在本方案中，我们展示了连续切片电子断层扫描技术在阐明果蝇（Drosophila）间接飞行肌线粒体结构中的应用。
本文内容
摘要
摘要
线粒体是细胞的能量工厂，能够产生ATP、脂质和代谢物，同时还调节钙稳态和细胞死亡。该细胞器具有富含嵴的双层膜超微结构，通过区室化生物分子来精巧地执行多种功能。线粒体的超微结构与其各种功能密切相关；然而，这些结构与功能关系的精细细节才刚刚开始被阐明。本文展示了连续切片电子断层扫描技术在解析果蝇（Drosophila）间接飞行肌中线粒体结构中的应用。连续切片电子断层扫描技术可适用于以三维形式研究任何细胞结构。
引言
电子显微镜是研究执行细胞过程的亚细胞结构和细胞器的结构背景的重要工具。目前已开发出多种方法，可通过醛类化学固定或高压冷冻（HPF）结合冷冻置换（FS）来保存组织或细胞的超微结构1,2。包埋后的样品块可进行切片、染色，并用透射电子显微镜（TEM）观察。高压冷冻样品也可在低温条件下处理，例如通过低温切片或聚焦离子束（FIB）铣削，并在冷冻电镜（cryo-EM）下观察3,4。
尽管薄切片电镜可提供有启发性的形态学信息，但所获得的二维图像仅能揭示特定横截面的超微结构。超微结构在三维空间中的组织方式仍然不明确。为了实现细胞超微结构的三维可视化，已开发出电子断层成像方法，通过采集一系列倾斜图像并进行反投影，从而生成断层重建图像5（图1）。通过将样品旋转90°并采集第二组倾斜图像，可获得双轴倾斜系列。该方法可最大限度减少因采样角度受限而产生的缺失楔形伪影，并提高断层图像的分辨率。
此处，我们描述了连续切片电子断层扫描技术在研究线粒体超微结构中的应用 果蝇 间接飞行肌（IFM）6,7,8,9为了获得覆盖整个线粒体（约2.5 µm厚）的三维重建，需从连续切片中获取数据 果蝇 IFM 组织块。使用自动数据采集软件分别收集每张切片的断层图像。利用 IMOD 软件包生成断层重建图像，并将连续断层图像拼接，以获得完整线粒体的重建体积。通过 3D 软件分析拼接后的断层图像，对线粒体嵴的密度进行分割，构建分割模型，从而揭示其三维结构组织。
方案
1. 使用振动切片机切片 Drosophila 组织
- 麻醉 果蝇 置于冰上，将每只果蝇分别浸入1 mL含4%低熔点琼脂糖的磷酸盐缓冲液中。在冰上静置，使琼脂糖凝固。通常，4 - 6 果蝇被处理。
- 使用振动刀片切片机对琼脂糖凝胶包埋样品进行切片 果蝇 切成100 µm厚的切片，并浸入含有2.5%戊二醛的0.1 M磷酸盐缓冲液固定液中。
注意：建议使用振动切片机进行切片，因为与其他方法相比，该方法能更好地保持组织结构的完整性。 alternatively，也可使用解剖镊将 IFM 剪碎并放入含有 2.5% 戊二醛的 0.1 M 磷酸盐缓冲液固定液中。
2. 采用高压冷冻与冷冻置换（HPF/FS）方法制备透射电镜样品
- 用3滴（约150 µL）磷酸盐缓冲液清洗组织切片，随后用含20% BSA的2滴（约100 µL）磷酸盐缓冲液清洗。然后将切片置于装有缓冲液和20% BSA的金载体中用于高压冷冻（HPF）。
- 根据用户手册，将含有载体的样品装入高压冷冻仪中。
- 冷冻完成后，在液氮中将载体从样品架上取出，并转移至预冷至-140 °C的冷冻置换装置中。
- 按照表1所示程序进行冷冻置换，置换液（FS cocktail）组成为：2%戊二醛、2%四氧化锇和0.1%醋酸铀在丙酮中的混合液。
- 用针小心地将样品从载体中取出，并在室温下包埋于树脂中。在65 °C下聚合树脂16小时。
注意：应根据样品类型调整冷冻置换方案。高压冷冻/冷冻置换（HPF/FS）更适用于保持超微结构并最大限度减少细胞内容物的丢失。- 也可采用化学固定法。将样品用2.5%戊二醛固定过夜，用缓冲液洗涤后，再用1%四氧化锇固定2小时。洗涤后，用浓度递增的乙醇进行脱水，随后用Spurr树脂渗透并包埋样品，最后在65 °C下聚合16小时。
3. 为电子断层扫描制备样品的连续切片
- 修整样品块，暴露含有组织的目标切面。
- 用1% BSA预处理金颗粒（直径10 nm）30分钟。洗涤后将金颗粒悬浮于PBS缓冲液中，并将其覆盖到涂有碳膜的铜载网凹槽上，以形成定位标记物。
- 在透射电子显微镜下检查，确保断层扫描成像视野中具有足够数量的定位标记物（至少5–10个标记物）。
- 使用超薄切片机切割厚度为200–250 nm的连续超薄切片。
- 使用完美环（perfect loop）将连续切片收集到载网凹槽上。
- 用Reynold's柠檬酸铅染色10分钟。
- 在切片表面覆盖第二层定位金颗粒。
4. 收集双倾电子断层扫描数据
- 将载网装载到双轴断层扫描样品台，并插入在200 kV下运行的透射电子显微镜中。
- 将显微镜调整至正焦中心位置。
- 设置自动数据采集软件。在多尺度成像模式下调节并校准电子束。操作细节请参考用户手册10（图2）。
- 在无碳膜的空白区域，使用断层扫描采集条件获取相机的暗场和亮场参考图像。
- 在低倍率下采集载网图谱。在连续切片上选择线粒体作为断层扫描采集的目标区域。
- 对每个目标区域，在轴A上以2°为增量，从-60°到+60°采集倾转系列图像。
注意：倾转角度会受到样品台设计的机械限制。在高倾转角度下，样品台会遮挡电子束。 - 为采集第二个倾转系列，将样品台旋转90°。重新采集一张图谱，选择对应位置，并对每个目标区域在轴B上采集倾转系列图像。
注意：其他软件包（如SerialEM和Xplore3D）也可用于自动数据采集。
5. 使用软件重建三维断层图像并分割子区域
- 使用 IMOD 软件重建双轴倾斜图像的断层图11。
- 操作细节请参考用户手册。
- 根据金标 fiducial 标记的位置对各个倾斜序列进行对齐。分别采用反投影法或同步迭代重建技术（SIRT）方法，对轴-A 和轴-B 数据重建断层图（图 3）。
- 将轴-A 和轴-B 的断层图合并，生成缺失楔形伪影减少的双倾斜断层图。
- 将连续切片的双倾斜断层图拼接，获得覆盖整个线粒体体积的重建图像，并使用 IMOD 程序对连续切片间的间隙进行建模。
- 裁剪拼接后的断层图，并重采样至所需尺寸，用于体积分割。
- 使用 3D 软件分析拼接后的连续断层图。
- 操作细节请参考用户手册。
- 使用高斯滤波器（或其他所需方法）对断层图进行滤波，以增强结构对比度并降低背景密度。
- 手动或自动分割线粒体的超微结构。
- 显示分割模型，以便在三维空间中进行观察。
- 利用 3D 软件中的工具生成动态影像。
结果
我们采用连续切片电子断层扫描技术，分析了线粒体嵴的结构特征，这些特征反映了其能量状态及衰老过程。我们发现，果蝇（Drosophila）间接飞行肌（IFM）的线粒体在三维结构中形成了相互连接的嵴和基质网络（图4）7。此外，具有线粒体DNA复制缺陷并表现出加速衰老表型的突变果蝇，其体内积累了含有类似洋葱状螺旋核心亚结构的线粒体（图5）7。
图1：从倾斜系列图像进行电子断层重建的示意图。 在实验中，当三维样品被倾斜至不同角度时，电子束穿过该三维样品。在每个倾斜条件下，由相机采集生成的二维投影图像。随后根据中心切片定理，将这些二维投影进行反投影，以重建出三维样品结构。在本图示中，展示了对一幅原始二维图像在不同倾斜角度下投影至一维空间的相同过程，随后利用这些一维投影重建出原始二维图像。请点击此处查看该图的高清版本。
图 2：自动数据采集。 软件图像查看界面，显示含有连续切片的载网方格图谱、线粒体的多尺度定位以及采集的倾斜图像。比例尺 = 500 µm（左上图）、100 µm（左下图）、1 µm（右图）。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：单个线粒体的连续切片电子断层扫描 果蝇 间接飞行肌 (A2D 显微图像和（B) 覆盖线粒体完整体积的连续切片三维断层扫描图像。C) 将连续切片的断层图像拼接后投影，生成纵向切面，其中 z 轴垂直显示。值得注意的是，组织切片导致部分材料丢失，使拼接后的断层图像之间出现间隙。比例尺 = 500 nm。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4：三维显示线粒体内膜嵴与基质网络的整合结构。 (A) 线粒体电子断层重建切片，显示沿 z 轴方向片层膜之间的转换。B) 观察到的右旋和/或左旋螺旋嵴结构转换模式示意图。C三维断层分割显示左手螺旋结构（D) 对嵴的转换模式进行分析，并在分割模型上进行彩色渲染（E，F）。断层扫描切片显示嵴膜（白色密度区域）上侧向基质连续性（深色密度区域，标为红色）。G) ( 中的断层图像分割模型E）显示侧向基质融合（红色）和典型的嵴结构（灰色）。比例尺 = 50 nm（A）、200 nm（C）、300 nm（D、E、F、G）。该图系转载自 Jiang 等7 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 5：在线粒体DNA复制缺陷的果蝇衰老过程中，出现类似洋葱状螺旋核心的线粒体聚集。 典型的断层扫描切片及其相应的分割结果（右侧面板），分别显示螺旋核心的横截面视图（上）和纵截面视图（下）。体积分割采用任意颜色渲染以突出螺旋核心结构。比例尺：200 nm。该图引自Jiang et al.7 请点击此处查看该图的高清版本。
| 步骤 | 温度 | 时间 | 溶液 | |||
| 1 | -140 °C 至 -90 °C | 30 分钟 | 液氮 | |||
| 2 | -90 °C | 96 小时 | FS 混合液 | |||
| 3 | -90 °C 至 -60 °C | 6 小时（5 °C/小时） | FS 混合液 | |||
| 4 | -60 °C | 12 小时 | FS 混合液 | |||
| 5 | -60 °C 至 -25 °C | 7 小时（5 °C/小时） | FS 混合液 | |||
| 6 | -25 °C | 12 小时 | FS 混合液 | |||
| 7 | -25 °C 至 0 °C | 5 小时（5 °C/小时） | FS 混合液 | |||
| 8 | 0 °C | 1 小时 × 3 次 | 丙酮 | |||
| 9 | 室温 | 树脂渗透 | ||||
表1：冷冻置换方案。
讨论
在本实验方案中，我们描述了一种优化的连续切片电子断层扫描工作流程，用于研究果蝇（Drosophila）间接飞行肌中线粒体的三维超微结构。此类分析面临的主要技术挑战在于样品中超微结构的保存。为最大限度地保持超微结构的完整性，本研究采用了两个关键的方法学步骤。首先，使用振动切片机对组织进行切片取样，以尽可能维持组织架构的原始状态。其次，优化了高压冷冻/冷冻替代（HPF/FS）流程，以在包埋样品块制备过程中有效保存细胞器的超微结构。样品在高压下快速冷冻，该过程可降低水的冰点并减少破坏超微结构的冰晶形成1。厚度达0.1 mm的样品亦可实现瞬间玻璃化冷冻，随后通过冷冻替代处理制备用于电镜分析的样品块。与传统的化学固定方法相比，HPF/FS技术显著提升了超微结构的保存质量。采用这一系列样品制备步骤后，线粒体双层膜结构及嵴膜结构的保存状况得到显著改善。
获取样品的连续切片是该方法中最困难的步骤。由于电子束的穿透能力有限，使用200 kV或300 kV运行的透射电子显微镜（TEM）时，切片厚度分别被限制在250 nm或500 nm。由于线粒体的厚度可能超过2 µm，因此需要连续切片才能实现完整的体积重建。然而，收集足够数量的连续切片以覆盖整个细胞器仍是一项技术挑战。在梯形底部之间将块面修整得尽可能平整，可使槽形载网容纳更多的切片，从而覆盖更大的体积。此外，使用完美的环状工具进行超薄切片可提高将连续切片转移至载网的成功率。
连续切片电子断层扫描可使用标准的电镜核心设备完成。然而，该方法存在一些因技术限制而不可避免的局限性。其一是连续切片之间不可避免地会丢失材料，导致拼接重建中出现间隙。其二是缺失楔形伪影，这是由于可实现的倾斜角度有限所致。该限制的产生是因为样品台无法进行完整旋转，否则会遮挡电子束。尽管存在这些局限性，连续切片电子断层扫描仍能提供足够的分辨率，以三维形式揭示细胞及细胞器的超微结构。
对于小规模成像，冷冻电子断层扫描是一种新兴技术，可用于获取大分子复合物和组装体的结构 原位 在亚纳米或亚埃级分辨率下结合亚断层扫描重构3在此应用中，样品通过切片或在液氮环境下使用聚焦离子束铣削来减薄细胞。断层图像在冷冻条件下采集，分子结构得以接近天然状态保存，无需化学固定、脱水或包埋。在另一尺度上，尽管需要专用仪器，连续块面扫描电镜仍是一种颇具吸引力的方法，可用于分析大体积组织，但以牺牲分辨率为代价。4.
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
研究在位于中国台湾台北的中央研究院细胞与个体生物学研究所的电镜核心实验室以及中央研究院的冷冻电镜核心实验室完成。本工作由中央研究院和科技部提供资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 振动切片机 | Leica | VT1200S | 组织切片 |
| 高压冷冻仪 | Leica | EM HPM100 | 样品制备 |
| 冷冻置换仪 | Leica | EM AFS2 | 样品制备 |
| 超薄切片机 | Leica | EM UC7 | 超薄切片 |
| 双轴断层扫描样品台 | Fischione | Model 2040 | 断层扫描数据采集 |
| 透射电子显微镜 | FEI | Tecnai F20 | 断层扫描数据采集 |
| CCD相机 | Gatan | UltraScan 1000 | 断层扫描数据采集 |
| Leginon | NRAMM/AMI | 断层扫描数据采集 | |
| IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | 断层重建 | |
| Avizo 3D | FEI | 断层扫描分析 |
参考文献
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