基于蓝光照射诱导甲臜沉淀的DNA染色方法

摘要

该方法通过将凝胶浸泡在SYBR Green I/氮蓝四唑溶液中，然后暴露于阳光或蓝光光源下，实现对凝胶中DNA的选择性染色和定量。该过程可产生可见的沉淀物，且几乎不需要任何设备，非常适合野外使用。

摘要

DNA染色方法在生物医学研究中具有重要意义。我们设计了一种简单的方法，通过形成有色沉淀物，实现肉眼直接观察DNA。该方法通过将丙烯酰胺凝胶或琼脂糖DNA凝胶浸泡在含有1x（相当于2.0 µM）SYBR Green I（SG I）和0.20 mM硝基蓝四氮唑的溶液中，随后暴露于日光或特定的蓝光下，生成紫色的甲臜沉淀。此外，我们还利用耐氨苄青霉素的质粒在经本方法染色的琼脂糖凝胶中进行了DNA回收实验。与传统的使用紫外光照射SG I染色的方法相比，本方法获得的菌落数量更多。该方法快速、特异性强、对DNA无毒性，无需使用透射式紫外灯即可实现生物分子的“肉眼”观察，且成本低廉，适用于野外现场应用。基于上述优点，这种新型DNA染色方法在科研与工业领域均具有潜在的应用价值。

引言

随着生物化学与分子生物学的进步，涉及DNA的研究需要更优的技术来分析DNA。最早的DNA染色方法是银染法，该方法灵敏度很高，但缺乏选择性，且无法回收样品。随后，荧光DNA染色技术的发展实现了对DNA的选择性定量，并可实现样品回收。最早用于DNA定量的荧光染料之一是溴化乙锭¹，其具有致突变性²。然而，目前已有更安全、更灵敏的新型荧光染料，如GelRed和SYBR Green I（SG I）³；但这些荧光染料均需使用紫外（UV）透射仪或荧光计进行检测。

还有其他可用于直观染色DNA的技术，例如亚甲蓝⁴和结晶紫^5,6,7,8,9，但这些方法均存在灵敏度和选择性较低的问题。四氮唑盐是一类易被还原的有机化合物，还原后会形成不溶性的有色甲臜沉淀^10,11。最近研....

方案

1. 凝胶的制备与电泳

1. 参照 Sambrook 和 Russell¹⁴ 中的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳配方，但用水代替十二烷基硫酸钠，制备非变性 12% 聚丙烯酰胺凝胶。
   1. 制备 5 mL 分离胶，需使用 1.7 mL 蒸馏水、2 mL 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（30/0.8% w/v）、1.3 mL 1.5 M Tris pH 8.8、0.05 mL 10% 过硫酸铵和 0.002 mL TEMED。
   2. 制备 2 mL 浓缩胶，需使用 1.5 mL 水、0.33 mL 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（30/0.8% w/v）、0.25 mL 1 M Tris pH 6.8、0.02 mL 10% 过硫酸铵和 0.002 mL TEMED。凝胶尺寸为 7.3 cm x 8.2 cm x 0.075 cm（长 x 宽 x 厚）。
      注意：为获得最佳灵敏度，请使用 0.75 mm 厚度的 15 孔梳子。
2. 向 1.5 mL 微量离心管中加入适量的 6x 上样缓冲液和 DNA 样品（例如，将 1 µL 6x 上样缓冲液与 5 µL DNA 样品混合）。
3. 将凝胶放入垂直电泳槽中。
   1. 向电泳槽中加入 750 mL 1x TAE 缓冲液以运行 2 块凝胶。制备 1 L 50x TAE，需使....

结果

在DNA所在位置会出现紫色的甲臜沉淀（经质谱法验证¹³）。实验中加载了DNA ladder以制作标准曲线（图3）。该方法适用于聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶，但在琼脂糖凝胶中的显色强度较低且所需时间更长。然而，使用琼脂糖凝胶可通过市售试剂盒回收样品，且不影响后续提取过程。采用蓝光LED并以此法回收的样品，其质量优于使用透射仪结合SG I染料所得的样品（图4）。

讨论

本文介绍了一种基于NBT还原和SG I染色的灵敏且新颖的DNA染色方法。该方案的关键步骤是凝胶在NBT-SG I溶液中的孵育时间以及NBT的浓度。由于琼脂糖凝胶比聚丙烯酰胺凝胶更厚，因此其染色时间更长。该方法在存在SDS时不适用，因为NBT会与SDS接触后发生沉淀。如果凝胶出现紫色背景，建议重新制备凝胶并减少光照时间。如果对琼脂糖凝胶染色后灵敏度不足，建议延长光照时间。如果灵敏度不足且凝胶中出现乳光状沉淀，则可能是SDS污染所致；此时应重新制备凝胶，并在加入染色试剂前进行充分漂洗。

沉淀反应通过蓝光照射发生，无论光源来自蓝色LED灯还是阳光中自然存在的蓝光。因此，该技术的一个局限性在于光源。如果没有光源，则需要一个蓝色光源；如果光源不均匀，则无法进行比较，出于同样原因，也无法实现定量分析。然而，所获得的结果在一定程度上依赖于所使用的光源。如果光源不稳定或不均匀（例如由于白天阳光强度的变化或蓝光源本身不均匀），则在不同时间对不同样品进行直接比较或定量将更加困难。

该方法无需特殊仪器即可观察DNA，非常适合在野外.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硝基蓝四氮唑	Gold Biotechnology	298-83-9	染色中使用的试剂
SYBR Green I 10000X	Thermo-Fisher	S7563	染色中使用的试剂
凝胶回收试剂盒	QIAGEN	28704	用于完整性检测中从凝胶中完整提取质粒
DNA Ladder	Thermo-Fisher	SM 1331	用于制作标准曲线以及在完整性检测中作为参考以切割目标条带
琼脂粉	Merck		用于制备LB-氨苄青霉素培养平板
氯化钠	Merck	1064045000	用于制备LB-氨苄青霉素培养平板
酵母提取物	Becton, Dickinson and Company	212750	用于制备LB-氨苄青霉素培养平板
蛋白胨	Merck	72161000	用于制备LB-氨苄青霉素培养平板
TEMED	AMRESCO	761	用于制备聚丙烯酰胺凝胶
过硫酸铵	Calbiochem	2310	用于制备聚丙烯酰胺凝胶
丙烯酰胺	invitrogen	15512-023	用于制备聚丙烯酰胺凝胶
双丙烯酰胺	SIGMA	146072	用于制备聚丙烯酰胺凝胶
Tris碱	Merck	1083821000	用于制备TAE缓冲液及非变性聚丙烯酰胺凝胶的Tris-HCl缓冲液
EDTA	J.T. Baker	8993-01	用于制备TAE缓冲液
乙酸	Merck	1,000,632,500	用于制备TAE缓冲液
琼脂糖	Merck	16802	用于制备TAE缓冲液
分光光度计	Tecan	infinite 200 pro	用于定量DNA质粒
纯水系统	Merck	Elix 100	用于制备I型水（ASTM标准），用于分光光度法和DNA稀释
蒸馏水		-	用于凝胶、培养基、染色及常规溶液配制
HCl	J.T. Baker	9535-03	用于制备非变性聚丙烯酰胺凝胶的Tris-HCl缓冲液
6X DNA上样染料	Thermo-Fisher	R0610
5 mm 蓝色LED	Jinyuan electronics	SP-021	完整性检测中使用的光源
面包板	KANDH	KH102	光源支撑及电路连接
9 V 电池	Duracell	-	用于为LED供电
水平电泳槽	Biorad	1704486EDU	用于完整性检测中琼脂糖凝胶的制备与电泳
垂直电泳装置	Biorad	1658002EDU	用于标准曲线中聚丙烯酰胺凝胶的电泳
电源	Biorad	1645050	用于为电泳提供电源