我们介绍了一种从骨髓细胞中分离小鼠原代巨噬细胞的简便方法，以及一种制备牛血清白蛋白-脂肪酸偶联物的简单方法。随后我们证明，饱和脂肪酸可诱导巨噬细胞死亡，且此类细胞死亡与细胞内神经酰胺水平的累积呈正相关。
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摘要
摘要
巨噬细胞高表达表皮脂肪酸结合蛋白和脂肪组织脂肪酸结合蛋白。它们可主动摄取饱和与不饱和脂肪酸，这些脂肪酸可能在调控其免疫功能中发挥关键作用。大量研究表明，不同种类的脂肪酸（无论是饱和还是不饱和）可能对细胞生长和功能产生不同的影响。然而，目前所采用的脂肪酸制备方法各不相同，可能导致非生理性的结果。血清白蛋白是哺乳动物外周血中脂肪酸的天然载体，推荐用于与脂肪酸钠盐形成共轭复合物，以研究脂肪酸在哺乳动物细胞中的功能，从而降低脂肪酸皂的毒性。因此，本文介绍并展示了一种简单且相对快速的加热与超声处理方法，用于制备BSA-脂肪酸共轭物。我们描述了一种使用饱和脂肪酸（特别是硬脂酸）诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞发生严重细胞死亡的实验方案。我们进一步证明，饱和脂肪酸诱导的细胞死亡与细胞内神经酰胺水平的累积呈正相关。该方法可推广应用于研究脂肪酸对其他哺乳动物细胞的影响。
引言
脂肪酸在各类细胞的能量代谢以及膜磷脂的合成中发挥着关键作用。脂肪酸的水溶性较低，因此在研究脂肪酸在哺乳动物细胞中的生物学功能时，其恰当的制备方法至关重要。当使用乙醇制备脂肪酸时，即使在相对较低的浓度下，许多脂肪酸仍可能对细胞膜表现出毒性皂化物（去污剂）效应。1作为血清中游离脂肪酸的一种天然主要转运蛋白，血清白蛋白被认为是脂肪酸递送的理想载体 体外 用于脂肪酸功能检测2,3,4然而，尽管已有大量使用脂肪酸的研究论文发表，脂肪酸与血清白蛋白偶联物的制备细节通常仍不公开。
巨噬细胞高表达表皮脂肪酸结合蛋白和脂肪组织脂肪酸结合蛋白5,6,7,8。它们可主动摄取饱和与不饱和脂肪酸，这些脂肪酸可能调节其免疫功能。为了研究脂肪酸对巨噬细胞及其他细胞的影响，已采用多种不同的脂肪酸制备方法1,7,9。使用适当制备的脂肪酸/血清白蛋白偶联物来研究脂肪酸对巨噬细胞功能的影响，对于获得具有生物学意义的数据至关重要。关于脂肪酸对巨噬细胞功能影响的研究，可为与巨噬细胞相关疾病中脂肪酸代谢提供基础理论知识及潜在的治疗靶点。
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方案
该实验方案已获路易斯维尔大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
1. 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）
- 使用 CO2 处死一只 6 至 8 周龄的健康野生型小鼠。将其固定在泡沫板上，并用 70% 乙醇喷洒至完全浸湿。用镊子和剪刀取出胫骨/股骨，放入含有 5 mL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。所有操作均需在无菌条件下进行。
- 在无菌细胞培养超净台中，用剪刀剪开胫骨/股骨两端。使用 25 G 针头以 PBS + 2% 胎牛血清（FBS）冲洗骨髓，收集至 15 mL 离心管中。
- 将骨髓细胞在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟。
- 用 1 mL 红细胞裂解缓冲液重悬细胞沉淀，裂解红细胞（RBC）时间少于 1 分钟。立即加入 9 mL 1× PBS 稀释。再次按照步骤 1.3 的条件离心。弃去上清液。
- 用 10 mL 1× PBS 重悬细胞沉淀，通过无菌 40 μm 尼龙滤网过滤细胞悬液至另一 15 mL 离心管中，以去除细胞碎片或团块。再次按照步骤 1.3 的条件离心。弃去上清液。
- 用 15 mL 含 5% FBS 和 10 μg/mL 庆大霉素的 Roswell Park Memorial Institute 培养基（RPMI）1640 重悬细胞沉淀，将细胞接种于 100 mm 组织培养皿中，在 37 oC 培养箱中孵育 60 分钟。轻轻摇晃培养皿，收集未贴壁的悬浮细胞并计数。
- 将 6×106 个细胞接种于含 12 mL 巨噬细胞分化培养基（含 5% FBS 和 10 μg/mL 庆大霉素的 RPMI 1640，加入 30% L929 条件培养基10）的 100 mm 培养皿中，并添加 10 ng/mL 重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），培养 2 天。
- 在 37 °C、5% CO2 培养箱中培养 2 天后，每皿加入 6 mL 新鲜的含 10 ng/mL M-CSF 的巨噬细胞分化培养基进行换液。
- 第 5 天时，小心吸出 8 mL 旧培养基（避免扰动细胞），加入 10 mL 新鲜的含 10 ng/mL M-CSF 的巨噬细胞分化培养基。
- 第 7 天，使用细胞刮刀收集骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）。
注意：去除悬浮细胞并用 5 mL 1× PBS 洗涤培养皿两次后，也可用 5 mL 含 1 mM EDTA 的 1× PBS 孵育 5 至 10 分钟以解离贴壁巨噬细胞。按照步骤 1.3 的条件离心细胞，用新鲜巨噬细胞分化培养基重悬，并用血细胞计数板进行细胞计数。- 按照文献所述方法通过流式细胞术确认 BMDMs 的表型5。将获得的小鼠巨噬细胞调整至适当浓度，用于后续实验。
2. BSA-脂肪酸偶联物的制备
- 在无菌 PBS 中配制 2 mM BSA。例如，称取 6.65 g BSA，加入 30 mL 1× PBS 溶解，再补加 PBS 至 50 mL，按比例调整组分以在 1× PBS 中制备 2 mM BSA。
- 在 2 mM BSA 中配制 5 mM 的单个脂肪酸钠盐。必要时加热至 37 °C 或更高温度，并对 2 mM BSA 与脂肪酸钠盐的混合物进行超声处理，直至获得澄清溶液。
注意：与不饱和脂肪酸相比，饱和脂肪酸需要更高的温度和更长的超声时间才能溶解。 - 将脂肪酸-BSA 溶液经 0.22 μm 滤器过滤，分装至 1.5 mL 无菌微量离心管中，短期使用可于 4 °C 保存，长期储存则置于 -20 °C。在冰箱中 4 °C 保存后不应观察到沉淀。
3. 饱和脂肪酸诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞的细胞死亡
- 将BMDMs以0.4 × 106/mL的密度接种于24孔组织培养板中，使用巨噬细胞分化培养基。
- 在37 °C、5% CO2的培养箱中，用0.4 mM棕榈酸和硬脂酸处理细胞16至24小时。以BSA作为阴性对照。
- 处理后用细胞刮收集细胞，并在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。
- 在100 μL Annexin V结合缓冲液中，室温下用Annexin V-Alexa 488和7-氨基放线菌素D（7-AAD）染色细胞15分钟。
- 孵育结束后，加入200 µL Annexin V结合缓冲液稀释样品，轻轻混匀，然后将样品置于冰上保存。
- 尽快通过流式细胞术分析染色后的细胞5。Annexin V-Alexa 488在FITC通道检测，7-AAD在PerCP/PerCP-Cy5.5通道检测。
4. 细胞内神经酰胺染色
- 脂肪酸处理后，按照步骤 3.3 收集细胞，然后用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟。
- 用 1 mL 1× PBS 洗涤样品，按步骤 3.3 离心，弃去上清液。
- 在 100 μL 1× 通透缓冲液中，以 1:200 稀释的抗神经酰胺一抗对细胞染色 30 分钟。
- 再次按照步骤 4.2 洗涤并离心细胞。
- 在 100 μL 1× 通透缓冲液中，以 1:500 稀释的抗小鼠 IgM 二抗对细胞染色 30 分钟。
- 再次按照步骤 4.2 洗涤并离心细胞，加入 250 μL 1× PBS，通过流式细胞术分析染色后的细胞5。
注意：详细试剂列表见设备与试剂表。
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结果
肥胖会增加血清中游离脂肪酸的浓度。作为专业的吞噬细胞，巨噬细胞主动摄取脂肪酸以维持机体稳态。在此过程中，过量的脂质可能诱导巨噬细胞死亡。为此，我们培养了BMDMs 体外 使用肥胖水平的膳食脂肪酸处理，并通过流式细胞术染色检测巨噬细胞死亡。与BSA对照组相比，饱和脂肪酸（尤其是硬脂酸）显著诱导了BMDM细胞死亡。死亡细胞表现为Annexin V和7-AAD双阳性染色群体。图1a- b值得注意的是，不饱和脂肪酸未引起显著的巨噬细胞死亡5数据表明，游离饱和脂肪酸水平升高具有毒性作用 体内.
类似地，使用一种对棕榈酸或硬脂酸处理敏感的巨噬细胞系5，我们发现巨噬细胞对棕榈酸诱导的细胞死亡的敏感性也受到培养体系中细胞数量的影响（
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讨论
正确配制脂肪酸溶液对于研究脂肪酸的生物学功能至关重要。中和脂肪酸可提高其在水溶液中的溶解度。然而，正如我们所观察到的，脂肪酸的钠盐，尤其是饱和脂肪酸，在水或PBS中的溶解度仍然较低。一种方法是使用95–100%乙醇辅助溶解脂肪酸1。采用该方法时，即使对于毒性较低的不饱和脂肪酸，在较低浓度下也可能观察到较高的细胞毒性。另一种配制脂肪酸溶液的方法是利用甲基-β-环糊精作为递送系统，使脂肪酸保持在单体形式并处于溶液中的最佳状态9,11。采用该方法制备的脂肪酸似乎具有正常功能，但操作过程较为复杂。甲基-β-环糊精对细胞生长的影响在于，高浓度可能导致细胞死亡12。对于饱和脂肪酸硬脂酸和棕榈酸，需采用高温（60 oC）以促进溶解9。
由于血清白蛋白是细胞外液中主要的脂肪酸结合蛋白，有助于脂肪酸在淋巴和血管系统中的运...
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作部分得到了路易斯维尔大学启动资金以及美国国家癌症研究所（贝塞斯达，马里兰州）资助项目 R01CA177679、R01CA180986 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CPX 超声波清洗仪 | Bransonic | 型号 2800 | |
| 棕榈酸钠（PA） | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | 分子量 278 |
| 硬脂酸钠（SA） | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | 分子量 306 |
| 牛血清白蛋白（BSA），无脂肪酸 | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| 小鼠巨噬细胞集落刺激因子（mM-CSF） | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 培养基 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V，Alexa Fluor 488 标记物 | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| 单克隆抗神经酰胺抗体（小鼠 IgM） | Sigma | C8104-50TST | 克隆号：MID 15B4 |
| 山羊抗小鼠 IgM 抗体，µ 链，FITC 标记物 | Sigma | AP128F | |
| 固定缓冲液 | Biolegend | 420801 | |
| 通透缓冲液 | Ebioscience | 4307693 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V 结合缓冲液 | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 细胞 | ATCC | CCL-1 | |
| Corning 细胞刮刀 | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| 注：M.W. 表示分子量。 |
参考文献
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重印与许可
