Method Article

利用微流体装置进行机械刺激和高分辨率成像的研究C.线虫

DOI:

10.3791/56530

⸱

February 19th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University, 2Department of Mechanical Engineering, Stanford University, 3Department of Bioengineering, Stanford University, 4Group of Neurophotonics and Mechanical Systems Biology, The Institute of Photonic Sciences (ICFO)

In This Article

Summary

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美国匹茨堡研究的新工具需要了解机械应力是如何激活生化通路并引起生物学反应的。在这里, 我们展示了一种新的方法, 选择性机械刺激固定化动物与微流控器陷阱, 允许高分辨率成像的细胞反应。

Abstract

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美国匹茨堡的一个中心目标是了解机械应力对蛋白质和细胞的相互作用。尽管它的重要性, 机械应力对细胞功能的影响仍然是不太清楚。在某种程度上, 这种知识差距之所以存在, 是因为很少有工具能使组织和细胞同时变形, 活动物的细胞活动成像, 以及在其他高度流动的模型生物体中有效限制运动, 如线虫秀丽线虫。小的C. 线虫使它们与基于微流体的研究设备非常匹配, 并利用微流控装置提出了固定化解决方案。虽然这些设备允许高分辨率成像, 该动物是完全包裹在烷和玻璃, 限制物理访问提供机械力或电生理记录。最近, 我们创建了一个设备, 集成气动执行器与陷阱设计兼容高分辨率荧光显微镜。所提出的驱动通道是由一个薄的, 由一个小的反式的双膜片分离的蠕虫捕获通道。这种隔膜通过施加外部源的压力偏转到蠕虫的一侧。该装置可以针对单个 mechanosensitive 神经元。这些神经元的活化是用基因编码的钙指标进行高分辨率成像的。本文介绍了在触摸受体神经元 (TRNs) 中, 使用线虫菌株表达钙敏感活性指标 (GCaMP6s) 的一般方法。然而, 该方法并不局限于 TRNs 或钙传感器作为探针, 但可以扩展到其他机械敏感的细胞或传感器。

Introduction

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触觉为动物提供了关于环境的关键信息。根据施加的力量, 触摸被认为是无害的, 愉悦的, 或痛苦的。在接触过程中的组织变形是由嵌入在皮肤中的专门 mechanoreceptor 细胞检测到的, 表达受体蛋白, 最常见的离子通道。在接触和疼痛过程中, 连接力知觉与离子通道活化的步骤没有完全理解。对于皮肤组织如何过滤机械变形以及 mechanoreceptors 检测应变或应力变化的情况 (如1、2、3), 更甚了解。这种理解上的差距, 部分是由于缺乏适当的工具, 在观察细胞水平的反应时, 对活着的动物的皮肤表面施加精确的机械刺激。虽然原子力显微镜已广泛用于应用和测量孤立细胞中的作用力4,5和激活 Piezo1 受体在活细胞6, 类似的实验使用活体动物, 特别是C. 线虫, 由于这个主题的内在流动性, 而臭名昭著的挑战性。这一挑战传统上绕过使用兽医或外科级氰胶水固定在琼脂垫上的个别动物,1,7,8

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Protocol

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1. 设备制造

  1. 下载附加的掩码文件 (补充文件 1), 并使用商业服务或内部设施生成 chrome 掩码。由于器件的最小尺寸为10µm (执行器膜厚度), 确保掩模具有足够高的分辨率, 在0.25 µm 内, 可靠地产生特性。
  2. 遵循标准的 SU-8 光刻方法 (例如, 引用24,25,26), 以制造随后生产的注塑设备的模具;下面列出了步骤的摘要.
    注: SU-8 是一种光敏材料, 在紫外线照射下 crosslinks (最大吸收量约 365 nm)。使用制造商说明作为起点, 确定软烘烤、曝光 (UV) 和后烘烤的加工参数。
    1. 将 SU-8 2002 存入硅片, 将其纺成大约2µm 的厚度, 以更好地粘合小结构。软烘烤在热的板材为1分钟在95°c, 轻微地暴露 (UV) 整个表面 (~ 100 mJ/cm2) 和在热板材烘烤在2摄氏度的95分钟。
    2. 自旋涂层 47-µm 厚层 SU-8 2050 用于定义设备功能。使用 500 rpm 的旋转速度为十五年代 (130 rpm/秒加速), 然后 ....

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Results

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SU-8 光刻与芯片粘合
光刻协议和注塑工艺遵循标准程序。详细信息可在其他地方找到23,24,25,26。在固化后, 应将硅片剥离, 无问题。如果 SU-8 的特性在其剥离过程中脱落, SU-8 黏附层或硅烷化是不够的。如果等离子活化的玻璃盖玻片和非晶硅芯片是不够的, 弱粘结可能导致泄漏的陷阱通道或气动执行器导致性能下降和缺乏刺激。如果流体泄漏是明显的, 芯片是不可用的。

执行器性能
所有的聚硅烷执行器和油管连接到气藏必须正确密封, 以确保适当的气动驱动膜片。反复插入和拆卸 PE 油管 (管道) 将会损坏塑料孔, 并导致.......

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Discussion

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该协议说明了一种方法, 提供精确的机械刺激的皮肤的蛔虫被困在微流控芯片。它的目的是促进物理刺激的综合回答生物学问题, 并旨在简化生物实验室的美国匹茨堡研究。这种方法扩展了以前的化验, 以评估 mechanosensory 神经元在C. 线虫中的作用。以前测量的定量和半定量技术力1、34和行为35, 但很难与神经元活动的高分辨率成像相集成。因此, 我们认为使用这个芯片可以扩展当前的应用, 它的性能被优化为刺激的神经元需要温和的触摸。我们优化了执行器的挠度达到5µm, 这是一个足够强大的刺激, 以达到几乎最大的神经元反应。由于细微的变化, 我们相信这种设计可以用来刺激苛刻的触摸感受器, 如支配体表36的 PVD 痛觉受器。

修改和疑难解答
如果没有洁净室可用于 SU-8 光刻, 则可以使用台式清洁盒或 SU-8 软光刻.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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我们感谢桑德拉 n. Manosalvas-Kjono, 普珥节 Ladpli, 法拉梅蒙, Divya Gopisetty, 和维罗妮卡支持在设备设计和产生变种动物。这项研究得到了 NIH 赠款 R01EB006745 (BLP)、R01NS092099 (MBG)、K99NS089942 (至 MK)、F31NS100318 (氮化铝) 的支持, 并获得欧洲联盟2020研究和创新计划 (协调委员会) 的资助 (授予 MK 715243 号协议)。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
镀铬蒙版Compugraphics （http://www.compugraphics-photomasks.com/）5''，在 AutoCAD 中设计 （Autodesk， Inc.）
镀铬面罩Mitani-Micronics （http://www.mitani-micro.co.jp/en/）5''，在 AutoCAD 中设计 （Autodesk， Inc.）
镀铬面罩黑田电机 （http://www.kuroda-electric.eu/5''，在 AutoCAD 中设计 （Autodesk， Inc.）
4 英寸硅片（B 测试）斯坦福纳米制造设施
SU-8 2002MicroChem
SU-8 2050MicroChem
旋涂机Laurell TechnologiesWS-400BZ-6NPP/LITE
曝光定时器Optical Associates， IncOAI 150
照明控制器光学协会公司2105C2
SU-8显影剂MicroChem
2-丙醇Fisher ScientificA426F-1GAL
丙酮Fisher ScientificA18-4
三氯甲基硅烷（TCMS）Sigma-Aldrich92361-500ML警告：TCMS有毒且对水反应
Sylgard 184弹性体套件Dow康宁PDMS 预聚物
活检穿刺器，1 mmVWR95039-090
氧气等离子体 AsherBranson/IPC
小金属管（外径 0.635 mm，内径 0.4318 mm，长 12.7 mm）;量规尺寸 23TWNew England Small Tube CorporationNE-1300-01
Nalgene 注射器过滤器，0.22 μmThermo Scientific725-2520过滤所有溶液，小颗粒会堵塞芯片
管;外径 0.9652 mm，内径 0.5842 mmSolomon ScientificBPE-T50
注射器，1 mlBD Scientific309628，用于蠕虫诱捕和释放
注射器，20 mlBD Scientific309661，用于重力流动
Gilson Minipuls 3，蠕动泵Gilson将溶液和蠕虫从芯片中吸出
微流体流量控制器，配备 0–800 kPa 压力通道ElveflowOB1 MK3压力输送
防水透明聚氨酯管，内径 4 毫米和 外径 6 毫米McMaster-Carr5195 T52从室内空气到压力泵的连接
防水透明聚氨酯管，内径 2.6 毫米，外径 4 毫米McMaster-Carr5195 T51将压力泵连接到小管道
用于空气的推入式连接管接头McMaster-Carr5111K468制 - 英制转换器
直连接器，适用于6毫米&次; 1/4″管外径McMaster-Carr5779 K258
徕卡 DMI 4000 B 显微镜系统徕卡
63×/1.32 NA HCX PL APO 油物镜徕卡506081
滨松 Orca-Flash 4.0LT 数字 CMOS 相机滨松C11440-42U
Lumencor Spectra X 光引擎流明器带青色和绿色/黄色光源
激发分束器中的Chroma59022bs
滨松 W-view Gemini 图像分光光学元件滨松A12801-01红光发射并将它们投射到相机芯片上的不同区域
发射分光器ChromaT570lpxr在图像分光器
滤光片 GCamp6sChromaET525/50m在图像分离器中
发射滤光片 mCherryChromaET632/60m在图像分离器中
性 聚乙烯公 显微镜 分光和 发射

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
  2. Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical ....

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