一种在非人灵长类动物普通狨猴（Callithrix jacchus）中向内耳给药的外科手术方法

摘要

我们报道了一种通过圆窗膜向非人灵长类动物——普通狨猴（Callithrix jacchus）的内耳给药的外科手术方法。

摘要

听觉研究长期以来依赖啮齿类动物模型，但在某些疾病中，无法重现人类的症状。普通狨猴（Callithrix jacchus）是一种体型小、易于操作的新世界猴，其颞骨解剖结构，包括中耳听小骨链和内耳，比啮齿类更接近人类。本文报道了一种可重复、安全且合理的手术入路，用于向普通狨猴内耳的耳蜗圆窗龛给药。我们采用临床上用于人类手术的后方鼓室切开术，以避免操作鼓膜可能引起的传导性听力损失。该手术未导致任何显著的听力损失。由于普通狨猴具有较大的鼓室结构，该入路成为可能，但仍需谨慎处理外半规管和面神经的垂直段。这种手术方法使我们能够在不引起听力损失的情况下，安全、准确地给药，这对于转化研究中获得临床前概念验证至关重要。

引言

感音神经性听力损失（SNHL）主要源于耳蜗的损伤或功能缺陷。SNHL 的常见病因包括衰老（例如 老年性耳聋）、遗传缺陷、暴露于高强度噪声、感染以及耳毒性药物¹。世界卫生组织（WHO）估计，全球超过 3.6 亿人（占世界人口的 5.3%）患有听力损失²。据估算，每 900 至 2,500 名新生儿中就有 1 例存在中度、重度或极重度的先天性永久性听力损失，而约每 3 名年龄超过 65 岁的成年人中就有 1 人存在不同程度的听力损失³。然而，目前尚无针对这些患者的听力损失有效的临床治疗方法。

长期以来，听力研究主要使用啮齿类动物或豚鼠模型，许多方法如基因治疗和再生治疗已被提出作为听力损失的新疗法。然而，人类与啮齿类动物在听觉系统方面存在较大差异，将动物模型的研究成果转化为人类应用十分困难。普通狨猴（C. jacchus）是一种源自亚马逊地区的美洲新大陆猴，由于多种原因，已成为多种基础研究中颇具吸引力的非人灵长类动物模型。首先，其解剖结构和生理特征比啮齿类动物更接近人类。其次，该物种的基本生物学信息，包括疾病、神经网络、行为和基因组等，均已得到充分表征。有关普通狨猴的听觉与发声处理、周期性皮层编码、音高表征以及听觉-发声相互作用的研究也已有报道^{4,5,6,7,8,9,10}。在近期的组织学研究中，研究人员鉴定了20个耳聋基因和阴离子交换体在普通狨猴耳蜗中的特异性表达模式，并发现其中5个导致进行性耳聋的基因以及3种阴离子交换体的表达模式与啮齿类动物不同^11,12。这些特征使我们相信，普通狨猴是听力研究中一种强有力的工具。

普通狨猴作为实验动物的最显著特征如下：

• 与一些旧世界猴相比，狨猴体型较小，易于操作：成年狨猴体重为300–400 g，体长约60 cm，与大鼠相似。
• 高繁殖力的灵长类动物：狨猴在18个月大时达到性成熟，每年可繁殖两次，每年产仔4至6只。
• 可进行基因改造：Sasaki E 等 成功构建转基因¹³ 和敲除¹⁴ 通过基因改造与神经系统疾病相关的狨猴等灵长类动物例如， 帕金森病和阿尔茨海默病
• 胚胎干细胞（ES 细胞）和诱导性多能干细胞（iPS 细胞）均已建立^15,16尽管与啮齿类动物相比，维持相同数量的狨猴较为困难，但干细胞或诱导多能干细胞的可获得性提供了 体外 减少数量的检测方法 体内 所需检测方法。

为了促进耳聋及其潜在治疗方法领域的转化研究，我们建立了一项成像研究方案，结合使用计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）、全身麻醉以及听觉脑干反应（ABRs）进行听力检测。这些实验系统可为我们提供更佳的机会，开展临床前概念验证研究，这对于弥合啮齿类动物研究与临床试验之间的差距至关重要。本文中，我们报道一种通过圆窗膜向普通狨猴内耳给药的手术方法。为了清晰观察圆窗周围结构，同时避免操作鼓膜可能引起的传导性听力损失，经乳突腔入路是一种有效的方法。在临床上，该方法被称为"后方鼓室切开术"，已被广泛应用，常用于人工耳蜗植入和胆脂瘤手术。我们认为，后方鼓室切开术能够实现精准的药物递送，同时避免诱发听力损失。

方案

所有实验操作均在东京日本医科大学进行。动物饲养和实验操作已获得日本医科大学机构动物护理与使用委员会的批准（批准号：26-060），并严格遵循日本医科大学关于实验动物使用机构指南的规定，该规定符合日本科学理事会《实验动物正确使用指南》（2006年）的要求。动物护理工作遵循《实验动物护理与使用指南》（实验动物资源研究所，1996年）中的建议。

1. 术前检查

1. 在手术前至少一个月，对动物（普通狨猴）进行颅脑计算机断层扫描（CT），以辅助识别个体解剖结构。
2. 在手术前至少一个月进行听力测定测试。
   注意：本实验中采用听性脑干反应（ABR）评估听力状态。简言之，将阳性电极皮下置于头顶，参考阴性电极置于刺激耳的背部基部，接地电极皮下置于颈部背侧。^17,18 使用短音刺激（1.0 ms 短音持续时间，上升和下降时间均为 0.1 ms）诱发 ABR。随后以 10 dB 为步长逐步降低声音强度。在每个声音强度下，平均采集 512 次反应（刺激极性交替）。ABR 阈值定义为能够检测到任何波形的最低声压级（SPL）。

2. 麻醉

1. 手术前一晚对动物进行禁食，并在全身麻醉下进行操作。
2. 使用面罩通气或诱导室，以4%异氟烷与空气混合气体（流速5–6 mL/min）进行缓慢诱导图1A确认动物对疼痛刺激（如脚趾挤压）无反应。
3. 使用右美托咪定（0.04 mg/kg）、咪达唑仑（0.4 mg/kg）和布托啡诺（0.4 mg/kg）混合溶液，经股肌肌肉注射，对普通狨猴进行麻醉。
4. 皮下注射氨苄青霉素（0.08 mg/g），注射时间在30分钟或更早之前 在皮肤切口前作为术前抗生素使用。
5. 将狨猴置于仰卧位，头部朝上，伸展头颈部。用尼龙线将上颌固定于操作台，并上提舌头以获得清晰视野，或 alternatively 使用喉镜观察会厌及喉部入口图1B).
6. 沿会厌的喉面插入气管插管。
   注意：可以使用16号静脉导管或6-French规格饲管作为气管插管图1C).
7. 检查 EtCO₂₂ 通过气管插管确认其已正确插入气管。在导管定位完成后，检查呼吸气体流动情况，然后用胶带将气管插管固定在狨猴面部。
8. 手术过程中维持异氟烷麻醉浓度在1-3%。
9. 监测 SpO₂₂, 呼气末二氧化碳₂，术中监测体温和直肠温度。所有操作均应在加热垫上进行，以防止体温下降。

3. 术前准备

1. 将狨猴置于仰卧位，并将其头部向非手术侧倾斜30至45度（图2A）。
2. 剃除手术侧耳后区域的毛发。
3. 使用酒精和聚维酮碘对耳后区域及外耳道进行手术区域消毒。
4. 在狨猴身上铺设带有圆形开口的手术洞巾（图2B）。

4. 手术操作

1. 在皮肤切口部位皮下注射1%盐酸利多卡因（含1:100,000肾上腺素，0.1–0.2 mL）。使用15号圆形刀片在耳后皮肤做切口。
2. 为实现止血，用浸有1:5,000稀释肾上腺素的纱布按压出血区域。双极电凝也有效（图2C）。
3. 分离耳后区域的软组织，以辨认耳软骨（c）和耳后肌（m）。暴露外耳道骨部，该结构应位于软骨深部并可见（图3A）。
4. 为确认鼓膜的深度，暴露鼓环的骨性部分，该部分可在耳道最深处识别为皮肤与骨的粘连处。
   注意：此步骤有助于我们判断中耳腔外侧部分的深度（图3A）。
5. 将耳后肌（胸锁乳突肌、头夹肌及二腹肌后腹）向尾侧剥离，使其与颞骨分离。随后暴露颞骨的外侧面（图3B中标注星号处）。
6. 使用1.0 mm金刚砂钻头在外耳道后方约5 mm处钻孔（图3C）。根据钻孔位置调整钻速至1,000 – 8,000 rpm。
   注意：在半规管或面神经附近进行精细操作时，应采用较低转速。 钻孔过程中应适当滴加生理盐水，以防热损伤。
7. 继续钻磨扩大孔洞，并确认水平半规管（HSC）的位置，其向乳突腔方向隆起（图3D）。
8. 确认面神经的位置，其垂直段位于HSC前方。若存在骨隔，应钻除所有骨隔，以清晰暴露面隐窝，该区域位于面神经与鼓索神经之间的三角区中心。
9. 使用直径0.6 mm金刚砂钻头在面神经垂直段与鼓环之间（图4A中标注星号处）以1,000 rpm转速钻出一小孔。
10. 操作钻头时应平行于后半规管壁移动，以防损伤面神经（透过变薄的骨壁可观察到粉红色线条）。当即将暴露呈白色线条状的神经结构时，应立即停止钻磨（图4B）。
11. 确保可通过该孔洞观察到圆窗龛（图4C）。随后使用25号或更细的针头向龛内给药。为使药物保留在圆窗龛内，可在龛内放置黏性溶液（图4D）。
12. 确认止血完全后，使用6-0可吸收缝线以单纯间断缝合法逐层关闭切口（表皮层和真皮层）。
13. 在手术创面覆盖纱布，并固定绷带。

5. 术后护理

1. 在股部肌肉处注射盐酸阿替美唑（0.15 mg/kg），以拮抗美托咪啶的作用。
2. 当自主呼吸开始时，拔除气管插管。
3. 将普通狨猴置于重症监护单元中，给予30% O₂、29 ℃环境，直至麻醉作用完全消退并清醒。
4. 确认无眼球震颤等提示前庭功能障碍的异常表现后，将动物送回繁殖笼具。

结果

对7岁龄普通狨猴的右耳进行后鼓室切开术，未出现手术部位感染、血管损伤导致的出血或前庭功能障碍等并发症，此类并发症有时会在中耳操作过程中发生。我们向圆窗龛内给予1 µL磷酸盐缓冲液。术前及术后两个月均检测了听性脑干反应（ABR）（图5A-B）。ABR的波形和阈值与既往研究结果相似^17,18，且手术前后这些参数均无变化（图5C）。因此，我们得出结论：后鼓室切开术是一种安全且有效的方法，可用于向普通狨猴的圆窗龛内给药。

讨论

耳蜗血流量极小，据估计仅占人体总心输出量的百万分之一，且由于血-耳蜗屏障的存在限制了其通路，该屏障将内耳与全身循环系统分隔开来^19,20。由于这些原因，药物或病毒载体向内耳的递送更宜采用直接给药方式，而非全身给药。在小鼠和豚鼠实验中，已有多种给药方法被报道，包括经圆窗膜的耳后入路或腹侧入路、耳蜗造口术、内淋巴囊递送以及半规管入路^{21,22,23,24,25,26}。

在本研究中，我们采用后侧鼓室切开术和圆窗给药作为转化研究的潜在方法。后侧鼓室切开术是一种成熟的临床外科手术入路，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
普通狨猴	CLEA Japan	EDM:C.Marmoset(Jic)
异氟烷	Phizer
美托咪定	ZENOAQ
咪达唑仑	astellas
丁丙诺啡	Meiji Seika
氨苄青霉素	Meiji Seika
盐酸利多卡因	AstraZeneca
6-0 可吸收缝线	ETHICON	RD-1
盐酸阿替美唑	ZENOAQ
磷酸盐缓冲液	Wako	045-29795
Surge Wave	Morita	TR-900-OR
Diamond Bar 006	Morita	14070057
Diamond Bar 010	Morita	14070081
重症监护室	Menix	P-100