敏度和选择性较低的问题。四氮唑盐是一类易被还原的有机化合物，还原后会形成不溶性的有色甲臜沉淀10,11。最近研究表明，某些二价四氮唑盐因其带正电荷的四氮唑环能够与DNA结合12。

在最近的一项研究中13，提出了一种新的可见光染色技术，用于在聚丙烯酰胺凝胶中染色并定量DNA，该方法利用二价四氮唑盐——硝基蓝四氮唑（NBT）的还原反应，并结合荧光染料如溴化乙锭、GelRed、SYBR Green I 和 SYBR Gold。该反应在蓝光或日光下即可进行，与使用SG I结合紫外透射仪的方法相比，可实现更高质量的样品回收。本文的目的是提供一种基于四氮唑盐的染色技术的详细实验方案。

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方案

1. 凝胶的制备与电泳

  1. 参照 Sambrook 和 Russell14 中的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳配方，但用水代替十二烷基硫酸钠，制备非变性 12% 聚丙烯酰胺凝胶。
    1. 制备 5 mL 分离胶，需使用 1.7 mL 蒸馏水、2 mL 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（30/0.8% w/v）、1.3 mL 1.5 M Tris pH 8.8、0.05 mL 10% 过硫酸铵和 0.002 mL TEMED。
    2. 制备 2 mL 浓缩胶，需使用 1.5 mL 水、0.33 mL 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（30/0.8% w/v）、0.25 mL 1 M Tris pH 6.8、0.02 mL 10% 过硫酸铵和 0.002 mL TEMED。凝胶尺寸为 7.3 cm x 8.2 cm x 0.075 cm（长 x 宽 x 厚）。
      注意：为获得最佳灵敏度，请使用 0.75 mm 厚度的 15 孔梳子。
  2. 向 1.5 mL 微量离心管中加入适量的 6x 上样缓冲液和 DNA 样品（例如，将 1 µL 6x 上样缓冲液与 5 µL DNA 样品混合）。
  3. 将凝胶放入垂直电泳槽中。
    1. 向电泳槽中加入 750 mL 1x TAE 缓冲液以运行 2 块凝胶。制备 1 L 50x TAE，需使用 442 g Tris 碱、57.1 mL 冰醋酸和 100 mL 0.5 M EDTA pH 8。加蒸馏水至终体积 1 L。
    2. 将样品上样到凝胶中。在 100 V 电压下运行凝胶 2 小时。
  4. 或者，参照 Sambrook14 中的配方制备 1x TAE 琼脂糖凝胶。
    1. 向水平电泳槽中加入 300 mL 1x TAE。在 100 V 电压下运行凝胶 45 分钟。

2. NBT-SG I 染色（图 1）。

  1. 丙烯酰胺凝胶染色。
    1. 配制溶液：0.1% w/v NBT 和 1.2x SG I。
      注意：可以使用溴化乙锭、GelRed 和 SYBR Gold 代替 SG I，但 SG I 性能最佳。
    2. 将 16.75 mL 1.2x SYBR Green I 溶液倒入适当尺寸的容器中。
      注意：我们使用移液器吸头盒的盖子作为容器，这些体积是根据使用该容器覆盖凝胶计算的；其尺寸为 11.6 cm x 7.6 cm x 2.6 cm（长 x 宽 x 深）。
    3. 将凝胶放入溶液中。加入 3.25 mL 0.1% w/v NBT 溶液，使最终浓度达到 0.2 mM NBT 和 1x（相当于 2.0 µM）SG I。
    4. 用塑料薄膜密封容器，并用铝箔完全包裹容器以阻挡环境光。
      注意：使用塑料薄膜是为了防止飞溅，并避免铝箔与染色溶液发生反应。
    5. 在轨道摇床上以 60 rpm 的转速振荡 25 分钟。
    6. 移除铝箔和塑料覆盖物。在阳光下曝光最多 90 分钟。每 5 分钟检查一次，直至目的条带出现。
    7. 若使用蓝光，准备一个带有 3 个发光二极管（LED）的原型板，并将 LED 置于距离凝胶表面约 5 mm 处（需持续观察染色情况，因为所需时间取决于 LED 光源的强度）。
  2. 琼脂糖凝胶染色。
    1. 按照第 1.4 节所述制备并跑完 1% 琼脂糖凝胶（尺寸为 1 cm x 6.2 cm x 7 cm；长 x 宽 x 深）后，遵循与 2.1 相同的步骤，但作如下修改：
    2. 将 41.9 mL 1.2x SG I 溶液倒入移液器吸头盒的盖子中；其尺寸为 11.6 cm x 7.6 cm x 2.6 cm（长 x 宽 x 深）。加入 8.1 mL 0.1% NBT 溶液。
    3. 用塑料薄膜密封容器，然后用铝箔完全包裹容器以阻挡环境光。
    4. 在轨道摇床上以 60 rpm 的转速振荡 1 小时。

3. 数据分析。

  1. NBT-SG I 校准曲线。
    1. 通过以 1200 dpi 扫描获取凝胶图像。
    2. 打开图像分析软件。使用图像编辑器拉直图像。运行图像光密度分析。
    3. 计算曲线下面积。绘制信号/信号最大 与 DNA 浓度的关系图。

4. DNA 回收。

  1. 参照 Sambrook14 中的配方，使用 1x TAE 缓冲液制备 1% 琼脂糖凝胶。
  2. 向水平电泳槽中加入 300 mL 1x TAE 缓冲液。按照图 2 所示的方案，加样 4 µL 浓度为 100 ng/µL 的 pDJ10015 质粒和 DNA 分子量标准。在 100 V 电压下电泳 1 小时。
  3. 标记并称量两个 2 mL 微量离心管。
  4. 将凝胶从中间切开，得到两个相同的半块。每半块均应包含分子量标准和样品质粒，以便比较不同的染色技术。示意图见图 2。
  5. 按照步骤 2 的方法，用 NBT-SG I 染色其中半块凝胶。
    1. 用洁净的手术刀切下质粒条带。将凝胶块保存于一个已标记的管中并称重。
  6. 用 50 mL 1x SG I 溶液染色另一半凝胶，并在黑暗中缓慢摇动 (60 rpm) 1 小时。
    1. 将凝胶置于透射仪上，曝光 2 分钟。用洁净的手术刀切下质粒条带。
    2. 将凝胶块保存于另一个管中并称重。
      注意： 此处可暂停实验，将管子保存在 -20 °C。
  7. 使用商业化的凝胶回收试剂盒进行质粒提取。

5. 质粒浓度归一化。

  1. 在 1.5 mL 微量离心管中，加入 10 µL 提取的质粒和 60 µL I 型水。混匀后转移至 60 µL 石英比色皿，或直接取 2 µL 用于 Nanodrop 检测。
  2. 测量 230 至 320 nm 范围内的吸收光谱。使用以下公式计算样品质粒浓度：
    DNA浓度计算公式，A260-A320，示意图；生化定量方法。
    其中 D 为应用的稀释因子（本例中为 70/10），Ax 为 x nm 处的吸光度，50 为双链 DNA 换算为 µg/mL 的转换因子。
  3. 将样品稀释至 9.1 ng/µL。
  4. 按照 Inoue 转化法16，使用 5 µL 稀释样品转化 Escherichia coli (E. coli) 感受态细胞（例如 XL10 Gold）。
  5. 计数培养皿上的菌落数并记录稀释度。使用以下公式17：计算菌落形成单位（CFU）：
    CFU 计算，公式：CFU = 每平板菌落数 × D，微生物生长分析。
    其中 D 为从初始培养物应用的稀释因子。
  6. 进行非配对 t 检验。

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结果

在DNA所在位置会出现紫色的甲臜沉淀（经质谱法验证13）。实验中加载了DNA ladder以制作标准曲线（图3）。该方法适用于聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶，但在琼脂糖凝胶中的显色强度较低且所需时间更长。然而，使用琼脂糖凝胶可通过市售试剂盒回收样品，且不影响后续提取过程。采用蓝光LED并以此法回收的样品，其质量优于使用透射仪结合SG I染料所得的样品（图4）。

DNA定量过程；含SYBR Green I的凝胶电泳图，数据分析图。

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讨论

本文介绍了一种基于NBT还原和SG I染色的灵敏且新颖的DNA染色方法。该方案的关键步骤是凝胶在NBT-SG I溶液中的孵育时间以及NBT的浓度。由于琼脂糖凝胶比聚丙烯酰胺凝胶更厚，因此其染色时间更长。该方法在存在SDS时不适用，因为NBT会与SDS接触后发生沉淀。如果凝胶出现紫色背景，建议重新制备凝胶并减少光照时间。如果对琼脂糖凝胶染色后灵敏度不足，建议延长光照时间。如果灵敏度不足且凝胶中出现乳光状沉淀，则可能是SDS污染所致；此时应重新制备凝胶，并在加入染色试剂前进行充分漂洗。

沉淀反应通过蓝光照射发生，无论光源来自蓝色LED灯还是阳光中自然存在的蓝光。因此，该技术的一个局限性在于光源。如果没有光源，则需要一个蓝色光源；如果光源不均匀，则无法进行比较，出于同样原因，也无法实现定量分析。然而，所获得的结果在一定程度上依赖于所使用的光源。如果光源不稳定或不均匀（例如由于白天阳光强度的变化或蓝光源本身不均匀），则在不同时间对不同样品进行直接比较或定量将更加困难。

该方法无需特殊仪器即可观察DNA，非常适合在野外...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由智利国家科学技术发展基金（Fondecyt）项目11130263（资助给CW）、CONICYT + NERC + 国际合作计划PCI-PII20150073（资助给CW）以及智利大学研究副校长办公室U-inicia项目（资助给CW）提供支持。

感谢 Tatiana Naranjo-Palma 在本项目初期阶段提供的帮助，感谢 Jorge Babul 博士和 Diego Quiroga-Roger 的有益讨论，感谢 Robert Lesch 对手稿的审阅，以及智利大学化学与药学科学学院推广办公室（Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas from Universidad de Chile）的支持。同时感谢 Marcelo Pérez 对视频的编辑，Neil Stevens 对文本的校正，以及 Errol Watson 提供的配音。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
硝基蓝四氮唑Gold Biotechnology298-83-9染色中使用的试剂
SYBR Green I 10000XThermo-FisherS7563染色中使用的试剂
凝胶回收试剂盒QIAGEN28704用于完整性检测中从凝胶中完整提取质粒
DNA LadderThermo-FisherSM 1331用于制作标准曲线以及在完整性检测中作为参考以切割目标条带
琼脂粉Merck用于制备LB-氨苄青霉素培养平板 
氯化钠Merck1064045000用于制备LB-氨苄青霉素培养平板 
酵母提取物Becton, Dickinson and Company212750用于制备LB-氨苄青霉素培养平板 
蛋白胨Merck72161000用于制备LB-氨苄青霉素培养平板 
TEMEDAMRESCO761用于制备聚丙烯酰胺凝胶
过硫酸铵Calbiochem2310用于制备聚丙烯酰胺凝胶
丙烯酰胺invitrogen15512-023用于制备聚丙烯酰胺凝胶
双丙烯酰胺SIGMA146072用于制备聚丙烯酰胺凝胶
Tris碱Merck1083821000用于制备TAE缓冲液及非变性聚丙烯酰胺凝胶的Tris-HCl缓冲液
EDTAJ.T. Baker8993-01用于制备TAE缓冲液
乙酸Merck1,000,632,500用于制备TAE缓冲液
琼脂糖Merck16802用于制备TAE缓冲液
分光光度计Tecaninfinite 200 pro用于定量DNA质粒
纯水系统MerckElix 100用于制备I型水（ASTM标准），用于分光光度法和DNA稀释
蒸馏水-用于凝胶、培养基、染色及常规溶液配制
HClJ.T. Baker9535-03用于制备非变性聚丙烯酰胺凝胶的Tris-HCl缓冲液
6X DNA上样染料Thermo-FisherR0610
5 mm 蓝色LEDJinyuan electronicsSP-021完整性检测中使用的光源
面包板KANDHKH102光源支撑及电路连接 
9 V 电池Duracell-用于为LED供电
水平电泳槽Biorad1704486EDU用于完整性检测中琼脂糖凝胶的制备与电泳
垂直电泳装置Biorad1658002EDU用于标准曲线中聚丙烯酰胺凝胶的电泳
电源Biorad1645050 用于为电泳提供电源

参考文献

  1. LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
  2. Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
  3. Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
  4. Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
  5. Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
  6. Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
  7. Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40(1993).
  8. Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
  9. Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
  10. Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
  11. Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
  12. Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
  13. Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
  14. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
  15. Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
  16. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  17. Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. Brock biology of microorganisms. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).

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