在器官型共培养物中观察丘脑皮层轴突分支与突触形成

摘要

本方案描述了一种在丘脑与大脑皮层的器官型共培养物中，同时成像丘脑-皮层轴突分支及突触形成的实验方法。通过使用DsRed和GFP标记的突触素进行单细胞电穿孔技术，可对单个丘脑-皮层轴突及其突触前终末进行可视化观察。

摘要

轴突分支和突触形成对于建立精确的神经元环路至关重要。在发育过程中，感觉丘脑皮层（TC）轴突在大脑皮层的特定层内形成分支并建立突触。尽管轴突分支与突触形成之间存在明显的空间相关性，但二者之间的因果关系尚不明确。为了解决这一问题，我们近期开发了一种方法，可在组织器官共培养体系中对单个TC轴突的分支和突触形成过程进行同步成像。

本方案描述了一种结合了器官型共培养与电穿孔技术的方法。丘脑与大脑皮层的器官型共培养有助于基因操作及轴突过程的观察，同时保留了诸如层状结构等特征性组织架构。通过电穿孔技术，将两种分别编码DsRed和EGFP标记的突触素（SYP-EGFP）的独立质粒共转染至少量丘脑神经元中。该方法使我们能够同时可视化丘脑-皮层（TC）神经元的单个轴突形态及其突触前结构。此外，该方法支持长期观察，揭示了轴突分支与突触形成之间的因果关系。

引言

哺乳动物大脑中的丘脑皮层（TC）投射是研究轴突导向和靶向机制的合适系统。在发育过程中，感觉性TC轴突在皮层板内生长，并优先在大脑皮层主要感觉区域的第四层形成分支和突触^1,2。即使在基本连接建立之后，轴突树突和突触终末仍会根据环境变化发生重塑^3,4。然而，TC轴突形态如何动态改变仍不清楚。其中一个主要原因是缺乏能够在单细胞水平上观察结构变化的适当技术。尽管显微镜技术的最新进展（如双光子显微镜）已实现对活体皮层神经元的直接观察in vivo，但在捕捉完整TC轴突走行路径方面仍存在技术局限性^5,6。因此，用于TC轴突活体成像的in vitro方法将为轴突分支和突触形成的结构分析提供有力工具。

我们课题组首次建立了一种基于多孔膜的静态脑片培养方法⁷。利用该方法，将大鼠皮层脑片与感觉丘脑组织块进行共培养，成功在器官型共培养体系中重现了层特异性的丘脑皮层（TC）连接^7,

方案

所有实验均按照大阪大学动物福利委员会和日本神经科学学会制定的指南进行。

1. 丘脑与大脑皮层的器官型共培养

注意：详细步骤请参考原始文献^7,8,13。所有操作均应在无菌条件下进行。神经元培养使用Sprague-Dawley（SD）大鼠。

1. 试剂的配制
   注意：以下试剂的体积适用于一只大鼠脑组织。
   1. 配制10倍改良N2添加剂¹³：胰岛素（50 μg/mL）、孕酮（200 nM）、氢化可的松（200 nM）、亚硒酸钠（300 nM）、转铁蛋白（1 mg/mL）、腐胺（1 mM）、葡萄糖（60 mg/mL）
   2. 配制含血清培养基（10 mL）：85% DMEM/F12，10% 10倍改良N2添加剂，5% 胎牛血清（FBS）
   3. 配制无血清培养基（20 mL）：90% DMEM/F12，10% 10倍改良N2添加剂
   4. 配....

结果

本实验旨在揭示丘脑皮层（TC）轴突分支与突触形成之间的关系。为了同时观察轴突的走行轨迹和突触前部位的位置，在器官型共培养体系中，通过电穿孔技术将编码SYP-EGFP和DsRed的两种质粒转染至单个或少数几个丘脑细胞。在培养的第二周，可清晰地标记出彼此可区分的单条TC轴突，DsRed标记信号明确显示轴突形态（图3）。仅选择表现出 DsRed 和 SYP-EGFP 的轴突进行观察。标记的丘脑皮层（TC）轴突侵入皮层切片，并主要在上层形成分支，表明在器官型共培养中，丘脑轴突形成的分支具有类似于体内所见的层状特异性 体内^{7,8,10,14,15,}

讨论

目前的方案也是研究除丘脑皮层投射以外的生长轴突发育特征的有力工具¹¹。例如，皮层脑片培养与电穿孔技术相结合，可实现对皮层神经元单个轴突形态的可视化以及长期观察^9,18。

通过使用本实验方案，还可通过共表达荧光蛋白和目的基因，分析特定基因在轴突分支和突触形成中的作用。通常情况下，当质粒溶液的摩尔比调整为1:2时，超过90%表达荧光蛋白的细胞会同时转染第二个质粒^18,19。然而，由于不同载体之间的共转染效率和表达水平存在差异，最佳摩尔比可能有所不同。

尽管当前方案对延时实验较为高效，但仍存在一些技术问题。在每日成像过程中，共培养样品需每天放置于显微镜载物台上。尽管每日成像似乎未对轴突发育造成明显影响¹⁰，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12	GIBCO	11320-033
Hanks’ 平衡盐溶液（HBSS）	Nissui	5905
胎牛血清（FBS）	Thermo Scientific	SH30396-03	Hyclone
胰岛素	Sigma	I6634
孕酮	Sigma	P8783
氢化可的松	Sigma	H0888
亚硒酸钠	Wako Pure Chemical Industries	192-10843
转铁蛋白	Sigma	T1147
腐胺	Sigma	P5780
葡萄糖	Wako Pure Chemical Industries	16806-25
35 mm 培养皿	Falcon	351008
Millicell-CM 插件	Millipore	PICMORG50
100 mm 培养皿	BIO-BIK	I-90-20	无菌培养皿
HiPure 质粒大提试剂盒	Invitrogen	K210006
一次性无菌塑料移液管		202-IS	无菌转移移液管
玻璃毛细管：外径 1.2 mm	Narishige	G-1.2	内径 1.2 mm
银丝：0.2 mm 和 1 mm	Nilaco	AG-401265（直径 0.2 mm），AG-401485（直径 1.0 mm）
1 mL 注射器	Terumo	SS-01T
刺激器	A.M.P.I	Master 8
双相隔离器	BAK ELECTRONICS	BSI-2
放大器	A-M Systems	Model 1800
示波器	Hitachi	VC-6723
操纵器	Narishige	SM-15
显微操作器	Narishige	MO-10
体视显微镜	Olympus	SZ40
通用支架	Olympus	SZ-STU2
照明系统	Olympus	LG-PS2, LG-DI, HLL301
电极拉制仪	Narishige	PC-10
共聚焦显微镜	Nikon	Digital eclipse C1 激光
20倍物镜	Nikon	ELWD 20x/0.45
培养腔室	Tokai Hit	UK A16-U
Sprague-Dawley（SD）大鼠	Japan SLC 和 Nihon-Dobutsu
显微手术剪	Natsume	MB-54-1