本方案描述了一种在丘脑与大脑皮层的器官型共培养物中,同时成像丘脑-皮层轴突分支及突触形成的实验方法。通过使用DsRed和GFP标记的突触素进行单细胞电穿孔技术,可对单个丘脑-皮层轴突及其突触前终末进行可视化观察。
本方案描述了一种在丘脑与大脑皮层的器官型共培养物中,同时成像丘脑-皮层轴突分支及突触形成的实验方法。通过使用DsRed和GFP标记的突触素进行单细胞电穿孔技术,可对单个丘脑-皮层轴突及其突触前终末进行可视化观察。
轴突分支和突触形成是建立精确神经环路的关键过程。在发育过程中,感觉丘脑皮层(TC)轴突在大脑皮层的特定层内形成分支并建立突触。尽管轴突分支与突触形成之间存在明显的空间相关性,但二者之间的因果关系仍不清楚。为解决这一问题,我们近期开发了一种在器官型共培养体系中对单个TC轴突的分支和突触形成进行同步成像的方法。
本方案描述了一种结合了器官型共培养与电穿孔技术的方法。丘脑与大脑皮层的器官型共培养体系有助于基因操作及轴突过程的观察,同时保留了诸如层状结构等特征性组织构型。通过电穿孔技术,将两种分别编码DsRed和EGFP标记的突触素(SYP-EGFP)的独立质粒共转染至少量丘脑神经元中。该方法使我们能够同时可视化丘脑-皮层(TC)神经元的单个轴突形态及其突触前结构。此外,该方法支持长期观察,揭示了轴突分支与突触形成之间的因果关系。
哺乳动物大脑中的丘脑皮层(TC)投射是研究轴突导向和靶向机制的合适系统。在发育过程中,感觉性TC轴突在皮层板内生长,并优先在大脑皮层主要感觉区域的第四层形成分支和突触1,2。即使在基本连接建立之后,轴突树突和突触终末仍会根据环境变化发生重构3,4。然而,目前对TC轴突形态如何动态改变仍知之甚少。其中一个主要原因是缺乏能够在单细胞水平上观察结构变化的适当技术。尽管显微成像技术的最新进展(如双光子显微镜)已实现对活体皮层神经元的直接观察in vivo,但在捕捉完整TC轴突走行路径方面仍存在技术局限性5,6。因此,用于TC轴突活体成像的in vitro方法将为轴突分支和突触形成的结构分析提供有力工具。
我们课题组首次建立了一种基于多孔膜的静态脑片培养方法7。利用该方法,将大鼠皮层脑片与感觉丘脑组织块进行共培养,成功在器官型共培养体系中重现了层特异性的丘脑皮层(TC)连接7,8。通过荧光蛋白进行稀疏标记,可进一步观察丘脑皮层轴突的生长及分支形成过程9,10,11。近期,我们开发出一种新方法,可在器官型共培养体系中对单个丘脑皮层轴突的分支与突触形成进行同步成像12。为了同时可视化丘脑皮层轴突和突触前结构,通过电穿孔法将DsRed与EGFP标记的突触素(SYP-EGFP)共转染至少量丘脑神经元中。该方法有助于对丘脑皮层轴突进行形态学分析,并支持长期观察,可用于揭示轴突分支与突触形成之间的因果关系。
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所有实验均按照大阪大学动物福利委员会和日本神经科学学会制定的指南进行。
1. 丘脑与大脑皮层的器官型共培养
注意:详细步骤请参考原始文献7,8,13。所有操作均需在无菌条件下进行。神经元培养使用 Sprague-Dawley (SD) 大鼠。
2. 电穿孔
所有操作均应在无菌条件下进行。
注意:在制备丘脑组织块后一天进行电穿孔,以防止组织块脱落。
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本实验旨在揭示丘脑皮层(TC)轴突分支与突触形成之间的关系。为了同时观察轴突的走行路径和突触前部位的位置,采用电穿孔法将编码SYP-EGFP和DsRed的两种质粒转染至器官型共培养体系中的单个或少数几个丘脑细胞。在培养的第二周,可清晰地通过DsRed标记出可单独区分的TC轴突(图3)。仅选择同时表达DsRed和SYP-EGFP的轴突进行观察。标记的TC轴突侵入皮层切片,并主要在浅层形成分支,表明在器官型共培养体系中,丘脑轴突的分支具有类似于体内(in vivo)观察到的层特异性7,8,10,14,15,16
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目前的方案也是研究除丘脑皮层投射以外的生长轴突发育特征的有力工具11。例如,皮层脑片培养与电穿孔技术相结合,可实现对皮层神经元单个轴突形态的可视化以及长期观察9,18。
通过使用本实验方案,还可通过共表达荧光蛋白和目的基因,分析目的基因在轴突分支和突触形成中的作用。通常情况下,当质粒溶液的摩尔比调整为1:2时,超过90%表达荧光蛋白的细胞会同时转染第二个质粒18,19。然而,由于不同载体之间的共转染效率和表达水平存在差异,最佳摩尔比可能有所不同。
尽管当前方案对延时实验较为高效,但仍存在一些技术问题。在每日成像过程中,需要将共培养样品每天放置于显微镜载物台上。尽管每日成像似乎未对轴突发育造成明显影响10
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作者无任何利益冲突需要披露。
本研究由文部科学省创新领域基金(Mesoscopic Neurocircuitry 23115102)和“清除与构建系统对脑功能的动态调控”基金(16H06460)资助,项目负责人为N.Y. 我们还感谢Gabriel Hand对本文的审阅意见。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| 汉克斯平衡盐溶液(HBSS) | Nissui | 5905 | |
| 胎牛血清(FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| 胰岛素 | Sigma | I6634 | |
| 体酮 | Sigma | P8783 | |
| 化可的松 | Sigma | H0888 | |
| 亚硒酸钠 | Wako Pure Chemical Industries | 192-10843 | |
| 转铁蛋白 | Sigma | T1147 | |
| 腐胺 | Sigma | P5780 | |
| 葡萄糖 | Wako 纯化学工业 | 16806-25 | |
| 35 mm 培养皿 | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM 插入物 | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm 培养皿 | BIO-BIK | I-90-20 | 培养皿 sterrile |
| HiPure 质粒大提试剂盒 | Invitrogen | ||
| 一次性无菌塑料移液管 | 202-IS | 移液管 无菌 | |
| 玻璃毛细管:外径 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | 内径,1.2 毫米 |
| 银线:0.2 和 1 毫米 | Nilaco | AG-401265 (直径, 0.2 mm), AG-401485 (直径, 1.0 mm) | |
| 1 mL 注射器 | Terumo | SS-01T | |
| 刺激器 | A.M.P.I | Master 8 | |
| 双相隔离器 | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| 放大器 | A-M Systems | Model 1800 | |
| 示波器 | 日立 | VC-6723 | |
| 机械手 | Narishige | SM-15 | |
| 显微机械手 | Narishige | MO-10 | |
| 立体显微镜 | 奥林巴斯 | SZ40 | |
| 通用支架 | 奥林巴斯 | SZ-STU2 | |
| 照明系统 | 奥林巴斯 | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| 电极拉拔器 | Narishige | PC-10 | |
| 共聚焦显微镜 | 尼康 | 数码日食 C1 激光 | |
| x20 物镜 | 尼康 | ELWD 20x/0.45 | |
| 培养室 | Tokai Hit | 英国 A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) 大鼠 | 日本 SLC 和 Nihon-Dobutsu | ||
| 显微外科剪刀 | 夏目 | MB-54-1 |
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