戊四氮诱导的点燃小鼠模型

摘要

本方案描述了一种使用戊四氮进行化学点燃的方法，并提供了一种癫痫的小鼠模型。该方案还可用于研究小鼠在癫痫发作后对惊厥诱导的易感性及发病机制。

摘要

戊四氮（Pentylenetetrazole, PTZ）是一种GABA-A受体拮抗剂。向动物腹腔注射高剂量PTZ可诱发急性且严重的癫痫发作，而反复注射亚惊厥剂量的PTZ则可用于建立化学点燃模型，即一种癫痫模型。单次注射低剂量PTZ可引起轻度癫痫发作但不伴随惊厥。然而，重复注射低剂量PTZ会逐渐降低诱发惊厥性癫痫发作的阈值。最终，持续给予低剂量PTZ可诱导出严重的强直-阵挛性癫痫发作。该方法操作简便，广泛适用于研究癫痫的病理生理机制，癫痫被定义为一种以反复发作性癫痫发作为特征的慢性疾病。这种化学点燃方案可在动物体内引发反复癫痫发作。利用该方法，可评估动物对PTZ诱导癫痫发作的易感性或癫痫发作加重的程度。这些优势使得该方法被广泛用于抗癫痫药物及癫痫相关基因的筛选。此外，该方法也被用于研究癫痫发作后的神经元损伤，因为在癫痫患者脑组织中观察到的组织学改变同样出现在化学点燃动物的脑内。因此，该方案可用于便捷地构建癫痫动物模型。

引言

癫痫是一种慢性神经系统疾病，以反复发作的癫痫发作为特征，影响约1%的人口。在临床研究中，无法完全阐明癫痫患者癫痫发生及癫痫发作的潜在机制。因此，研究癫痫需要合适的动物模型¹。

已采用多种癫痫动物模型来研究癫痫的生理学机制并筛选抗癫痫药物^2,3。在这些模型中，药理学诱导惊厥是一种常用于建立癫痫病理研究动物模型的方法⁴。该方法成本低且操作简便。电极介导的点燃法也是一种常用方法，但该技术成本较高，且需要手术和电刺激技术以诱发重复性惊厥发作⁵。

药理学诱导还具有优势，因为癫痫发作的时间和次数易于控制。表现出自发性癫痫发作的转基因小鼠模型也常用于癫痫研究。然而，在这些遗传模型中，可能无法预测癫痫发作的时间和频率⁶。需要使用监测系统来观察基因修饰小鼠的癫痫行为⁶。

红藻氨酸、匹罗卡品和戊四氮（PTZ）被广泛用作诱发癫痫发作的药物⁷。红藻氨酸是谷氨酸受体的激动剂，而匹罗卡品可激活胆....

方案

所有实验程序均经东京都医学科学研究所动物护理与使用委员会批准。建议使用出生后8至16周龄的小鼠。任何近交系小鼠均可用于本实验。C57BL/6小鼠对PTZ的耐受性较强，而BALB/c和Swiss albino小鼠对PTZ更为敏感。本研究中使用了C57BL/6小鼠。小鼠对PTZ的易感性也与其年龄有关。与年轻小鼠相比，年老小鼠对PTZ的反应性较低³⁵。本方法所用动物数量可有所变化，但每种实验条件至少需要6至10只动物。

1. PTZ 的制备

1. 将2 mg/mL的PTZ溶解于无菌0.9% (w/v) NaCl中。PTZ需在使用当天配制。

2. PTZ 注射

1. 所有实验均在上午9:00至中午12:00之间进行。
2. 测量动物的体重。
3. 将动物放入观察室中进行适应性训练。
4. 在适应期（3分钟）内，根据动物体重和先前确定的注射剂量计算PTZ溶液的注射体积。
   注：例如，当使用35 mg/kg PTZ时，一只体重为25 g的小鼠需要0.875 mg PTZ（35 mg/kg × 0.025 kg = 0.875 mg）。因此，应注射437.5 μL的2 mg/mL PTZ溶液（0.875 mg / 2 mg/mL = 0.4375 mL）。PTZ的注射剂量取决于小鼠的基....

结果

重复注射PTZ可诱导癫痫发作严重程度增加。6只C57BL/6小鼠接受PTZ处理，另6只小鼠注射生理盐水作为对照组。PTZ剂量为35 mg/kg，共给予10次注射。随着PTZ注射次数增加，癫痫发作评分逐渐升高，而生理盐水注射未引发任何癫痫发作或异常行为（图2）。采用ANOVA分析后进行Bonferroni检验，结果显示PTZ处理组与生理盐水处理组之间存在显著差异。

反复发作的癫痫会促进海马区轴突分支异常形成（苔藓纤维出芽）以及颗粒细胞的异常迁移。小鼠接受了为期25次的PTZ注射处理（剂量在24 mg/kg至35 mg/kg之间调整，以维持小鼠出现严重癫痫发作，同时避免因发作过重导致死亡）。最后一次注射后3周固定小鼠脑组织。对照组脑组织在PTZ注射前进行固定。脑切片使用抗synaptoporin抗体（x 500）和抗ZnT3抗体（x 500）进行免疫染色，以观察苔藓纤维出芽（

讨论

本文介绍了一种易于实施的药理学癫痫动物模型建立方案。戊四氮（PTZ）介导的化学点燃模型历史悠久，是研究癫痫组织病理学和细胞病理学的常用模型⁴¹。Suzdak 和 Jansen（1995年）曾对该癫痫化学点燃模型进行了综述⁴²。药理学诱导癫痫发作，尤其是使用PTZ，是一种简便易行的诱发严重癫痫发作的方法。注射剂量的变化与癫痫发作严重程度相关。因此，通过多次试验调整PTZ剂量并观察相应行为变化，很容易确定合适的剂量。

许多研究人员已尝试构建作为癫痫模型的基因敲除或基因敲入小鼠，并成功获得了可自发出现癫痫发作的小鼠^43,44。然而，药理学诱导癫痫发作仍被视为一种良好的癫痫模型。另一种常见的癫痫诱导方法是通过植入电极至动物脑内，诱发电休克介导的癫痫发作，该方法无需基因修饰。但此方法成本较高、操作困难，且需要熟练的手术技巧以将电极精确植入脑内特定位置

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
戊四氮	Sigma-Aldrich	P6500
氯化钠	MANAC	7647-14-5
小鼠	CLEA Japan		C57Bl/6NJcl，出生后8周，雄性
注射器（1 mL）	Terumo	SS-01T
针头（27G × 3/4"）（0.40 × 19 mm）	Terumo	NN-2719S
电子天平	Mettler	PE2000	该产品已停产。功能几乎等同于A&D公司生产的FX-2000i与FXi-12-JA组合。
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
氢氧化钠	nacalai tesque	31511-05
蠕动泵	ATTO	SJ1211
蔗糖	nacalai tesque	30404-45
切片机	Yamato	REM-700	该产品已停产。功能几乎等同于REM-710。
切片机刀片	Feather	S35
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
抗突触孔蛋白抗体	Synaptic systems	102 002
抗ZnT3抗体	Synaptic systems	197 002
抗双皮质素抗体	Santa Cruz	sc-8066	该产品已停产。我们未测试其替代产品（sc-271390）。
情境性恐惧辨别实验装置	O'hara
三室实验装置	Muromachi