丘脑皮层轴突分支与突触形成的器官型共培养可视化

摘要

本方案描述了一种在丘脑与大脑皮层的器官型共培养物中，同时成像丘脑-皮层轴突分支及突触形成的实验方法。通过使用DsRed和GFP标记的突触素进行单细胞电穿孔技术，可对单个丘脑-皮层轴突及其突触前终末进行可视化观察。

摘要

轴突分支和突触形成是建立精确神经环路的关键过程。在发育过程中，感觉丘脑皮层（TC）轴突在大脑皮层的特定层内形成分支并建立突触。尽管轴突分支与突触形成之间存在明显的空间相关性，但二者之间的因果关系仍不清楚。为解决这一问题，我们近期开发了一种在器官型共培养体系中对单个TC轴突的分支和突触形成进行同步成像的方法。

本方案描述了一种结合了器官型共培养与电穿孔技术的方法。丘脑与大脑皮层的器官型共培养体系有助于基因操作及轴突过程的观察，同时保留了诸如层状结构等特征性组织构型。通过电穿孔技术，将两种分别编码DsRed和EGFP标记的突触素（SYP-EGFP）的独立质粒共转染至少量丘脑神经元中。该方法使我们能够同时可视化丘脑-皮层（TC）神经元的单个轴突形态及其突触前结构。此外，该方法支持长期观察，揭示了轴突分支与突触形成之间的因果关系。

引言

哺乳动物大脑中的丘脑皮层（TC）投射是研究轴突导向和靶向机制的合适系统。在发育过程中，感觉性TC轴突在皮层板内生长，并优先在大脑皮层主要感觉区域的第四层形成分支和突触^1,2。即使在基本连接建立之后，轴突树突和突触终末仍会根据环境变化发生重构^3,4。然而，目前对TC轴突形态如何动态改变仍知之甚少。其中一个主要原因是缺乏能够在单细胞水平上观察结构变化的适当技术。尽管显微成像技术的最新进展（如双光子显微镜）已实现对活体皮层神经元的直接观察in vivo，但在捕捉完整TC轴突走行路径方面仍存在技术局限性^5,6。因此，用于TC轴突活体成像的in vitro方法将为轴突分支和突触形成的结构分析提供有力工具。

我们课题组首次建立了一种基于多孔膜的静态脑片培养方法⁷。利用该方法，将大鼠皮层脑片与感觉丘脑组织块进行共培养，成功在器官型共培养体系中重现了层特异性的丘脑皮层（TC）连接^7,8。通过荧光蛋白进行稀疏标记，可进一步观察丘脑皮层轴突的生长及分支形成过程^9,10,11。近期，我们开发出一种新方法，可在器官型共培养体系中对单个丘脑皮层轴突的分支与突触形成进行同步成像¹²。为了同时可视化丘脑皮层轴突和突触前结构，通过电穿孔法将DsRed与EGFP标记的突触素（SYP-EGFP）共转染至少量丘脑神经元中。该方法有助于对丘脑皮层轴突进行形态学分析，并支持长期观察，可用于揭示轴突分支与突触形成之间的因果关系。

方案

所有实验均按照大阪大学动物福利委员会和日本神经科学学会制定的指南进行。

1. 丘脑与大脑皮层的器官型共培养

注意：详细步骤请参考原始文献^7,8,13。所有操作均需在无菌条件下进行。神经元培养使用 Sprague-Dawley (SD) 大鼠。

1. 试剂的配制
   注意：以下试剂的体积适用于一只大鼠脑组织。
   1. 配制10倍改良N2添加剂¹³：胰岛素（50 μg/mL）、孕酮（200 nM）、氢化可的松（200 nM）、亚硒酸钠（300 nM）、转铁蛋白（1 mg/mL）、腐胺（1 mM）、葡萄糖（60 mg/mL）
   2. 配制含血清培养基（10 mL）：85% DMEM/F12，10% 10倍改良N2添加剂，5% 胎牛血清（FBS）
   3. 配制无血清培养基（20 mL）：90% DMEM/F12，10% 10倍改良N2添加剂
   4. 配制大鼠尾胶原溶液（0.5 mL）。简而言之，在无菌条件下取大鼠尾部柔软纤维，于乙酸溶液中过夜孵育。离心后收集上清液（浓度为几mg/mL），并置于冰箱中保存¹³。
2. 培养皿的准备
   1. 将膜插件放入35 mm的培养皿中。
   2. 向膜上加入40–50 μL大鼠尾胶原溶液，并将溶液均匀涂抹至膜中心区域。
   3. 在洁净台中将膜彻底风干。
   4. 向培养皿中加入1.5–2 mL含血清培养基，使膜完全浸没于培养基中。
   5. 在接种前，将培养皿置于培养箱中（37 °C，95% 湿润空气，5% CO₂）。
3. 皮层切片的制备
   1. 使用70%乙醇对所有手术器械灭菌10分钟或更长时间。
   2. 在冰上麻醉（将动物浸入冰屑中数分钟）条件下，快速取出出生后第2天（P2）大鼠的完整脑组织。
   3. 将脑组织放入盛有100 mL冷Hanks平衡盐溶液的100 mm培养皿中。
   4. 用精细镊子去除脑表面的软脑膜，并使用显微手术剪从视觉皮层和体感皮层切取300–400 μm厚的皮层切片（详见图1）。
      注意：皮层切片的厚度可通过双目显微镜下网格刻度进行粗略估计。
      注意：也可在无菌条件下使用振动切片机（vibratome）制备皮层切片。
   5. 使用一次性塑料移液管将数个皮层切片转移至膜插件上。
   6. 用火焰抛光的巴斯德移液管调整切片位置，使其靠近培养插件中心（详见^8,13），并去除插件中多余的培养基。
      注意：应将培养基液面调节至略低于切片表面，以确保切片同时获得充足的气体和营养供应。这对细胞存活至关重要。
   7. 将切片置于含血清培养基中，在37 °C、95% 湿润空气和5% CO₂环境中培养，单独培养一天后，再将丘脑组织块取出并放置于其旁侧。
4. 丘脑组织块的制备
   1. 使用70%乙醇对所有手术器械灭菌10分钟或更长时间。
   2. 通过腹腔注射戊巴比妥麻醉剂（50 mg/kg）对妊娠大鼠（胚胎第15天）进行麻醉。
   3. 从子宫角中分离出每个胚胎，并将其放入盛有100 mL冷Hanks平衡盐溶液的100 mm培养皿中。
   4. 在双目显微镜下，从每个胚胎中取出脑组织，并使用显微手术剪切取主要包含腹后复合体和外侧膝状体核的丘脑组织块（约0.5 mm × 3）⁷（见图1）。
5. 器官型共培养体系的培养与维持
   1. 使用巴斯德移液管将丘脑组织块放置于已置于膜插件上的皮层切片的室管膜面附近。
   2. 将共培养体系置于含血清培养基中，在37 °C、95% 湿润空气和5% CO₂环境中维持培养。
   3. 培养两天后，更换一半培养基为无血清培养基。此后每2–3天更换一次培养基。
      注意：换液后应检查培养基液面高度，因其对细胞存活至关重要。

2. 电穿孔

所有操作均应在无菌条件下进行。

注意：在制备丘脑组织块后一天进行电穿孔，以防止组织块脱落。

1. 质粒
   1. 按如下方式配制质粒混合液：pCAGGS-DsRed 2 μg/μL；pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL。
      注意：使用无内毒素大提试剂盒纯化两种质粒，并溶于Hanks平衡盐溶液中。
2. 电穿孔设备设置
   刺激器和隔离器等电学仪器的连接方式应如图2所示。
   1. 将刺激器连接至双相隔离器。
   2. 将电极（直径0.2 mm的银丝）连接至隔离器的负极端。
   3. 将另一电极（直径1 mm的银丝）与一个100 Ω电阻串联后，连接至隔离器的正极端。
   4. 将放大器连接至示波器，通过放大器测量电阻两端电压，以监测是否有电流通过电阻。
3. 玻璃移液管的制备
   注意：使用两种类型的玻璃移液管，分别用于注射质粒溶液和施加电脉冲。
   1. 使用电极拉制仪从玻璃毛细管拉制移液管。
   2. 折断注射用移液管的尖端（尖端直径应为20 - 50 μm）。
   3. 先用砂纸研磨并抛光电极移液管的尖端，再进行火焰抛光（内径应为50 - 200 μm）。
      注意：电极尖端应平整光滑，因其将直接接触组织。
4. 电穿孔操作步骤
   1. 将注射移液管和电极移液管连接至显微操作器。
   2. 将一根直径0.2 mm的银丝插入电极移液管中。
   3. 用塑料管将注射移液管连接至1 mL注射器。
   4. 通过注射器抽吸，将>5 μL质粒溶液吸入注射移液管中。
   5. 将共培养样品置于电穿孔台上，并将直径1 mm的电极插入培养液中。
   6. 将注射移液管置于丘脑外植体上方。
   7. 当移液管尖端接触丘脑组织表面后，手动推动注射器。
      注意：通常每个丘脑组织块使用约0.5 μL质粒溶液。
   8. 在撤出注射移液管后，立即放置电极移液管于丘脑组织块上。
   9. 施加电脉冲（50 - 400 μA，3至5组，每组200个持续时间为1 ms的方波脉冲，频率200 Hz）。在示波器上监测电流幅度和脉冲组数。
      注意：电脉冲电流的幅度取决于电极移液管的内径¹³。
   10. 撤出电极移液管，并将培养皿放回培养箱。
5. 显微观察
   1. 将培养皿置于配备两种滤光片组的直立共聚焦显微镜载物台上，分别用于EGFP（激发波长488 nm，发射波长515 nm）和DsRed（激发波长514 nm，发射波长565 nm）的成像。
   2. 使用20X 长工作距离物镜，以1 - 7 µm的步长采集10 - 25个光学切片图像。选择可单独分辨的、同时表达DsRed和SYP-EGFP的标记轴突。
      注意：观察区域约为0.7 x 0.7 mm（对应1024 x 1024像素，即0.68 μm/像素）。
   3. 每日成像时每隔24小时采集一次图像，每次操作在室温下于10分钟内完成，随后将培养物放回培养箱。对于短时间间隔的时间序列成像，需将培养物置于培养室中，维持37 °C、95%空气和5% CO₂的湿润环境。

结果

本实验旨在揭示丘脑皮层（TC）轴突分支与突触形成之间的关系。为了同时观察轴突的走行路径和突触前部位的位置，采用电穿孔法将编码SYP-EGFP和DsRed的两种质粒转染至器官型共培养体系中的单个或少数几个丘脑细胞。在培养的第二周，可清晰地通过DsRed标记出可单独区分的TC轴突（图3）。仅选择同时表达DsRed和SYP-EGFP的轴突进行观察。标记的TC轴突侵入皮层切片，并主要在浅层形成分支，表明在器官型共培养体系中，丘脑轴突的分支具有类似于体内（in vivo）观察到的层特异性^{7,8,10,14,15,16}

讨论

目前的方案也是研究除丘脑皮层投射以外的生长轴突发育特征的有力工具¹¹。例如，皮层脑片培养与电穿孔技术相结合，可实现对皮层神经元单个轴突形态的可视化以及长期观察^9,18。

通过使用本实验方案，还可通过共表达荧光蛋白和目的基因，分析目的基因在轴突分支和突触形成中的作用。通常情况下，当质粒溶液的摩尔比调整为1:2时，超过90%表达荧光蛋白的细胞会同时转染第二个质粒^18,19。然而，由于不同载体之间的共转染效率和表达水平存在差异，最佳摩尔比可能有所不同。

尽管当前方案对延时实验较为高效，但仍存在一些技术问题。在每日成像过程中，需要将共培养样品每天放置于显微镜载物台上。尽管每日成像似乎未对轴突发育造成明显影响¹⁰

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12	GIBCO	11320-033
汉克斯平衡盐溶液（HBSS）	Nissui	5905
胎牛血清（FBS）	Thermo Scientific	SH30396-03	Hyclone
胰岛素	Sigma	I6634
体酮	Sigma	P8783
化可的松	Sigma	H0888
亚硒酸钠	Wako Pure Chemical Industries	192-10843
转铁蛋白	Sigma	T1147
腐胺	Sigma	P5780
葡萄糖	Wako 纯化学工业	16806-25
35 mm 培养皿	Falcon	351008
Millicell-CM 插入物	Millipore	PICMORG50
100 mm 培养皿	BIO-BIK	I-90-20	培养皿 sterrile
HiPure 质粒大提试剂盒	Invitrogen
一次性无菌塑料移液管		202-IS	移液管 无菌
玻璃毛细管：外径 1.2 mm	Narishige	G-1.2	内径，1.2 毫米
银线：0.2 和 1 毫米	Nilaco	AG-401265 （直径， 0.2 mm）， AG-401485 （直径， 1.0 mm）
1 mL 注射器	Terumo	SS-01T
刺激器	A.M.P.I	Master 8
双相隔离器	BAK ELECTRONICS	BSI-2
放大器	A-M Systems	Model 1800
示波器	日立	VC-6723
机械手	Narishige	SM-15
显微机械手	Narishige	MO-10
立体显微镜	奥林巴斯	SZ40
通用支架	奥林巴斯	SZ-STU2
照明系统	奥林巴斯	LG-PS2， LG-DI， HLL301
电极拉拔器	Narishige	PC-10
共聚焦显微镜	尼康	数码日食 C1 激光
x20 物镜	尼康	ELWD 20x/0.45
培养室	Tokai Hit	英国 A16-U
Sprague-Dawley （SD） 大鼠	日本 SLC 和 Nihon-Dobutsu
显微外科剪刀	夏目	MB-54-1