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方法文章

主动脉-性腺-中肾区外植体培养系统在发育性造血中的应用

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DOI：

10.3791/56557

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2017年11月3日

 , 
1State Key Laboratory of Membrane Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences

本文内容

摘要

本方案描述了利用培养的主动脉-性腺-中肾组织进行表达分析、检测培养物和脾脏中的集落形成单位，以及长期重建造血，以确定调控因子和信号通路对造血干细胞发育的影响。该系统已被证明是研究造血干细胞生物学特性与功能的有效体系。

摘要

使用小鼠胚胎进行造血研究的局限性在于操作上的额外不便，这主要是由于胚胎在子宫内发育所致。尽管来自基因敲除（KO）小鼠的遗传数据具有说服力，但为所有需要的基因都构建基因敲除小鼠并不现实。此外，为了验证基因敲除小鼠所获得的数据而开展的体内挽救实验也存在操作不便的问题。为了克服这些局限性，研究人员开发了主动脉-性腺-中肾（AGM）组织块培养系统，作为研究造血干细胞（HSC）发育的合适模型。特别是对于挽救实验，该系统可用于恢复基因敲除小鼠中受损的造血功能。通过向培养基中添加适当的化学物质，可以重新激活受损的信号通路，或抑制异常上调的通路。利用该方法，可开展多种实验以鉴定HSC发育的关键调控因子，包括HSC相关基因在mRNA和蛋白质水平的表达、集落形成能力以及重建能力。这一系列实验将有助于阐明哺乳动物HSC发育所必需的潜在机制。

引言

造血干细胞（HSCs）是一类具有多向分化潜能的组织特异性成体干细胞，可分化为红系、髓系和淋巴系细胞，并具备自我更新能力。近期研究表明，最早的造血干细胞起源于一种特殊的内皮细胞群体，称为生血性内皮（HE），通过背主动脉腹壁的内皮-造血转化（EHT）过程产生1,2,3,4。在小鼠胚胎发育的E10.5至E12.5期间，HSCs在主动脉-性腺-中肾（AGM）区域形成后，会迁移至胎肝进行扩增，最终定植于骨髓，以维持个体整个 生命周期中的成体造血功能5,6。尽管该领域已研究多年，但HSCs的发生与发育机制仍未完全阐明。

与……不同 体外 受精和斑马鱼胚胎发育相比，小鼠胚胎的宫内发育使得在胚胎发生过程中对定型造血进行研究变得极为不便。尽管基因敲除（KO）小鼠常被用于遗传学实验，但某些基因敲除小鼠的缺乏也限制了其在造血研究领域的应用。此外 体内 在基因敲除小鼠中，挽救实验较难进行。自1996年以来，该领域的先驱者已开发出AGM组织块培养技术用于造血研究。7借助该培养系统，已发现AGM区域的腹侧组织可促进造血干细胞活性，而背侧组织则发挥相反作用8,9AGM 外植体培养系统还被用于确定血清素、Mpl、SCF、BMP 和 Hedgehog 信号通路在造血干细胞发育中的作用10,11,12,13,14重要的是，该方法也常用于挽救突变胚胎中的造血缺陷。13,15.

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方案

所有涉及动物受试者的操作程序均已获得中国北京中国科学院动物研究所伦理审查委员会的批准。

1. 材料准备

  1. 在超净工作台内，使用紫外灯产生的紫外线对0.65 µm滤膜进行4小时灭菌处理，并在2小时后翻转滤膜。
    注意：使用紫外光时，请穿戴适当的防护装备。
  2. 将不锈钢网置于高压蒸汽灭菌器中，在121 °C下灭菌30分钟。
    注意：需要一定高度的不锈钢网以在气液界面支撑滤膜，可通过钢网上的金属丝实现（图1A）。
  3. 将氟西汀稀释至M5300长期培养基中的终浓度为10 µM，并混匀。
    注意：对于六孔板，每孔加入2 mL M5300长期培养基较为合适。可选择性地将氢化可的松稀释至培养基中，终浓度为10-6 M。
  4. 将含10 µM氟西汀的培养基加入六孔板或培养皿中，并将已灭菌的不锈钢网放入培养基内。
  5. 在玻璃细胞培养皿中，用沸水清洗0.65 µm滤膜两次，每次3分钟，以实现灭菌。每次清洗后，将滤膜置于磷酸盐缓冲液（PBS）中2分钟，然后将湿润的滤膜放置于竖立在气液界面的不锈钢网上，如图1A所示（中间为示意图）。
    注意：可通过高压蒸汽灭菌器产生沸水以实现无菌操作，且应及时取出设备，避免温度下降。

2. AGM 外植体培养

  1. 在 E10.5 或 E11 时期，使用镊子小心地将胚胎的 AGM 区域分离出来。
    1. 用解剖剪从怀孕小鼠体内剥离子宫，并将胚胎从子宫中分离。
    2. 擦去卵黄囊、脐带以及胚胎体上的内脏组织。
    3. 小心去除背部神经组织及周围肌肉组织。
    4. 用镊子在前肢和后肢位置剪除组织，将 AGM 区域从胚胎体上分离。图 1B-C 展示了分离后 AGM 的示意图及其形态。
  2. 将分离的 AGM 分别接种于滤膜上，在气液界面进行外植培养（图 1A），在 37 °C、5% CO2 条件下培养 2–3 天。
    注意：不要将分离的 AGM 放置在金属网的金属丝上，确保培养过程中滤膜始终处于气液界面。除 AGM 外，卵黄囊和胎肝也可利用该系统进行培养7。

3. 表达分析

  1. mRNA 水平
    1. 将培养的 AGM 收集到 1 mL PBS 中，在 4 °C、310 × g 条件下离心 6 分钟。
    2. 去除上清液后，根据制造商说明书，使用酚单相溶液从收集的 AGM 中提取总 RNA。
    3. 取 2 µg 总 RNA，使用 M-MLV 逆转录酶进行逆转录，获得 cDNA 作为模板。采用 SYBR Green 进行定量实时 PCR 检测，以 Gapdh 作为内参对照。
  2. 蛋白水平
    1. 按照上述步骤 3.1.1 所述方法收集培养的 AGM。
    2. 使用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl、10 mM NaCl 和 0.5% NP-40）从培养的 AGM 中提取蛋白，并用于 Western 印迹检测蛋白水平，方法如前所述13。

4. 培养物中的菌落形成单位（CFU-C）检测

  1. 培养 2 - 3 天后，将 AGM 区收集至 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，在 4 °C、310 × g 条件下离心 6 分钟，并在 37 °C 下用 200 µL 胶原酶（0.1% 溶于 PBS）进行解离。
    注意：胶原酶消化生成单细胞悬液所需时间约为 20 分钟。每隔 5 分钟轻轻振荡含有 AGM 的离心管可加速消化过程。每个 AGM 使用 200 µL 0.1% 胶原酶，反应终止时加入 200 µL 10% 血清。
  2. 将单细胞悬液接种于 M3434 培养基中，置于超低吸附 24 孔板中进行培养。
    注意：为避免污染，可选择性地在培养基中添加青霉素-链霉素溶液。由于 M3434 培养基具有较高黏度，应使用无针头的 1.0 cc 注射器混匀细胞与培养基。
  3. 在 37 °C、5% CO2 条件下培养 7 - 10 天后，根据集落形态，利用倒置显微镜区分并计数各类集落，包括红系爆式集落形成单位（BFU-E）、粒单系集落形成单位（CFU-GM）以及粒细胞、红细胞、巨噬细胞、巨核细胞集落形成单位（CFU-GEMM）（图 2C）。

5. 体内 移植实验

  1. 脾集落形成单位（CFU-S）实验
    1. 在胚体外植培养 2 - 3 天后，收集 AGM 组织，并通过加入 200 µL 胶原酶（0.1% PBS 溶液）孵育 20 分钟，制备单细胞悬液。
    2. 在细胞注射前 4 - 5 小时，对 8 至 10 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠进行致死剂量照射（9 Gy X 射线）。
    3. 将照射后的小鼠放入固定器中以限制其活动。
    4. 用浸有 75% 酒精的棉签擦拭小鼠尾部，以促进静脉血管扩张。
    5. 使用 1.0 cc 注射器，将 0.5 胚胎当量（ee）或 1 ee 的 AGM 单细胞悬液经尾静脉静脉注射至受体小鼠体内。
      注：细胞用 PBS 悬浮，每只受体小鼠注射 0.5 mL PBS 为适宜体积。使用 25 或 26 号针头配合 1.0 cc 注射器进行注射。注射器中不得引入空气。注射后用消毒棉签按压注射部位以止血。
    6. 移植后第 11 天，取出受体小鼠的脾脏，用 Bouin 氏液（15 mL 1.22% 饱和苦味酸水溶液、2 mL 40% 甲醇和 1 mL 冰醋酸）固定 1 - 2 天，再用 80% 酒精洗涤 1 - 2 天。肉眼计数脾脏中可见的集落，并计算每胚胎当量（ee）的集落数量。
      ​注：使用 Bouin 固定液时需佩戴适当的防护装备。
  2. 长期移植实验
    1. 在胚体外植培养 2 - 3 天后，收集 AGM 组织，并通过加入 200 µL 胶原酶（0.1% PBS 溶液）孵育 20 分钟，制备单细胞悬液。
    2. 在细胞注射前 4 - 5 小时，对 8 至 10 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠进行致死剂量照射（9 Gy X 射线）。
    3. 将照射后的小鼠放入固定器中以限制其活动。
    4. 用浸有 75% 酒精的棉签擦拭小鼠尾部，以促进静脉血管扩张。
    5. 使用 1.0 cc 注射器，将 0.5 胚胎当量（ee）或 1 ee 的 AGM 单细胞悬液经尾静脉静脉注射至受体小鼠体内。AGM 以每只受体 1 ee 的剂量注射，同时联合注射 2×105 个骨髓细胞（CD45.1 背景）。
      注：注射器中不得引入空气。注射后用消毒棉签按压注射部位以止血。
    6. 移植后 4 个月，收集受体小鼠的骨髓样本，并通过流式细胞术（FACS）进行重建能力检测。仅将供体来源嵌合率 ≥10% 的受体视为成功重建。

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结果

最近一项研究报道，血管内皮细胞来源的5-羟色胺通过抑制AGM中促凋亡通路促进造血干细胞的存活13为验证血清素对造血干细胞发育的促进作用，实验中加入了氟西汀。作为一种选择性血清素再摄取抑制剂（SSRI），氟西汀已被证实可抑制外周组织中血清素的再吸收16,17,18采用AGM组织块培养系统，按照上述流程检测了氟西汀对造血干细胞（HSC）发育的影响。表达分析结果显示，Runx1的表达水平升高，该基因被定义为HSC发育的关键基因。19，分别在氟西汀处理的AGMs中mRNA和蛋白质水平上（图2A 和 2B）。氟西汀还可显著增强AGM中造血干细胞的集落形成能力，包括BFU-E、C...

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讨论

众所周知，骨髓中的成熟造血干细胞（HSC）能够重建经辐照受体的血液系统。与这些具有功能的HSC不同，小鼠胚胎AGM区域中出现的HSC尚处于未成熟状态。直接移植实验结果表明，I型（VE-cad+CD45-CD41+）和II型（VE-cad+CD45+）前体HSC均不具备重建能力20。利用AGM组织块培养系统，AGM区域新生的HSC可在移植实验中重建受体的造血系统4,20。此外，由于小鼠胚胎在子宫内发育，针对基因敲除（KO）小鼠体内造血功能缺陷进行挽救的in vivo实验操作不便。AGM组织块培养系统则是一种理想的替代方法，只需将化学物质（生长因子和细胞因子）加入培养基中，即可方便地开展挽救实验13,15。除AGM外，卵黄囊和胎肝也可采...

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披露

作者无利益冲突的财务关系。

致谢

感谢高素伟在图示制备中的帮助。本工作得到中国国家自然科学基金（81530004，31425016）和中国科学技术部（2016YFA0100500）项目的资助。J.L. 进行了实验并起草了稿件；F.L. 对稿件进行了修改。两位作者均阅读并批准了最终稿件。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
durapore 0.65 µm 滤膜MilliporeR5BA63787AGM 外植体培养
M5300 长期培养基Stem Cell Technologies5300AGM 外植体培养
Trizol Tiangen5829RNA 提取
M-MLV 逆转录酶Promega90694逆转录
SYBR GreenQiagenA6002定量实时 PCR
蛋白酶抑制剂Roche55622蛋白质提取
胶原酶SigmaC2674AGM 组织消化
MethoCult GF M3434 培养基Stem Cell Technologies3434CFU-C 检测
超低吸附 24 孔板Costar3473CFU-C 检测
C57BL/6 CD45.2 小鼠北京华阜康生物科技股份有限公司CFU-S 检测
C57BL/6 CD45.1 小鼠北京华阜康生物科技股份有限公司长期移植实验
磷酸盐缓冲液Life Technologines8115284AGM 组织采集
青霉素-链霉素溶液HyCloneSV30010AGM 外植体培养
抗 CD45.2-PE-CY7 抗体eBioscience25-0454-80长期移植实验
抗 CD45-FITC 抗体eBioscience11-0451-81长期移植实验
紫外灯北京江morning yuan生物科技有限公司039-14402功率：30W
不锈钢筛网AS ONE 上海有限公司2-9817-10 孔径直径：2.5 mm
氢化可的松SigmaH0396选择性稀释至 M5300 培养基中

参考文献

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