监测渗透压胁迫对分泌囊泡及胞吐作用的影响

摘要

渗透压应激影响胞吐作用以及在此过程中释放的神经递质的量。我们展示了如何结合电化学方法与透射电子显微镜技术，用于研究细胞外渗透压对胞吐活性、囊泡量子大小以及胞吐过程中释放的神经递质量的影响。

摘要

对经历渗透冲击的细胞进行安培法记录显示，分泌细胞对此类物理应激的响应表现为胞吐活性降低，以及单个胞吐事件中囊泡释放的神经递质含量减少。有研究认为，释放的神经递质减少可能是由于细胞在渗透应激下发生皱缩，导致细胞膜生物物理性质发生改变所致；同时假定细胞质内的分泌囊泡不受细胞外渗透应激的影响。安培法记录可监测囊泡与质膜融合瞬间所释放的物质，但无法提供囊泡融合前其内容物的信息。因此，将安培法记录与其他能够表征胞吐发生前细胞内分泌囊泡特性的互补分析方法相结合，可更全面地研究分泌囊泡及胞吐过程如何受到渗透冲击的影响。本文描述了如何将安培法记录与细胞内电化学细胞分析及透射电子显微镜（TEM）成像相结合，用于表征嗜铬细胞在渗透应激前后分泌囊泡的大小及神经递质含量的变化。通过整合三种分析方法所获得的定量信息，先前的研究已得出结论：分泌囊泡对外部渗透应激的响应表现为体积缩小，并减少囊泡的量子化大小，以维持囊泡内神经递质浓度的恒定。这在一定程度上解释了为何在渗透应激下，囊泡在胞吐过程中释放的神经递质量会减少。本文中的安培法记录表明，这一过程是可逆的；当细胞重新置于等渗环境中后，经历渗透冲击的囊泡可重新填充神经递质。

引言

肾上腺中的嗜铬细胞是一类神经内分泌细胞，能够将神经递质分子释放到血液中。这一过程通过细胞内的机制实现，涉及装载神经递质的囊泡与细胞膜的锚定和融合，使囊泡内容物释放到细胞外空间，该过程称为胞吐作用。嗜铬细胞中的神经递质（肾上腺素和去甲肾上腺素）通过膜蛋白主动转运至大电子致密核心囊泡（LDCVs）中，并以高浓度（约0.5–1 M）储存^1,2。神经递质在LDCVs内的积累依赖于儿茶酚胺分子与囊泡内致密核心蛋白基质之间的亲和力，该基质主要由嗜铬粒蛋白家族组成（浓度约169 mg/mL）^3,4,5,6，以及囊泡内含有关键成分的混合溶液，包括ATP（125–300 mM）⁷、Ca²⁺（溶液中50–100 µM，约40 mM结合于蛋白基质）⁸、Mg²⁺（5 mM）⁹、抗坏血酸（10–30 mM）¹⁰，以及pH值约为5.5的酸性环境

方案

1. 通过酶消化法从肾上腺分离的牛嗜铬细胞的细胞培养

1. 从牛肾上腺中分离嗜铬细胞时，先用70%乙醇溶液对组织进行灭菌。使用解剖刀去除脂肪和结缔组织。为去除血液，用已预热至37 °C的Locke's溶液（NaCl 154 mM，KCl 5.6 mM，NaHCO3 3.6 mM，羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）5.6 mM，pH 7.4）冲洗肾上腺静脉。
2. 通过注射器经肾上腺静脉向每个腺体注入约2.5 mL温热的、经无菌过滤的0.2%胶原酶P溶液以膨胀腺体，从而消化组织，并在37 °C下孵育组织20分钟。检查腺体以确认髓质的消化过程已完成，组织应感觉柔软，无张力。
3. 沿纵向剪开腺体以收集消化后的髓质组织，用手术刀切碎髓质组织。将组织悬液通过钢筛过滤，并用Locke's溶液稀释至约50 mL体积，以降低胶原酶P的活性。
4. 在室温下以 300 x g 离心 10 分钟，使细胞沉淀，收集至 50 mL 无菌试管中。用 20 mL Locke 溶液重悬所得沉淀，并将溶液经无菌 100-µm 尼龙滤网过滤至试管中。
5. 将嗜铬细胞悬液与无菌Percoll按1:1比例混合，室温下以18,600 × g离心20分钟。收集密度梯度的上层液体，经100-µm尼龙滤网过滤至离心管中。
6. 为去除Percoll，用Locke's溶液稀释细胞悬液，在室温下以300 × g离心10分钟，然后将沉淀重新悬浮于Locke's溶液中。分离所得细胞悬液的细胞密度约....

结果

本文描述了一种将透射电子显微镜（TEM）成像与两种电化学方法——碳纤维安培法和细胞内电化学细胞分析法相结合的实验方案，该方案可提供更全面的信息，揭示细胞外渗透压对分泌囊泡及胞吐过程的影响。通过比较在实验装置（见图1）下获得的单个嗜铬细胞胞吐释放的代表性安培记录，在高渗应激条件下暴露的细胞相较于等渗条件下的细胞，其胞吐活性显著降低（图2A）²⁴。基于这些记录并结合法拉第定律，可通过每个独立的安培电流尖峰所检测到的总电荷量，计算在不同渗透条件下暴露的细胞中单个囊泡胞吐事件所释放的分子数量。进一步比较发现，如图2B所示，在高渗溶液中细胞检测到的平均安培电流尖峰面积较小，表明处于渗透应激状态的细胞每个囊泡释放的神经递质分子更少²⁴。

为了确定神经递质分子释放数量减少的可逆性，我们对暴露于高渗环境的细胞以及随后重新置于等.......

讨论

本文介绍了一种结合三种互补分析方法的实验方案及其优势，用于分析分泌囊泡及胞吐过程，以更深入地理解诸如渗透压等物理力如何影响分泌细胞中的分泌囊泡及胞吐过程。这些方法包括碳纤维微电极安培法——一种记录胞吐活性的成熟技术；细胞内电化学细胞分析法——用于在囊泡的天然环境中测定其量子化大小；以及透射电子显微镜图像分析——用于监测分泌囊泡的体积。在本研究中，通过采集嗜铬细胞在等渗和高渗细胞外环境中单个囊泡胞吐事件的安培法记录数据，我们证实渗透压冲击显著减少了胞吐过程中神经递质的释放量，并且当细胞重新置于等渗环境时，其能够可逆性恢复并释放原始数量的递质（图3）。

安培法记录提供了胞吐事件频率随时间变化的信息，因此也可用于监测不同渗透环境下的细胞胞吐活性变化。这些数据可用于判断活性改变是即时发生，还是随时间推移而逐渐出现。正如我们先前的研究所示，尽管渗透应激抑制了胞吐活性，但似乎并未阻碍可立即释放囊泡池的融合²⁴。胞吐活性数据还可用于分析在一段记录时间内总的胞吐活性。本文展示了嗜铬细胞在两种.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
KCl	Sigma Aldrich	P9333
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma Aldrich	M-2670
葡萄糖	Sigma Aldrich	G8270
胶原酶 P	Roche, Sweden	11 213 857 001
100-µM 尼龙滤网	Fisher Sientific	08-771-19
Percoll	Sigma Aldrich	P1677
胶原蛋白IV包被的60 mm塑料培养皿	VWR	354416
离心机	Avanti J-20XP
硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter instrument Co., Novato, CA
微量移液器拉制仪	Narishing Inc., Japan	PE-21
环氧树脂溶液（A和B）	Epoxy technology, Billerica, MA
微电极斜面抛光仪	Narishing Inc.	EG-400
倒置显微镜	Olympus	IX81
膜片钳仪器	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	Axopatch 200B
微操纵器	Burleigh Instrument Inc., USA	PCS-5000
丁烷火焰	Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
透射电子显微镜	Omega	Leo 912 AB