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向上迁移：一种简单灵活的体外三维侵袭实验方案

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DOI：

10.3791/56568

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2018年3月12日

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1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota - Twin Cities, 2Stem Cell Institute, University of Minnesota - Twin Cities, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota - Twin Cities, 4Lillehei Heart Institute, University of Minnesota - Twin Cities, 5Institute for Engineering in Medicine, University of Minnesota - Twin Cities, 6Department of Biology, Jackson State University

本文内容

摘要

本方案描述了一种倒置垂直侵袭实验方法，可用于在三维环境中定量评估细胞的迁移和侵袭能力，同时保持细胞微环境的完整性。该实验适用于稀有和/或敏感细胞。

摘要

尽管已经开发出三维侵袭实验方法，但研究细胞的同时保持其微环境完整性的挑战仍然存在。传统的三维侵袭实验（如Boyden小室法）要求将细胞从原始培养位置转移至新的环境。这不仅会破坏细胞与其微环境之间固有的细胞过程，还常常导致细胞丢失。当处理稀有细胞或对微环境极为敏感的细胞时，这些问题尤为突出。本文中，我们描述了一种新型三维侵袭实验方法的建立，可有效避免上述两个问题。在该实验中，细胞被接种于一个小孔内，随后在细胞上方覆盖含有趋化因子的细胞外基质（ECM）凝胶。该方法无需细胞转移，允许细胞向上侵入基质中。在此体系中，可对细胞在胶原凝胶内的侵袭行为及细胞形态进行评估。利用该实验方法，我们表征了稀有且敏感细胞的侵袭能力，即乳腺癌细胞MCF7与间充质/多能干细胞/基质细胞（MSCs）融合后形成的杂交细胞。

引言

细胞运动是细胞正常的发育和生理过程。然而，细胞迁移和侵袭的模式及能力发生改变，与炎症性疾病和癌症转移等病理状态相关。1,2,3转移无疑是癌症研究中最不为人所理解的方面。为了发生转移，癌细胞必须降解细胞外基质（ECM），侵入局部组织并进入血管。一旦进入循环系统，癌细胞将播散至远端部位，穿出血管并形成继发性肿瘤。因此，细胞降解ECM、迁移和侵袭的能力与其转移潜能密切相关。目前已开发出多种方法用于分析和量化细胞的迁移与侵袭能力，其中最常用的方法包括划痕愈合实验、延时显微成像以及Boyden小室实验。划痕愈合实验4 以及延时显微镜是简单且便捷的检测方法，可初步揭示细胞迁移情况。然而，这两种方法均为二维检测，无法反映细胞所处的三维环境 体内研究表明，细胞在三维环境中的反应与在二维环境中的反应不同。5,6此外，伤口愈合实验难以重复，且难以获得定量结果7,8,9细胞排阻区实验是一种伤口愈合实验的三维改良方法，具有更高的生理相关性，但不适用于数量较少的细胞，例如细胞融合事件产生的杂交细胞。10,11.

Boyden小室实验是一种三维实验方法，可为细胞研究提供相关的微环境。然而，该方法需要将细胞从其原始微环境中分离，并接种到Boyden实验系统的上层小室中，使其向含有趋化因子的培养基方向向下迁移和侵袭。这种三维方法不适用于分析那些对其微环境敏感和/或数量有限的细胞的迁移与侵袭能力10,11,12。一种较新的用于分析细胞迁移和侵袭的方法是微流控梯度小室实验13。尽管该方法在迁移和侵袭研究中适用且可靠，但成本较高，对一般实验室而言技术难度较大。本文介绍一种简便的倒置垂直侵袭实验方法，适用于多种细胞类型，包括对微环境敏感和/或数量受限的细胞。该实验方法改编自Hooper et al.14 提出的实验方案。在此实验中，细胞保持在其原始微环境中，其迁移和侵袭行为通过观察其在含有趋化因子的胶原凝胶中向上移动的过程进行监测11。该实验具有良好的可重复性，并已在35 mm培养皿中完成优化和验证。该方法可适应不同的实验条件，包括不同规格的细胞培养容器、不同的基质或黏附强度，以及不同的趋化因子。该实验可作为药物发现过程中初步筛选的体外研究平台。

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方案

注意：本方案已在 McArdle et al.11 中描述。图1 提供了时间线。

1. 培养板的准备

  1. 用 1 mL 1 M 盐酸（HCl）清洗含有 10 mm 玻璃底小室的 35 mm 培养皿，持续 15 分钟，以降低玻璃底面的疏水性。
  2. 用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养皿两次，以彻底去除残留的 HCl。
  3. 用 1 mL 70% 乙醇清洗培养皿两次。
  4. 用 1 mL 细胞专用培养基（此处使用含 10% 热灭活胎牛血清和 1% 非必需氨基酸的 α-MEM）冲洗培养皿。
    注意： 处理后的含培养基培养皿可置于 37 °C、带加湿器的 CO2 培养箱中保存至次日。
  5. 将细胞（MSCs 与 MCF-7 共培养）在处理过的 35 mm 培养皿的玻璃底小室内培养至 100% 汇合度。共培养 35,000 个 MSC 细胞和 75,000 个 MCF-7 细胞，持续 24 小时。

2. 胶原凝胶的制备

  1. 将用于移取胶原蛋白凝胶的微量移液器吸头保存在冰箱中，以防止胶原蛋白在接触时发生聚合。
    注意：这是最关键的一步。
  2. 根据胶原蛋白储备液的浓度确定所需大鼠尾部胶原蛋白I的体积。本实验准备100 µL胶原蛋白凝胶。
    注意：高浓度的大鼠尾部胶原蛋白I储备液效果更佳。根据胶原蛋白稀释比例确定所需10倍浓度杜尔贝科改良伊格尔培养基（10x Dulbecco's Modified Eagle's Medium）的体积。
  3. 在冰上混合大鼠尾部胶原蛋白I（3.8 µg/mL储备液）、10倍浓度杜尔贝科改良伊格尔培养基以及添加了2%胎牛血清和适当趋化因子的1倍细胞培养基，使最终胶原蛋白浓度为2.4 mg/mL。
  4. 向混合物中加入4.5%碳酸氢钠溶液以中和胶原蛋白凝胶。
    注意：所加碳酸氢钠溶液的体积可能因其他试剂的确切pH值而异。最好使用pH试纸测试混合液以确保其为中性，或在培养基中使用pH指示剂进行监测。
  5. 在培养皿的玻璃底孔中，将80 µL胶原蛋白混合物覆盖于细胞表面。
  6. 将培养皿置于37 °C、含加湿器的CO2培养箱中，使胶原蛋白凝胶聚合30分钟。
  7. 在胶原蛋白凝胶上覆盖2 mL含低血清（2%）的细胞培养基，并在37 °C、含加湿器的CO2培养箱中孵育细胞24、48或72小时。
    注意：操作过程中应小心处理培养板，防止胶原蛋白凝胶从玻璃底部脱落。

3. 使用浓度为 3.8 µg/mL 的大鼠尾部胶原蛋白储备液制备胶原凝胶的示例

  1. 在冰上，将 114.5 µL 大鼠尾胶原、16.6 µL 10x DMEM 和含趋化因子的 33.1 µL 培养基混合。
  2. 用 14.0 µL 碳酸氢钠中和胶原混合物。
  3. 继续执行步骤 2.5 的操作。

4. 细胞成像

  1. 轻轻移除培养皿中的培养基。
  2. 用 1 mL PBS 轻柔冲洗凝胶。
  3. 用 1 mL 4% 多聚甲醛固定细胞，孵育 15 分钟。
  4. 用 1 mL PBS 洗涤细胞两次。
  5. 在室温下用 DAPI 溶液（100 ng/mL）染色细胞 20 分钟。
  6. 使用共聚焦显微镜在不同位置对细胞成像，并以 16 µm 步长获取每个位置的 400 µm z 轴层扫图像。所用显微镜配备转盘扫描单元，可利用白光弧光激发光源实现共聚焦成像。使用数值孔径为 0.75 的 20X 物镜。
  7. 重建图像。
    1. 打开某一凝胶的图像（约 25 张），点击图像 → 堆栈 → 图像转为堆栈，创建图像堆栈。第一张图像对应凝胶底部（z = 0 µm），第二张图像对应 z 方向的第一步（z = 16 µm），第三张图像对应 z 方向的第二步（z = 32 µm）。在每一图像深度评估每个细胞核，并将细胞核最清晰对焦的深度指定为该细胞的侵袭深度。

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结果

我们采用带有玻璃底的35 mm培养皿和大鼠尾胶原蛋白I型来建立并优化一种 体外 三维侵袭实验方案。利用该实验，我们发现乳腺癌细胞MCF7和MSC细胞可侵入胶原凝胶，平均距离为0.04 ± 1.8 µm，和 41.3 ± 76.0 µm 分别在使用IGF1（18.6 ng/mL）作为趋化因子作用48 h后图2）。更重要的是，我们发现间充质干细胞（MSC）与MCF7细胞的融合产物（稀有细胞）也能够侵入胶原凝胶。它们在48小时内的平均侵袭距离为10.7 ± 12.4 µm 当使用18.6 ng/mL的IGF I作为趋化因子时（图2). MCF7 与 MSCs 在侵袭能力上的差异具有统计学意义（P <0.01)11融合产物与MCF7或MCSs在侵袭能力上的差异无统计学意义。然而，该实验 consistently 表明，癌细胞融合产...

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讨论

本文介绍一种简单的倒置垂直侵袭实验方法，适用于多种细胞类型，包括稀有细胞和/或依赖其微环境的细胞。在此三维侵袭实验中，细胞保持在其原有的微环境中，并被含有趋化因子的胶原凝胶覆盖。随后，细胞在胶原凝胶中迁移并发生侵袭。该实验中，细胞可在凝胶内直接染色并便于观察。该方法操作简便且可重复性高，是研究癌细胞在三维体系中迁移与侵袭行为的实用工具。然而，似乎需要较强的趋化因子才能打破细胞对培养皿底部的黏附倾向。

我们优化了35 mm培养皿中的倒置垂直侵袭实验。这种培养皿具有一个10 mm的玻璃底小室，非常适合成像。该培养皿的一个局限性是进行实验时需要较大量的胶原凝胶。寻找与成像兼容且尺寸更小的培养皿将更为经济。由于机械强度的原因，适用于35 mm培养皿设计的凝胶层非常脆弱，若操作不当，极易从培养板底部脱落。不同的细胞培养设计可能会提高胶原凝胶层的稳定性，但需优化胶原凝胶强度与细胞活力之间的兼容性。

尽管存在这些局限性，与其它三维侵袭实验方法相比，倒置垂直侵袭实验仍具有诸多优势。其主要优点在于细胞能够保持在原有的培养环境中，而这是趋化小室实...

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

本研究工作由美国国立卫生研究院（NIMHD-G12MD007581）通过杰克逊州立大学RCMI环境健康中心以及美国国防部创意奖11-1-0205资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MatTek P35G-1.5-10CMatTek 公司，阿什兰，马萨诸塞州P35G-1.5-10-CMattek 玻璃底培养皿
大鼠尾胶原蛋白 I康宁，纽约州康宁市，美国354236胶原凝胶
盐酸Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯，邮编 63178H1758HCl
磷酸盐缓冲液赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆10010023PBS
10倍浓缩杜尔贝科改良伊格尔培养基Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯，邮编 63178D242910X DMEM
碳酸氢钠Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯，邮编 63178S5761NaHCO₃3
共聚焦荧光显微镜美国宾夕法尼亚州森特瓦利，奥林巴斯美国公司奥林巴斯 IX81共聚焦显微镜  显微镜
明确界定的胎牛血清美国犹他州 GE Healthcare Life Sciences HyClone 实验室SH30070.03FBS
钛：蓝宝石多光子激光扫描显微镜美国南达科他州苏福尔斯普雷里科技公司40倍 NA 0.8 物镜MPLSM
Imaris 软件Bitplane 公司，苏黎世，CHImaris 7.5.2Imaris 软件
DAPISigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯，邮编 63178D9542DAPI
多聚甲醛赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆50980487PFA
α最小必需培养基Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯，邮编 63178M0894
MDA-MB-231ATCC；美国弗吉尼亚州马纳萨斯HBT-22
间充质干细胞Trivedi 和 Hematti，2007
20X物镜 UPLAPO奥林巴斯美国公司，美国宾夕法尼亚州森特瓦利36-064奥林巴斯 UPLSAPO 20X 物镜

参考文献

  1. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
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