利用流式细胞术分析单只小鼠单侧坐骨神经和背根神经节中的免疫细胞

摘要

由于小鼠坐骨神经组织稀少，对其进行细胞成分的定量分析较为困难。本方案描述了一种组织消化与制备方法，可获得足够数量的细胞，用于对单只小鼠神经中的免疫细胞群体进行流式细胞术分析。

摘要

周围神经系统（PNS）中定居的免疫细胞对于维持健康神经内的神经元完整性至关重要。PNS的免疫细胞会受到损伤和疾病的影响，从而影响神经功能及再生能力。神经元相关的免疫细胞通常通过免疫荧光（IF）进行分析。尽管IF在确定免疫细胞在神经中的定位方面至关重要，但该方法仅为半定量，且受限于可同时分析的标记物数量以及表面表达水平。本研究采用流式细胞术对单只小鼠坐骨神经或背根神经节（DRG）中的白细胞浸润进行定量分析。通过DAPI进行单细胞分析，并同时检测多种蛋白的表面或胞内表达。按照本方案处理同一只小鼠的双侧坐骨神经，均可获得≥30,000个单核细胞事件。通过CD45表达确定的坐骨神经中白细胞比例约占坐骨神经总细胞含量的5%，在DRG中约为5–10%。尽管本方案主要聚焦于PNS内的免疫细胞群体，但由于流式细胞术具备可同时检测多种标记物的灵活性，因此也可用于分析神经中其他细胞群体，如施万细胞、周细胞、成纤维细胞和内皮细胞。因此，该方法为研究全身性因素对PNS的影响提供了新途径，例如神经毒理学、神经病变的遗传模型或糖尿病等慢性疾病中的相关研究。

引言

通过表达 CD45 和 CD11b 鉴定的、从循环系统进入周围神经系统（PNS）的免疫细胞，有助于维持神经的完整性，并在神经再生与变性过程中发挥重要作用¹。巨噬细胞（在小鼠中通过表达 CD68 鉴定）可极化为促炎表型，其表面表达较高水平的主要组织相容性复合体 II 类分子（MHC class II）和 CD86（M1），或极化为抗炎表型，表达较高水平的细胞内 CD206（M2）²。巨噬细胞表型的极化是一个由 Akt 信号通路调控的动态过程³，反映了巨噬细胞在抵御病原体（M1）和组织再生（M2）中承担的不同功能。受损神经的再生首先需要巨噬细胞在神经内吞噬髓鞘碎片^4,5，而抗炎型（CD68⁺CD206⁺）M2 巨噬细胞已被证明可促进周围神经系统中的轴突生长⁶。巨噬细胞向 PNS 的募集减少，或其吞噬能力受损，可能导致神经再生受阻及神经完整性维持障碍。表达 MHC class II 的促炎型 M1 巨噬细胞的吞噬能力弱于 M2 巨噬细胞，且神经炎症已被认为参与多种神经退行性疾病的发病机制⁷。

损伤后，神经驻留免疫系统可能发生定量或定性的变化。定量变化表现为CD45⁺白细胞的减少（或在发生炎症时表现为CD45⁺白细胞浸润增加），而定性变化则如巨噬细胞表型由M2向M1表型转变。传统上，周围神经系统（PNS）的免疫细胞通过免疫荧光（IF）技术，利用冰冻切片或石蜡包埋组织进行分析⁸。免疫荧光技术对于确定目标细胞的定位是必需的。然而，基于免疫荧光的定量分析通常依赖于在组织的狭小切片区域内计数相对较少的细胞，导致定量结果不可靠且易受选择偏倚影响。为了鉴定特定免疫细胞亚群，需要同时检测细胞外和/或细胞内标志物；而确定巨噬细胞表型则至少需要两个标志物，即CD206和MHC II类分子。由于大多数常用的显微镜最多仅具备两个荧光通道（如异硫氰酸荧光素（FITC）和藻红蛋白（PE）），因此通过免疫荧光对免疫细胞亚群进行表征可能受到限制且不完整，往往需要制备来自同一感兴趣区域的多个切片，并行染色和分析。这一耗时的过程因而并不适用于大规模样本集的分析。此外，由于大多数目标标志物位于细胞表面，当组织经过石蜡包埋或冷冻保存处理后，细胞膜完整性可能遭到破坏，表位可能被遮蔽，同时在使用丙酮、甲醇等溶剂的过程中可能导致目标抗原丢失，从而给检测带来困难⁹。

相比之下，流式细胞术通过测量悬浮单个细胞在通过光束时的光学和荧光特性，为细胞群体的分析提供了更为实用且全面的方法。流式细胞术并不生成组织的数字图像，而是对一组参数进行自动化定量分析，这些参数包括细胞的相对大小和折射率（称为前向散射，FSC）、颗粒度/内部复杂性（即侧向散射，SSC），以及相对荧光强度（前提是细胞已用适当的荧光染料标记，例如偶联抗体）。典型的流式细胞仪包含两束空气冷却激光：氩离子激光器发射波长为488 nm的蓝光，氦氖激光器发射波长为633 nm的光。这种组合可同时检测和测量至少五个位于细胞表面或细胞内区室的靶标。更先进的流式细胞仪可配备多束激光，能够在所选荧光染料的发射峰波长无明显重叠的前提下，同时检测多达八种不同的荧光染料。

为了进行流式细胞术分析，首先必须通过酶消化（通常使用胶原酶）将目标组织处理成单细胞悬液。由于从小鼠获取的坐骨神经组织量较少，此前对小鼠坐骨神经的分析一直较为困难。此外，轴突周围髓鞘的高脂肪含量会阻碍细胞回收，并产生大量碎片。本文所述的坐骨神经制备与消化方法改编自 Barrette et al.⁷ 的施万细胞分离方案，旨在从单只小鼠的神经中分离出足够数量的细胞用于流式细胞术分析，从而减少个体小鼠之间的差异。在原始组织消化物中使用 DAPI 鉴定单细胞，可避免去除轴突碎片的步骤——该步骤通常会导致细胞丢失。使用富含去污剂的缓冲液多次洗涤，有助于释放被困在脂肪碎片中的细胞，从而提高得率。按照本方案消化单只小鼠的两条完整坐骨神经，可获得 ≥30,000 个单核事件，而从背根神经节（DRG）中回收的细胞数量至少为此数量的 3 倍。坐骨神经消化物中 CD45⁺ 白细胞约占总细胞含量的 5%，在 DRG 消化物中则约为 5–10%。坐骨神经中大多数 CD45⁺ 细胞表达巨噬细胞标志物 CD68 和 CD206。

方案

野生型 C57BL/6 小鼠（雄性；10–12 周龄）饲养于标准的 12 小时光照/12 小时黑暗循环环境中，可自由摄取标准饲料和水。所有动物实验均按照当地动物护理和使用委员会的相关指南进行，并经德国卡尔斯鲁厄地区主管部门的动物护理和使用委员会批准（G216/10）。

1. 小鼠灌注

1. 使用 CO₂ 处死小鼠（C57BL/6；雄性；10–12 周龄）₂ 或根据当地法规。
   注意：可采用经EDTA包被的1.5 mL离心管通过眶后静脉丛采血获取对照组白细胞。该采血方法仅在动物处死后立即操作时有效。此外，可通过腹腔灌洗（PCL）获取对照组巨噬细胞，灌洗时应使用预热至37 °C的磷酸盐缓冲液（PBS），以避免血液发生冷凝集，从而影响灌注效果。
2. 用70%（v/v）乙醇充分喷洒小鼠腹部毛发进行消毒，并用带有棉纱布的纸巾反复擦拭。使用钝头剪刀沿纵轴切口剪开腹部皮肤。
3. 使用弯头钝头剪刀在膈肌上做一切口，随后沿整个肋骨全长延伸切口，以暴露胸膜腔。在对侧进行类似切口，直至可小心抬起胸骨。
4. 在清晰暴露心脏及主要血管后，将连接有50 mL冰浴PBS注射器的23¾号蝶形针插入心脏左心室。
5. 使用虹膜剪在心脏右心房做切口，尽可能扩大出口，但不得损伤降主动脉，然后轻轻按压注射器，推动约 30 mL PBS。流出液应变得澄清。肝脏和/或肾脏的澄清可作为灌注良好的指标。

2. 坐骨神经和背根神经节的解剖

注意：坐骨神经解剖时，需去除臀大肌上方的皮肤，并将小鼠腹侧朝下放置，同时伸展其下肢。

1. 通过分离上背部大腿的肌肉组织，双侧解剖坐骨神经全长，并沿脊柱方向追踪神经。在神经从脊柱发出处以及另一端膝关节上方立即切断神经。
   注意：避免过度操作神经，例如用镊子挤压或牵拉。
2. 使用镊子将切除的神经（每根约 2 cm）转移至含有 1 mL 冰冷 PBS 的 1.5 mL 离心管中，并置于冰上保存。
   注意：神经可在冰上保存过夜。
   注意：对于背根神经节（DRG）的解剖，使用镊子和手术刀，轻轻剥离残留的背部皮肤，使皮下软组织分离，暴露颈椎、胸椎和腰椎脊柱区域。用钝头剪刀在颅底处剪断，移除头部。
3. 在脊柱两侧平行且紧邻脊柱处剪断肋骨，然后去除与脊柱前侧相连的内脏组织。剪断股骨，并在股骨水平处横向切断，移除整个脊柱。使用虹膜剪清除脊柱上的肌肉、脂肪及其他软组织。
4. 将脊柱背侧朝上放置，从尾端开始打开脊柱：将剪刀的一侧尖端插入椎管三点钟位置并剪除骨质；在九点钟位置重复该操作。
   注意：必须精确沿中线切割，以避免损伤背根神经节（DRG）。
5. 重复侧向剪切，直至到达头端，完全暴露脊髓。在解剖显微镜下移除脊髓，以暴露脊神经，从而帮助定位脊柱内的背根神经节（DRG）。
6. 通过轻拉背根，将腰段 DRG 缓慢拉入椎管内，然后用虹膜剪剪断神经及结缔组织，以分离 DRG。
   注意：可选择性收集 L4–L6 节段的 DRG，这些节段参与构成坐骨神经。
7. 使用镊子将 DRG 转移至含有约 1 mL 冰冷 PBS 的 1.5 mL 离心管中，并置于冰上保存。
   注意：神经可在冰上保存过夜。

3. 坐骨神经和背根神经节的消化

1. 配制消化液（DMEM、10 mM HEPES、5 mg/mL BSA、1.6 mg/mL IV型胶原酶），并加入100 µg/mL脱氧核糖核酸酶，置于冰上保存。
   注意：每只小鼠（坐骨神经 + 背根神经节）所需消化液的体积为1 mL。配制完成后，可将消化液分装后于-20 °C保存。
2. 将一只小鼠的坐骨神经和背根神经节分别转移至含有500 µL消化液的1.5 mL离心管中。对于坐骨神经，使用弹簧剪将其剪成15–20小段，然后将组织悬液在37 °C摇床中孵育20分钟，轻柔振荡（≤ 450 rpm）。
3. 使用1,000 µL移液枪头反复吹打细胞悬液，以机械方式解离未完全消化的组织。
   注意：若悬液难以吹打，可用剪刀剪去枪头尖端以形成钝口。将组织悬液在37 °C孵育20分钟，轻柔振荡（≤ 450 rpm）。
4. 再次使用1,000 µL移液枪头进行吹打，并在37 °C继续孵育10分钟，轻柔振荡（≤ 450 rpm）。
5. 配制FACS缓冲液（含10% FCS和1 mM EDTA的PBS），置于冰上。将孔径为140 µm的不锈钢筛网在冰上的60 × 15 mm培养皿中用FACS缓冲液冲洗并浸泡。
   注意：应避免使用尼龙筛网过滤器，因其会导致有核细胞得率显著降低。
6. 将组织悬液置于冰上，用钝头镊子夹持140 µm筛网过滤器覆盖于培养皿上方，反复使悬液通过筛网。从培养皿中收集细胞悬液，并转移至另一个置于冰上的新1.5 mL离心管中。
7. 使用1,000 µL移液枪头反复吹打，将残留在滤网上的未完全消化的组织推过筛网。用500 µL FACS缓冲液冲洗筛网两次，并将所得细胞悬液收集至培养皿中，与步骤3.6的细胞悬液合并。
   注意：若所用流式细胞仪对碎片敏感，可将步骤3.7的细胞悬液再通过70 µm筛网过滤；但此操作可能导致有核细胞得率下降。
8. 将细胞悬液在4 °C下以300 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL FACS缓冲液中。重复洗涤一次。
9. 根据所需染色组合的数量，将细胞沉淀重悬于150–350 µL FACS缓冲液中（每种染色组合需150 µL FACS缓冲液）。

4. 使用荧光标记抗体对坐骨神经和背根神经节进行染色以用于流式细胞术

1. 将100 µL坐骨神经或背根神经节细胞悬液转移至预置于冰上的96孔板的V型孔中。
   注意：使用的所有抗体均需设置单染细胞，因其可为流式细胞术的光电倍增管（PMT）电压增益和补偿设置提供必要的对照，并有助于区分特异性与非特异性结合。由于坐骨神经和背根神经节（DRGs）可获取的材料有限，可采用坐骨神经结扎（PCL）模型中的血液白细胞和巨噬细胞（步骤1.1–1.2）作为单染对照，其染色应与坐骨神经和DRGs的染色平行进行。
2. 将来自坐骨神经或DRG样本的剩余细胞悬液（每份样本约50 µL）合并，作为未染色对照。
3. 在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟。将板倒置于废液容器上方，通过快速甩动手腕弃去上清液，然后在纸巾上轻轻拍干。
4. 对于表面染色，将每个细胞沉淀重悬于20 µL含有目标抗体（CD45-A647、CD11b-PerCP/Cy5.5和MHC II类分子-Biotin）的FACS缓冲液中，避光冰上孵育30分钟。
   注意：（1）最佳抗体稀释度应在使用前通过根据生产商产品信息进行系列稀释实验确定；（2）在此步骤中，可根据生产商说明书通过加入Fc阻断剂孵育以减少非特异性染色；（3）当使用直接偶联荧光染料的初级抗体和/或目标抗原可产生明显分群时，通常无需进行同型对照染色。
5. 向每孔中加入130 µL FACS缓冲液，在4 °C下以400 × g离心5分钟。弃去上清液（同前，步骤4.3），用150 µL FACS缓冲液将细胞沉淀洗涤两次。
   注意：如果使用未标记的一抗或生物素标记的一抗，则可在此时加入相应的荧光标记二抗，并重复步骤4.4–4.5。在本实验方案中，分别使用链霉亲和素-PE/Cy7或链霉亲和素-PerCP检测MHC II类分子，与CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5组合，或与CD68-APC和F4/80-PE/Cy7组合。
6. 固定时，在最后一次洗涤步骤后，将细胞沉淀重悬于 100 µL 含 4% 多聚甲醛的 PBS（pH 7.4）中。将培养板置于冰上孵育 10 分钟，然后在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。弃去上清液（操作同前，步骤 4.3），再用 150 µL FACS 缓冲液洗涤细胞沉淀一次。
   注意：多聚甲醛有毒性，需佩戴适当的防护装备，如手套和护目镜。 等等.
   注意：将细胞沉淀重悬于150 µL FACS缓冲液中，避光保存于4°C，可存放最多两天。若无需进行细胞内染色，则在4°C下以400 × g离心5分钟后，继续进行步骤4.11。
7. 对于细胞内染色，将细胞沉淀重悬于150 µL含0.5%去污剂的FACS缓冲液中，室温避光孵育15分钟。在4 °C下以400 × g离心5分钟。弃去上清液（操作同前，步骤4.3），用150 µL含0.5%去污剂的FACS缓冲液洗涤细胞沉淀一次。将细胞沉淀重悬于20 µL含目的抗体（CD68-APC，CD206-PE）及0.5%去污剂的FACS缓冲液中，室温避光孵育30分钟。
8. 加入130 µL含0.5%去垢剂的FACS缓冲液至各孔中，于4 °C下以400 × g离心5分钟。弃去上清液（操作同前，步骤4.3），用150 µL含0.5%去垢剂的FACS缓冲液将细胞沉淀洗涤两次。
   注意：如果使用未标记的一抗或生物素标记的一抗，此时可加入相应的荧光染料标记的二抗，并重复步骤4.9–4.10。
9. 将细胞沉淀重悬于150 µL含0.5%去污剂的FACS缓冲液中，避光保存于4 °C，可存放至多两天。
10. 用150 µL含0.5%去垢剂并补充5 µg/mL DAPI的FACS缓冲液重悬细胞沉淀，在室温避光孵育5分钟。在4 °C下以400 × g离心5分钟。弃去上清液，操作同前（步骤4.3）。
11. 将细胞沉淀重悬于150 µL PBS中，转移至相应标记的FACs管中。避光、室温保存，待分析时使用。
    注意：细胞在 PBS 中重悬后应在数小时内进行分析，因为 DAPI 会缓慢从 DNA 上解离，导致信号减弱。

5. 流式细胞术的设置与样本检测

1. 确保流式细胞仪配备了适当的激光器和/或滤光片组，以检测用于染色细胞的荧光染料。这可在系统的默认细胞仪配置下确定。在本方案中，使用配备三种激光器（405 nm、488 nm 和 633 nm）的流式细胞仪分析细胞，可检测 ≤ 5 种荧光染料。
2. 选择用于检测目标荧光染料的合适通道。所有荧光信号均建议采用对数放大方式进行检测。
3. 为样本选择合适的流速。该参数可能因所用系统而异，需通过实验经验确定。在本方案中，采用中至高流速（MED-to-HI，35–60 µL/min），以防止进样针堵塞。
4. 设定每个样本需采集的总事件数/细胞数。最低事件数应为 1,000,000。
5. 在全局工作表中创建散点图，包括SSC-A 与 FSC-A 的关系图，以及每种目标荧光染料与 FSC-A 的关系图。创建一个统计视图，以显示所选荧光染料的事件数量和平均荧光强度（MFI）。
6. 设置 FSC-A 和 SSC-A 通道的电压，使最小的细胞位于散点图左下角的 10% 区域内。通过坐骨神经或背根神经节（DRG）的未染色对照样本确定背景荧光和最低样本荧光。根据仅使用 DAPI 染色的对照样本的散点图确定父代（P1）门控。
   注意：由于外周神经系统（PNS）中 DAPI+ 群体具有异质性，此门控不用于分选。
7. 利用每种目标荧光染料的 FSC 散点图，调整电压，使未染色对照样本的细胞位于各自散点图的下四分之一区域内。然后在该区域上方建立门控，以定义各相应标记物/荧光染料阳性的细胞。通过运行单染对照样本（步骤 4.1）确认门控位置。
   注意：可在当前步骤进行补偿以校正发射光谱重叠，也可在后续使用适当的分析软件进行回溯性补偿。
8. 按照上述设置完成流式细胞仪配置后，即可开始运行样本。
9. 运行结束后，剩余样本材料可予以丢弃，并导出 FCS 文件以供进一步分析。

结果

根据实验方案，从六只健康的C57BL/6小鼠的完整坐骨神经和所有主要背根神经节（DRG）制备细胞悬液，并将其均分为三等份用于染色。使用可染色DNA的DAPI进行复染，可实现单细胞群体的识别（图1A-B，上图）。在进行流式细胞术分析前洗去DAPI，可在一定程度上降低无核碎片的荧光强度，从而有助于在FSC轴上选择出单核事件（即单细胞群体）。由于周围神经系统（PNS）来源的单细胞在FSC和SSC上分布范围较广，因此不设置收集门控（图1C）。在FSC轴高端的物质包含未完全消化的组织，在选择单细胞群体时必须将其排除（图1A-B）。使用密度图（下图）展示结果有助于排除大块碎片（下图）。通常可从两条完整的坐骨神经中获得≥30,000个单细胞，从DRG中可获得≥200,000个...

讨论

坐骨神经含有大量脂质（如胆固醇），这是由于轴突周围存在髓鞘。由于脂质的性质会随温度变化，在不同温度下操作可能导致不同的结果。为了确保细胞的完整性，本实验方案中自消化步骤之后的所有操作均在冰上进行。尽管为了结果的可重复性建议保持操作条件的一致性，但将步骤 3.6 和 3.7 在室温下进行可能有助于提高细胞得率。在步骤 3.8 中，如果神经组织未充分消化，则在滤网上可见细小的神经组织碎片。若消化不充分，可将滤网上残留的组织转移至新的 1.5 mL 离心管中，加入 250 µL 消化液，重复步骤 3.2–3.6 进行再次消化。如果细胞得率较低，应在滤网过滤后（步骤 3.6）取细胞悬液样本，加入台盼蓝染液，于光学显微镜下观察。应可见未被染色的活细胞以及杆状结构（即轴突碎片）。若未见活细胞，说明消化条件不当或样品处理过程中操作失误导致了细胞坏死。若仅观察到大量细胞团块，则建议通过离心收集样品，并重复消化步骤（步骤 3.2–3.6）。

小鼠坐骨神经和背根神经节（DRG）的流式细胞仪分析方法适用于涉及整段神经及多个DRG的研究问题。近年来，利用流式细胞术分析周围神经系统（PNS）的兴趣日益增加<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6 小鼠	查尔斯河	C57BL/6NCrl
DMEM（含1g/L葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸）	赛默飞	31885023	该材料的来源不重要
HEPES	西格玛-奥德里奇	H3375
牛血清白蛋白（BSA）	西格玛-奥德里奇	A2153
IV型胶原酶	沃辛顿生化公司，美国	LS004188
脱氧核糖核酸酶（DNase）I，来源于牛胰腺 I	西格玛-奥德里奇	DN25-1g
乙二胺四乙酸（EDTA）	西格玛-奥德里奇	E6758
胎牛血清（FCS），热灭活	西格玛-奥德里奇	F4135
抗CD11b-PerCP/Cy5.5抗体	生物传奇	101228	克隆号 M1/70
抗MHC II类分子生物素标记抗体	生物传奇	107603	克隆号 M5/114.15.2
抗CD45-A647抗体	生物传奇	107603	克隆号 30-F11
抗CD68-APC抗体	生物传奇	137007	克隆号 FA/11
抗CD206-PE抗体	生物传奇	141706	克隆号 C068C2
抗F4/80-PE/Cy7抗体	生物传奇	123113	克隆号 BM8
链霉亲和素-PE/Cy7	生物传奇	405206	用于与CD45-A647和CD11b-PerCP/Cy5.5联合检测MHCII-生物素
链霉亲和素-PerCP	生物传奇	405213	用于与CD68-APC和F4/80-PE/Cy7联合检测MHCII-生物素
吐温-100	西格玛-奥德里奇	T8787
DAPI	西格玛-奥德里奇	D9542-1MG	用PBS稀释至50倍，避光保存于4 °C
细胞分离筛—组织研磨试剂盒	西格玛-奥德里奇	CD1
V型96孔板	格瑞纳/西格玛	M8185
5 ml 聚苯乙烯圆底管，12×75 mm	BD 生物科学	352008
60×15 mm 培养皿	格瑞纳/西格玛	Z643084
BD LSR II 流式细胞仪	BD 生物科学