利用流式细胞术分析单只小鼠单侧坐骨神经和背根神经节中的免疫细胞

摘要

由于小鼠坐骨神经组织稀少，对其进行细胞成分的定量分析较为困难。本方案描述了一种组织消化与制备方法，可获得足够数量的细胞，用于对单只小鼠神经中的免疫细胞群体进行流式细胞术分析。

摘要

周围神经系统（PNS）中定居的免疫细胞对于维持健康神经内的神经元完整性至关重要。PNS的免疫细胞会受到损伤和疾病的影响，从而影响神经功能及再生能力。神经元相关的免疫细胞通常通过免疫荧光（IF）进行分析。尽管IF在确定免疫细胞在神经中的定位方面至关重要，但该方法仅为半定量，且受限于可同时分析的标记物数量以及表面表达水平。本研究采用流式细胞术对单只小鼠坐骨神经或背根神经节（DRG）中的白细胞浸润进行定量分析。通过DAPI进行单细胞分析，并同时检测多种蛋白的表面或胞内表达。按照本方案处理同一只小鼠的双侧坐骨神经，均可获得≥30,000个单核细胞事件。通过CD45表达确定的坐骨神经中白细胞比例约占坐骨神经总细胞含量的5%，在DRG中约为5–10%。尽管本方案主要聚焦于PNS内的免疫细胞群体，但由于流式细胞术具备可同时检测多种标记物的灵活性，因此也可用于分析神经中其他细胞群体，如施万细胞、周细胞、成纤维细胞和内皮细胞。因此，该方法为研究全身性因素对PNS的影响提供了新途径，例如神经毒理学、神经病变的遗传模型或糖尿病等慢性疾病中的相关研究。

引言

通过表达 CD45 和 CD11b 鉴定的、从循环系统进入周围神经系统（PNS）的免疫细胞，有助于维持神经的完整性，并在神经再生与变性过程中发挥重要作用¹。巨噬细胞（在小鼠中通过表达 CD68 鉴定）可极化为促炎表型，其表面表达较高水平的主要组织相容性复合体 II 类分子（MHC class II）和 CD86（M1），或极化为抗炎表型，表达较高水平的细胞内 CD206（M2）²。巨噬细胞表型的极化是一个由 Akt 信号通路调控的动态过程³，反映了巨噬细胞在抵御病原体（M1）和组织再生（M2）中承担的不同功能。受损神经的再生首先需要巨噬细胞在神经内吞噬髓鞘碎片^4,5，而抗炎型（CD68⁺CD206⁺）M2 巨噬细胞已被证明可促进周围神经系统中的轴突生长⁶。巨噬细胞向 PNS 的募集减少，或其吞噬能力受损，可能导致神经再生受阻及神经完整性维持障碍。表达 MHC class II 的促炎型 M1 巨噬细胞的吞噬能力弱于 M2 巨噬细胞，且神经炎症已被认为参与多种神经退行性疾病的发病机制⁷。

方案

野生型 C57BL/6 小鼠（雄性；10–12 周龄）饲养于标准的 12 小时光照/12 小时黑暗循环环境中，可自由摄取标准饲料和水。所有动物实验均按照当地动物护理和使用委员会的相关指南进行，并经德国卡尔斯鲁厄地区主管部门的动物护理和使用委员会批准（G216/10）。

1. 小鼠灌注

1. 使用 CO₂ 处死小鼠（C57BL/6；雄性；10–12 周龄）₂ 或根据当地法规。
   注意：可采用经EDTA包被的1.5 mL离心管通过眶后静脉丛采血获取对照组白细胞。该采血方法仅在动物处死后立即操作时有效。此外，可通过腹腔灌洗（PCL）获取对照组巨噬细胞，灌洗时应使用预热至37 °C的磷酸盐缓冲液（PBS），以避免血液发生冷凝集，从而影响灌注效果。
2. 用70%（v/v）乙醇充分喷洒小鼠腹部毛发进行消毒，并用带有棉纱布的纸巾反复擦拭。使用钝头剪刀沿纵轴切口剪开腹部皮肤。
3. 使用弯头钝头剪刀在膈肌上做一切口，随后沿整个肋骨全长延伸切口，以暴露胸膜腔。在对侧进行类似切口，直至可小心抬起胸骨。
4. 在清晰暴露心脏及主要血管后，将连接有50 mL冰浴PBS注射器的23¾号蝶形针插入心脏左心室。
5. 使用虹膜剪在心脏右心房做切口，尽可能扩大出口，但不得损伤降主动脉，然后轻轻按压注射器，推动约 30 mL PBS。流出液应变得澄清。肝脏和/或肾脏的澄清可作为灌注良....

结果

根据实验方案，从六只健康的 C57BL/6 小鼠的完整坐骨神经和所有主要背根神经节（DRG）制备细胞悬液，并将每份样品均分为三等份用于染色。使用可染色 DNA 的 DAPI 进行复染，可识别出单细胞群体（图 1A-B，上图）。在进行流式细胞术分析前洗去 DAPI，可在一定程度上降低无核碎片的荧光强度，从而有助于在单核事件或单细胞（singlets）的 FSC 轴上选择出明确的细胞群。由于周围神经系统（PNS）来源的单细胞在 FSC 和 SSC 轴上分布范围较广，因此不设置收集门控（图 1C）。在 FSC 轴高端的物质包含未完全消化的组织，在选择单细胞群体时必须将其排除（图 1A-B）。使用密度图（下图）展示结果有助于排除大块碎片（下图）。通常可从两条完整的坐骨神.......

讨论

坐骨神经含有大量脂质（如胆固醇），这是由于轴突周围存在髓鞘。由于脂质的性质会随温度变化，在不同温度下操作可能导致不同的结果。为了确保细胞的完整性，本实验方案中自消化步骤之后的所有操作均在冰上进行。尽管为了结果的可重复性建议保持操作条件的一致性，但将步骤 3.6 和 3.7 在室温下进行可能有助于提高细胞得率。在步骤 3.8 中，如果神经组织未充分消化，则在滤网上可见细小的神经组织碎片。若消化不充分，可将滤网上残留的组织转移至新的 1.5 mL 离心管中，加入 250 µL 消化液，重复步骤 3.2–3.6 进行再次消化。如果细胞得率较低，应在滤网过滤后（步骤 3.6）取细胞悬液样本，加入台盼蓝染液，于光学显微镜下观察。应可见未被染色的活细胞以及杆状结构（即轴突碎片）。若未见活细胞，说明消化条件不当或样品处理过程中操作失误导致了细胞坏死。若仅观察到大量细胞团块，则建议通过离心收集样品，并重复消化步骤（步骤 3.2–3.6）。

小鼠坐骨神经和背根神经节（DRG）的流式细胞仪分析方法适用于涉及整段神经及多个DRG的研究问题。近年来，利用流式细胞术分析周围神经系统（PNS）的兴趣日益增加<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6 小鼠	查尔斯河	C57BL/6NCrl
DMEM（含1g/L葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸）	赛默飞	31885023	该材料的来源不重要
HEPES	西格玛-奥德里奇	H3375
牛血清白蛋白（BSA）	西格玛-奥德里奇	A2153
IV型胶原酶	沃辛顿生化公司，美国	LS004188
脱氧核糖核酸酶（DNase）I，来源于牛胰腺 I	西格玛-奥德里奇	DN25-1g
乙二胺四乙酸（EDTA）	西格玛-奥德里奇	E6758
胎牛血清（FCS），热灭活	西格玛-奥德里奇	F4135
抗CD11b-PerCP/Cy5.5抗体	生物传奇	101228	克隆号 M1/70
抗MHC II类分子生物素标记抗体	生物传奇	107603	克隆号 M5/114.15.2
抗CD45-A647抗体	生物传奇	107603	克隆号 30-F11
抗CD68-APC抗体	生物传奇	137007	克隆号 FA/11
抗CD206-PE抗体	生物传奇	141706	克隆号 C068C2
抗F4/80-PE/Cy7抗体	生物传奇	123113	克隆号 BM8
链霉亲和素-PE/Cy7	生物传奇	405206	用于与CD45-A647和CD11b-PerCP/Cy5.5联合检测MHCII-生物素
链霉亲和素-PerCP	生物传奇	405213	用于与CD68-APC和F4/80-PE/Cy7联合检测MHCII-生物素
吐温-100	西格玛-奥德里奇	T8787
DAPI	西格玛-奥德里奇	D9542-1MG	用PBS稀释至50倍，避光保存于4 °C
细胞分离筛—组织研磨试剂盒	西格玛-奥德里奇	CD1
V型96孔板	格瑞纳/西格玛	M8185
5 ml 聚苯乙烯圆底管，12×75 mm	BD 生物科学	352008
60×15 mm 培养皿	格瑞纳/西格玛	Z643084
BD LSR II 流式细胞仪	BD 生物科学