监测渗透压胁迫对分泌囊泡及胞吐作用的影响

摘要

渗透压应激影响胞吐作用以及在此过程中释放的神经递质的量。我们展示了如何结合电化学方法与透射电子显微镜技术，用于研究细胞外渗透压对胞吐活性、囊泡量子大小以及胞吐过程中释放的神经递质量的影响。

摘要

对经历渗透冲击的细胞进行安培法记录显示，分泌细胞对此类物理应激的响应表现为胞吐活性降低，以及单个胞吐事件中囊泡释放的神经递质含量减少。有研究认为，释放的神经递质减少可能是由于细胞在渗透应激下发生皱缩，导致细胞膜生物物理性质发生改变所致；同时假定细胞质内的分泌囊泡不受细胞外渗透应激的影响。安培法记录可监测囊泡与质膜融合瞬间所释放的物质，但无法提供囊泡融合前其内容物的信息。因此，将安培法记录与其他能够表征胞吐发生前细胞内分泌囊泡特性的互补分析方法相结合，可更全面地研究分泌囊泡及胞吐过程如何受到渗透冲击的影响。本文描述了如何将安培法记录与细胞内电化学细胞分析及透射电子显微镜（TEM）成像相结合，用于表征嗜铬细胞在渗透应激前后分泌囊泡的大小及神经递质含量的变化。通过整合三种分析方法所获得的定量信息，先前的研究已得出结论：分泌囊泡对外部渗透应激的响应表现为体积缩小，并减少囊泡的量子化大小，以维持囊泡内神经递质浓度的恒定。这在一定程度上解释了为何在渗透应激下，囊泡在胞吐过程中释放的神经递质量会减少。本文中的安培法记录表明，这一过程是可逆的；当细胞重新置于等渗环境中后，经历渗透冲击的囊泡可重新填充神经递质。

引言

肾上腺中的嗜铬细胞是一类神经内分泌细胞，能够将神经递质分子释放到血液中。这一过程通过细胞内的机制实现，涉及装载神经递质的囊泡与细胞膜的锚定和融合，使囊泡内容物释放到细胞外空间，该过程称为胞吐作用。嗜铬细胞中的神经递质（肾上腺素和去甲肾上腺素）通过膜蛋白主动转运至大电子致密核心囊泡（LDCVs）中，并以高浓度（约0.5–1 M）储存^1,2。神经递质在LDCVs内的积累依赖于儿茶酚胺分子与囊泡内致密核心蛋白基质之间的亲和力，该基质主要由嗜铬粒蛋白家族组成（浓度约169 mg/mL）^3,4,5,6，以及囊泡内含有关键成分的混合溶液，包括ATP（125–300 mM）⁷、Ca²⁺（溶液中50–100 µM，约40 mM结合于蛋白基质）⁸、Mg²⁺（5 mM）⁹、抗坏血酸（10–30 mM）¹⁰，以及pH值约为5.5的酸性环境^11,12。尽管囊泡内溶质的理论总浓度超过750 mM，LDCVs仍能维持与细胞质等渗的状态（310 mOsm/kg）¹³。囊泡内组分的组成不仅对儿茶酚胺的装载和储存至关重要，还促进溶质在致密核心蛋白基质上的聚集。这显著降低了囊泡的渗透压，同时也可能影响胞吐过程中释放的儿茶酚胺的量^5,6。

通过安培法记录研究细胞外渗透压对胞吐过程的影响发现，高细胞外渗透压会抑制胞吐活性，并减少单个囊泡区室分泌的神经递质数量^{4,14,15,16,17,18,19}。对这些现象的解释推测，细胞质内大分子拥挤程度可能增强，从而抑制囊泡融合事件；同时细胞膜的生物物理特性可能发生改变，影响胞吐过程中释放的神经递质量。这些观点假设高细胞外渗透压并不影响囊泡的量子大小，即在触发胞吐前阶段，囊泡区室内储存的神经递质分子数量^{14,15,17,19,20,21}。在单细胞胞吐释放的安培法测量中，将一根碳纤维圆盘微电极紧贴细胞表面放置，构建出模拟突触结构的实验装置，其中安培电极充当突触后检测器（图1）^22,23。通过刺激细胞发生胞吐，可诱导充满神经递质的囊泡与细胞质膜融合，并将部分或全部囊泡内容物释放到细胞外空间。若神经递质具有电化学活性（例如，儿茶酚胺类），在相对于Ag/AgCl参比电极施加+700 mV的氧化还原电位时，可在电极表面释放的神经递质分子通过电化学方法被检测到。因此，一系列电流尖峰标志着单个胞吐事件的检测。从安培记录中的电流-时间曲线可见，每个单独安培尖峰下的面积代表每次胞吐事件检测到的电荷量，可通过法拉第方程换算为释放的神经递质摩尔数。因此，安培记录可提供单个胞吐事件排出的神经递质量的定量信息，并反映胞吐事件的发生频率，但无法提供囊泡融合及神经递质释放启动前分泌囊泡内容物的定量信息。

因此，为了更深入地理解细胞质中的分泌囊泡在细胞被触发发生胞吐作用之前如何响应胞外渗透压应激，可采用其他互补的分析方法来丰富这方面的信息。例如，若要研究渗透压应激是否改变囊泡体积，可利用透射电子显微镜（TEM）成像分析技术，在化学固定细胞后测量其囊泡大小。若要检测渗透压应激是否影响囊泡的量子化大小，可应用一种 recently developed 的安培法技术——细胞内电化学细胞分析术，用于定量活细胞胞质中处于天然状态的分泌囊泡内的神经递质含量²⁶。在细胞内电化学细胞分析术中，将一根纳米尖端的圆柱形碳纤维电极轻柔地插入活细胞的胞质内，通过在该电极上施加+700 mV的电位（相对于Ag/AgCl参比电极），当单个囊泡碰撞、吸附并随机在电极表面破裂，将其内容物释放至电极表面时，可通过检测氧化还原电流尖峰来定量囊泡中的儿茶酚胺含量²⁶。因此，在安培电流随时间变化的曲线中，每一次单个囊泡破裂事件都会产生一个瞬态电流，通过对每个电流尖峰的面积进行积分，即可根据法拉第定律计算出囊泡的量子化大小。

因此，通过将透射电子显微镜（TEM）成像获得的囊泡尺寸定量信息与细胞内电化学细胞检测记录的囊泡量子大小分析相结合，也可确定囊泡神经递质浓度。这使得在细胞暴露于不同渗透条件时能够对囊泡进行表征，并更深入地了解囊泡在胞吐作用发生前阶段如何响应胞外渗透应激。结合这些方法所得的结果表明，在胞外高渗透压存在的情况下，囊泡会发生收缩并调节其量子大小；比较这些测量中相对变化的定量信息显示，囊泡在收缩的同时会调整其内容物和尺寸，以维持神经递质浓度的恒定²⁴。因此，这一认识有助于解释在经历渗透应激的细胞中观察到的神经递质释放现象。在本实验方案中，我们描述了这三种互补方法的应用，这些方法可用于表征分泌囊泡在其天然环境中如何响应胞外渗透压，以及这种响应对胞吐过程的影响。除了我们先前关于高渗透压对胞吐作用影响的观察结果²⁴之外，我们还提供了新的实验，描述了嗜铬细胞在渗透冲击后的恢复过程以及多次钡刺激对嗜铬细胞的影响。

方案

1. 通过酶消化法从肾上腺分离的牛嗜铬细胞的细胞培养

1. 从牛肾上腺中分离嗜铬细胞时，先用70%乙醇溶液对组织进行灭菌。使用解剖刀去除脂肪和结缔组织。为去除血液，用已预热至37 °C的Locke's溶液（NaCl 154 mM，KCl 5.6 mM，NaHCO3 3.6 mM，羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）5.6 mM，pH 7.4）冲洗肾上腺静脉。
2. 通过注射器经肾上腺静脉向每个腺体注入约2.5 mL温热的、经无菌过滤的0.2%胶原酶P溶液以膨胀腺体，从而消化组织，并在37 °C下孵育组织20分钟。检查腺体以确认髓质的消化过程已完成，组织应感觉柔软，无张力。
3. 沿纵向剪开腺体以收集消化后的髓质组织，用手术刀切碎髓质组织。将组织悬液通过钢筛过滤，并用Locke's溶液稀释至约50 mL体积，以降低胶原酶P的活性。
4. 在室温下以 300 x g 离心 10 分钟，使细胞沉淀，收集至 50 mL 无菌试管中。用 20 mL Locke 溶液重悬所得沉淀，并将溶液经无菌 100-µm 尼龙滤网过滤至试管中。
5. 将嗜铬细胞悬液与无菌Percoll按1:1比例混合，室温下以18,600 × g离心20分钟。收集密度梯度的上层液体，经100-µm尼龙滤网过滤至离心管中。
6. 为去除Percoll，用Locke's溶液稀释细胞悬液，在室温下以300 × g离心10分钟，然后将沉淀重新悬浮于Locke's溶液中。分离所得细胞悬液的细胞密度约为400万细胞/mL。
7. 用于安培法记录胞吐作用及细胞内细胞计量学测量时，将嗜铬细胞以约 17.5 × 10³ 细胞/厘米²² 并在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞₂ 环境。在细胞培养后的1-3天内进行电化学实验。
8. 用于透射电子显微镜成像实验时，将嗜铬细胞接种于75 cm²培养瓶中² 细胞培养瓶中每瓶接种700万至800万细胞，于37 °C、5% CO₂条件下培养₂ 环境培养1天。

2. 单细胞胞吐作用安培法实验²⁴

1. 为制备本实验所用的碳纤维微电极，取一支外径适合本实验所用头端阶段电极夹持器的玻璃毛细管。使用外径为1.2 mm、内径为0.69 mm的硼硅酸盐玻璃毛细管。
   1. 将毛细管的一端连接至吸水导管。将直径为5 µm的碳纤维置于白色纸片等物体表面，以增强可视性。
   2. 识别单根碳纤维，用手指按住纤维一端以固定碳纤维位置，同时将毛细管开口端靠近碳纤维的自由端。轻柔地将碳纤维吸入玻璃毛细管中，使碳纤维从毛细管两端均露出。移除吸力。
2. 将带有碳纤维的毛细管放入微电极拉制仪中，将玻璃毛细管拉制成两根独立的玻璃微电极尖端。使用剪刀剪断连接在两根玻璃尖端之间的碳纤维，获得两根碳纤维微电极。
3. 在显微镜下，将碳纤维置于较厚的显微镜载玻片上，使用手术刀在碳纤维从玻璃毛细管涂层伸出的边缘处进行手动切割。
4. 切割碳纤维后，留下带玻璃涂层的碳纤维尖端，将电极尖端插入环氧树脂溶液中约几毫米，浸泡10分钟，以吸入环氧树脂并密封碳纤维与周围玻璃之间的任何可能空隙。缓慢将电极从环氧树脂溶液中提起，防止在电极尖端形成较大的胶滴。
5. 将电极放置在电极架上（例如，一种扁平的木棒），其两侧贴有耐高温双面胶带，用于固定电极。将经过环氧树脂处理的电极在100 °C的烘箱中烘烤过夜。电极尖端易在接触表面时断裂，因此务必使用固定装置安全存放电极，确保电极位置固定且尖端不会意外触碰。
6. 为获得平坦的圆盘电极表面，将电极置于微型研磨仪的夹持器中，以45°角对每根碳纤维电极进行斜面打磨。打磨完成后，使用记号笔在毛细管顶部做标记，以便后续在将电极置于细胞附近进行胞吐测量时，能够识别圆盘电极表面的45°角方位。
   注意：此步骤非常重要，因为在这些实验中，需要将椭圆形盘状电极平整地放置在细胞上方，使其表面与培养皿表面平行。此外，斜面电极的打磨需在实验当天进行，以确保电极表面新鲜且清洁。
7. 使用前，将每根碳纤维微电极放入测试溶液中（例如，PBS缓冲液（pH 7.4）中含0.1 mM多巴胺），使用循环伏安法监测稳态电流。进行循环伏安扫描时，相对于Ag/AgCl参比电极施加从-0.2 V至+0.8 V的三角波电位，扫描速率为100 mV/s，以确保获得与理论计算值相符的5 µm直径圆盘碳纤维微电极的良好反应动力学数据²⁵.
8. 用于安培法记录胞吐作用时，将培养有嗜铬细胞的培养皿置于倒置显微镜上。由于所测量的电流极微弱，必须使用法拉第笼屏蔽显微镜装置，以消除安培法记录过程中的电子噪声。细胞实验期间，使用显微镜加热载物台维持温度为37 °C。
9. 使用低噪声膜片钳仪器，在工作电极与置于培养皿内远离工作电极的Ag/AgCl参比电极之间施加+700 mV的恒定电位。记录嗜铬细胞胞吐作用时，以10 kHz对信号进行数字化，并应用2 kHz的内部低通贝塞尔滤波器对记录信号进行滤波。
10. 为了在单细胞上进行安培记录，将新磨制并测试过的碳纤维圆盘微电极安装到与恒电位仪配套使用的头阶段电极夹持器中。
    1. 轻轻将电极放置，使电极的扁平椭圆形表面朝下，对准细胞的顶端表面，并使用显微操作器将电极与细胞膜接触。
    2. 通过观察电极接触细胞膜时引起的细胞形变，调节电极与细胞之间的距离，然后小心回撤电极，直至细胞恢复至接近其原始形态。为实现理想的动力学与定量记录，应在电极与细胞表面之间形成约数百纳米厚的薄液层，该条件类似于突触中突触后膜对化学递质释放的检测环境。
11. 为刺激细胞发生胞吐作用，将一支尖端直径为2-3 µm的玻璃微电极置于细胞附近，微电极内充满5 mM BaCl₂₂ 在距离细胞至少 20 µm 的位置施加溶液，以防止移液尖端的溶液泄漏影响实验，并给予 5 mM BaCl 持续 5 秒的注射脉冲₂ 细胞表面的溶液以刺激细胞发生胞吐作用。
12. 为研究渗透压对胞吐作用的可逆影响，配制等渗缓冲液（150 mM NaCl、5 mM KCl、1.2 mM MgCl2、5 mM 葡萄糖、10 mM HEPES，pH 7.4），其渗透压为 310 mOsm/kg；另配制高渗缓冲液，通过调节等渗缓冲液中的 NaCl 浓度，使其渗透压达到 730 mOsm/kg。
13. 将细胞置于等渗缓冲液中，通过施加钡离子注射脉冲刺激细胞发生胞吐，同时记录细胞启动胞吐活动期间约3分钟的安培电流瞬变。
    1. 为比较等渗条件与高渗条件下的胞吐反应，将细胞在高渗缓冲液中孵育10分钟，随后施加钡离子注射脉冲以刺激胞吐，并进行3分钟的安培法记录。
    2. 对于细胞的可逆反应，将细胞再次在等渗缓冲液中孵育10分钟，通过施加5秒的钡离子注射脉冲刺激细胞，并记录细胞3分钟的胞吐反应。
14. 作为对照实验，以确定多次氯化钡刺激对胞吐活性的影响，对三次连续的 BaCl₂ 刺激下胞吐释放进行安培法记录₂ 在等渗缓冲液中对同一细胞进行刺激，并在不同渗透压的连续细胞孵育实验中采用相同的时间程序。

3. 细胞内电化学细胞分析^24,26

1. 为制备用于囊泡量子化大小测量的电极，使用相同的材料，并根据安培法检测胞吐过程中微电极制备的第2.1和2.2节描述，开始制备直径为5 µm的碳纤维电极。
2. 在显微镜下，使用手术刀切割伸出玻璃尖端的碳纤维，使从玻璃尖端突出的碳纤维长度保持在30至100 µm之间。
3. 为制备碳纤维电极的火焰蚀刻尖端，使用丁烷火焰。为获得均匀蚀刻的圆柱形电极尖端，手持圆柱形碳纤维电极并同时旋转，将从玻璃中伸出的碳纤维置于丁烷火焰的蓝色边缘处，直至碳纤维尖端呈现红色，通常耗时少于2秒。若操作成功，可获得直径为50–100 nm的蚀刻电极尖端（此类尖端的扫描电镜图像见图5B）。火焰蚀刻后，将电极置于显微镜下评估其尖端形貌。
4. 将圆柱形纳米尖端微电极插入环氧树脂溶液中3分钟，随后将电极尖端浸入丙酮溶液中15秒。此步骤可使环氧树脂密封碳纤维与绝缘玻璃毛细管壁之间的潜在间隙，同时丙酮可清除蚀刻碳纤维电极表面的环氧树脂。为固化环氧树脂，将电极在100 °C烘箱中烘烤过夜。
5. 使用前，按照第2.7节所述通过循环伏安法测试每根碳纤维微电极的稳态电流。实验中仅选用稳态电流平台在约1.5–2.5 nA²⁷范围内的电极。
6. 进行细胞间安培测量时，将细胞置于显微镜下（如第2.8节所述），并采用第2.9节所述的相同恒电位仪实验设置。
7. 为进行细胞内安培测量并防止对细胞造成显著物理损伤，使用显微操作器施加轻微的机械力，将纳米尖端圆柱形微电极插入细胞，力度应刚好足以使电极穿透细胞质膜并进入细胞质。
8. 插入后，当细胞膜在圆柱形电极周围密封时，立即在活细胞中开始原位安培记录。在施加于电极的氧化电位下，囊泡将吸附至电极表面并随机破裂。  因此，无需任何刺激即可启动该过程。
9. 为确定渗透压对囊泡量子化大小的影响，收集经等渗和高渗缓冲液孵育的细胞群体的细胞内安培测量数据，实验条件如第2.13节所述。

4. 安培法记录的数据分析

1. 为了分析来自胞吐作用和细胞内囊泡量子大小分析的记录安培数据，使用一种能够分析记录的电流-时间曲线中电流瞬变的软件程序，以便确定单个电流峰的动力学峰值参数和积分总电荷。在数据分析中，我们使用了Sulzer实验室开发的、为数据分析程序Igor²⁸编写的软件。
2. 在分析安培尖峰时，为每个记录设置峰值的阈值限制，取噪声均方根（RMS）标准偏差的三倍。
3. 手动收集每个细胞记录中的安培尖峰，以排除不符合高斯形状的伪尖峰、可能由融合的胞吐事件引起的双峰，并仅接受形状呈高斯分布且幅度高于RMS噪声三倍的尖峰。
4. 收集每个单个安培尖峰的总电荷数据，并利用法拉第定律（N=Q/nF）计算每次胞吐或细胞内单个囊泡破裂事件中检测到的儿茶酚胺类神经递质的摩尔量，其中N为在电极表面发生氧化还原反应的神经递质摩尔数，Q为每个尖峰下检测到的总电荷，n为氧化还原反应中转移的电子数（儿茶酚胺类n=2），法拉第常数F=96485 C/mol。
5. 对收集的数据进行统计分析时，首先计算每个细胞每次事件的平均检测电荷。然后，在细胞间差异分析中，计算细胞间的平均电荷，并采用假设方差不等的双样本t检验进行细胞间比较。本研究使用MATLAB程序进行统计分析。

5. 用于囊泡大小分析的透射电子显微镜成像

1. 为在不同渗透条件下对细胞进行透射电子显微镜（TEM）成像，首先将细胞在等渗或高渗缓冲液中于37 °C、5% CO₂环境中孵育10分钟，随后进行化学固定。
2. 采用Karnovsky固定法进行细胞固定²⁹。该方法中，使用含0.01%叠氮化钠、1%甲醛和1.25%戊二醛的溶液孵育细胞，固定后的样品可在4 °C下保存。
3. 固定完成后，用0.15 M二甲胂酸钠缓冲液洗涤细胞。
4. 为在固定后对细胞样本进行染色并准备TEM成像，将细胞在1%四氧化锇溶液中4 °C孵育2小时，随后在室温避光条件下用0.5%醋酸铀酰溶液孵育1小时。
5. 在最终固定步骤中，先用100%乙醇冲洗细胞以进行脱水，然后用丙酮冲洗细胞。
6. 将细胞样本包埋于环氧树脂中，随后在4,000 × g条件下离心30–40分钟，并在40 °C下聚合15小时，接着在60 °C下孵育48小时以完成固化。
7. 为准备成像，使用超薄切片机将包埋在Agar 100树脂中的细胞样本切成60 nm厚的切片。
8. 将切片置于4%醋酸铀酰/25%乙醇溶液中染色4分钟，随后用水冲洗20秒；再用Reynolds柠檬酸铅染色3分钟，之后再次用水冲洗20秒。
9. 对细胞样本进行透射电子显微镜成像。在本实验中，我们使用的透射电子显微镜工作电压为120 kV。
10. 从每张记录的细胞切片图像中（显示细胞超微结构及细胞质内囊泡群体），首先通过将像素与TEM图像中标注的比例尺对应，校准图像的像素尺寸。使用图像分析软件测定在等渗或高渗条件下处理的细胞图像中囊泡的大小。在本实验中，我们采用ImageJ软件进行图像分析。需要注意的是，在对TEM图像中的细胞超微结构进行图像分析时，应考虑基于细胞切片厚度对测量尺寸进行校正，该方法此前已由Almers实验室描述³⁰。

结果

本文描述了一种将透射电子显微镜（TEM）成像与两种电化学方法——碳纤维安培法和细胞内电化学细胞分析法相结合的实验方案，该方案可提供更全面的信息，揭示细胞外渗透压对分泌囊泡及胞吐过程的影响。通过比较在实验装置（见图1）下获得的单个嗜铬细胞胞吐释放的典型安培记录，在高渗应激条件下暴露的细胞相较于等渗条件下的细胞，其胞吐活性显著降低（图2A）²⁴。基于这些记录，并结合法拉第定律，可通过每个单独的安培电流尖峰所检测到的总电荷量，计算出在不同渗透条件下细胞单个囊泡胞吐事件中释放的分子数量。进一步比较发现，如图2B所示，在高渗溶液中细胞检测到的平均安培电流尖峰面积较小，表明在感知渗透应激的细胞中，每个囊泡释放的神经递质分子数量减少²⁴。

为了确定神经递质分子释放数量减少的可逆性，我们对暴露于高渗环境中的细胞进行了安培法记录...

讨论

本文介绍了一种结合三种互补分析方法的实验方案及其优势，用于分析分泌囊泡及胞吐过程，以更深入地理解诸如渗透压等物理力如何影响分泌细胞中的分泌囊泡及胞吐过程。这些方法包括碳纤维微电极安培法——一种记录胞吐活性的成熟技术；细胞内电化学细胞分析法——用于在囊泡的天然环境中测定其量子化大小；以及透射电子显微镜图像分析——用于监测分泌囊泡的体积。在本研究中，通过采集嗜铬细胞在等渗和高渗细胞外环境中单个囊泡胞吐事件的安培法记录数据，我们证实渗透压冲击显著减少了胞吐过程中神经递质的释放量，并且当细胞重新置于等渗环境时，其能够可逆性恢复并释放原始数量的递质（图3）。

安培法记录提供了胞吐事件频率随时间变化的信息，因此也可用于监测不同渗透环境下的细胞胞吐活性变化。这些数据可用于判断活性改变是即时发生，还是随时间推移而逐渐出现。正如我们先前的研究所示，尽管渗透应激抑制了胞吐活性，但似乎并未阻碍可立即释放囊泡池的融合²⁴。胞吐活性数据还可用于分析在一段记录时间内总的胞吐活性。本文展示了嗜铬细胞在两种...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
KCl	Sigma Aldrich	P9333
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma Aldrich	M-2670
葡萄糖	Sigma Aldrich	G8270
胶原酶 P	Roche, Sweden	11 213 857 001
100-µM 尼龙滤网	Fisher Sientific	08-771-19
Percoll	Sigma Aldrich	P1677
胶原蛋白IV包被的60 mm塑料培养皿	VWR	354416
离心机	Avanti J-20XP
硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter instrument Co., Novato, CA
微量移液器拉制仪	Narishing Inc., Japan	PE-21
环氧树脂溶液（A和B）	Epoxy technology, Billerica, MA
微电极斜面抛光仪	Narishing Inc.	EG-400
倒置显微镜	Olympus	IX81
膜片钳仪器	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	Axopatch 200B
微操纵器	Burleigh Instrument Inc., USA	PCS-5000
丁烷火焰	Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
透射电子显微镜	Omega	Leo 912 AB