寻找靶向治疗获得性耐药的驱动通路：通过基因敲降产生耐药亚克隆并恢复药物敏感性

摘要

这是一种省时且经济高效的方法 体外 研究靶向治疗药物获得性耐药机制的方案，这是癌症治疗中尚未满足的重大医学需求。

摘要

过去二十年间，医学肿瘤学领域已从细胞毒性药物转向靶向治疗。尽管靶向治疗药物相比传统疗法展现出更显著的临床疗效并减少了不良反应，但药物耐药性已成为限制其疗效的主要因素。目前，已开发出多种用于临床实践中靶向药物获得性耐药的临床前 in vitro/in vivo 模型，主要采用两种策略：i）通过基因操作模拟获得性耐药的基因型；ii）in vitro/in vivo 筛选耐药模型。在本研究中，我们提出一个统一的研究框架，用于系统探究靶向治疗药物获得性耐药的潜在机制，从耐药细胞亚克隆的建立，到描述用于恢复药物敏感性的基因沉默技术。这一方法简单、省时且成本低廉，具有广泛的适用性，可轻松拓展应用于研究不同肿瘤组织类型中其他靶向治疗药物的耐药机制。

引言

在分子和细胞生物学领域取得关键发现的基础上，已开发出多种新型合成抗癌分子，可选择性地靶向多种肿瘤类型中的致癌信号通路。特别是两类具有独特性质的靶向治疗药物——合成化学化合物和重组单克隆抗体——在近几十年来已取得临床成功，显著改变了癌症治疗的格局^1，2，3。

然而，尽管癌症患者对治疗的初始反应令人鼓舞，但大多数患者已对所有靶向治疗药物（包括单克隆抗体和激酶抑制剂）产生了耐药性。因此，耐药性这一传统抗癌药物面临的主要障碍⁴，对于新兴的靶向治疗而言仍然是一个巨大的挑战^5,6。

靶向治疗耐药性可能是固有的（即，先天性）或后天性（即，次要的）。内在抗性描述了一种 从头合成 对治疗无应答，而继发性耐药则发生在药物治疗一段时间后出现应答之后⁷后者由原发肿瘤内部或远端隐匿解剖位点中少量肿瘤细胞群的暴发引起，这些细胞对一种或多种靶向治疗药物的耐药率可高达90%。靶向治疗耐药性发展的分子机制主要源于靶基因突变以及其他促存活信号通路的冗余激活，目前对这些机制的理解仍远不充分。⁸.

在本研究中，我们提出了一种省时且经济高效的方法来开展研究 体外 靶向治疗药物获得性耐药机制的研究，从耐药细胞亚克隆的产生，到用于恢复抑制剂敏感性的基因沉默技术的描述，后者是检验和验证工作假设的关键工具。特别是，我们的方法被用于研究胃癌中对曲妥珠单抗（trastuzumab）的耐药机制例如，赫赛汀（Herceptin），一种靶向HER2蛋白胞外域的人源化单克隆抗体⁹曲妥珠单抗联合化疗被广泛接受为HER2阳性转移性乳腺癌的标准一线治疗方案。近年来的临床前研究显示，抗HER2治疗在两者中均具有显著活性 体外 和 体内 HER2阳性胃癌模型^10,11，针对HER2的分子靶向药物已在胃食管癌患者中广泛开展临床试验，其中部分试验仍在进行中^12,13,14,15.

这些研究强调了对曲妥珠单抗产生耐药性的患者数量正在上升¹⁶，这与其他靶向治疗抑制剂所观察到的情况类似。特别是，曲妥珠单抗的应答率为47%，而接受曲妥珠单抗联合化疗的患者的中位总生存期仅比单用化疗的患者延长2.7个月¹⁷。这表明，尽管原发性曲妥珠单抗耐药较为常见，但继发性耐药也是不可避免的。因此，迫切需要阐明导致胃癌中HER2靶向治疗耐药的机制，而该肿瘤内在的遗传异质性使得这一问题更加复杂¹⁸。

此外，胃癌对曲妥珠单抗的耐药机制一直难以阐明，部分原因在于难以获得能够代表该病况的可靠临床前模型。Oshima 等 报道了一种 体内 曲妥珠单抗耐药性胃癌细胞系的筛选方法，包括在曲妥珠单抗治疗后对少量残留腹膜转移灶进行反复培养¹⁹然而，该方法需要专门的饲养设施、特定的动物操作技术以及动物伦理委员会的批准，这些因素均使其成为一种耗时且昂贵的方法。本文所描述的方法简单且具有广泛的适用性，可轻松扩展用于研究不同肿瘤组织类型对其他治疗药物的耐药机制。²⁰.

方案

注意：本实验方案已针对 HER2 阳性胃癌细胞系对曲妥珠单抗获得性耐药机制的研究进行了专门优化。所需全部实验仪器均列于材料表中。

1. 靶向治疗耐药亚克隆的建立

注意：由于不同细胞系可能对靶向治疗抑制剂表现出不同的敏感性，且这种差异独立于肿瘤组织学类型或所用药物浓度，因此该步骤是本实验方案中最关键且最难标准化的环节。

1. 在含10%胎牛血清和谷氨酰胺（2 mM，1%）的RPMI培养基中，于37 °C以单层培养NCI-N87细胞系，并将其接种至25 cm²培养瓶中² 培养瓶
2. 在每个烧瓶的培养基中加入10 µg/mL的曲妥珠单抗作为起始剂量。使细胞暴露于该起始剂量，直至其恢复生长。
   注意：靶向治疗抑制剂的起始剂量应为其血浆峰浓度的十分之一。血浆峰浓度通常是指在给予标准治疗的多次剂量后，在患者血液中检测到的药物最高浓度。该数值可从药代动力学研究中获得。
3. 使用台盼蓝排斥法监测细胞生长；当细胞生长恢复时（通常在两到三周后），用高10倍浓度的曲妥珠单抗处理细胞。
4. 将细胞暴露于浓度逐渐增加的曲妥珠单抗（从100 µg/mL增至400 µg/mL），直至细胞在高药物浓度下仍持续生长（约2周后），即使药物浓度至少达到2.5 - 是血浆峰值的4倍。
5. 通过克隆形成实验评估每次改变培养基中靶向治疗抑制剂浓度时细胞对靶向治疗的耐药水平，并确定相对耐药性IC₅₀ 指数（RR IC₅₀如下所示。
   1. 在24孔培养板中每孔接种500个细胞。
      注意：每种条件组合需准备5个孔。
   2. 将细胞暴露于浓度从100 µg/mL逐步增加至400 µg/mL的靶向治疗抑制剂（trastuzumab）中。
   3. 在 CO₂ 培养箱中孵育细胞₂ 37 °C 培养箱中培养 15 天。
   4. 孵育结束后，按如下步骤对样品进行固定和染色。
      1. 吸除培养基，用 10 mL 1× PBS 洗涤细胞。吸除 1× PBS 加入2–3 mL固定液（乙酸:甲醇，1:7，体积比）。去除固定液，加入0.5%结晶紫溶液，室温孵育2小时。
      2. 用移液器小心吸除结晶紫溶液，将平板浸入自来水中以洗去残留的结晶紫溶液。室温下晾干，最长不超过2天。
   5. 使用倒置显微镜（4倍放大）计数超过50个细胞的集落。
      注意：此步骤需要两名独立的观察者。
   6. 计算 RR IC₅₀ IC的比值₅₀ 靶向治疗耐药亚克隆细胞的数值与原始/未受治疗细胞的数值。

2. 候选靶向治疗耐药基因（R基因）的验证方案

注意：在完成基因表达特征分析后，将通过以下方法研究与靶向治疗获得性耐药相关的信号通路及任何候选耐药驱动基因：a) RT-PCR，以及 b) 蛋白质印迹分析。

1. 实时荧光定量RT-PCR
   1. 使用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿混合液从细胞系中提取总RNA（参见 材料表).
   2. 使用随机六聚体引物进行逆转录（RT）反应，并按下述条件设置热循环仪：25 °C下预变性5 min，46 °C下逆转录20 min，95 °C下逆转录酶失活1 min。
   3. 使用400 ng总RNA进行20 µL反应。按如下方式配制样品反应体系：7 µL无RNase的H₂O₂O，2 µL cDNA（10 ng/µL），1 µL 20倍荧光标记的靶特异性探针，以及10 µL含有缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶的2倍混合液（参见 材料表).
   4. 向每孔加入20 µL反应混合液，并运行以下程序：50 °C孵育2 min，95 °C预变性10 min（1个循环）；随后进行40个循环，95 °C变性15 s，60 °C退火延伸1 min。
2. 蛋白质印迹
   1. 加入2 mL 0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液，消化2–3分钟，以回收细胞悬液。
   2. 加入2倍体积含10%胎牛血清的培养基以中和胰蛋白酶（例如，每1 mL胰蛋白酶加入2 mL培养基）后，于1,200 × g离心5分钟。弃去上清液，用预冷的1×PBS洗涤细胞。
   3. 在 1,200 × g 离心 5 分钟，弃上清液。用裂解缓冲液重悬细胞沉淀，于 4 °C 在摇床中孵育 30 分钟。
      1. 裂解缓冲液的用量取决于细胞数量（例如，100 µL 用于 1 x 10⁶ 细胞）；每次均需新鲜配制裂解缓冲液。配制1 mL裂解缓冲液时（置于冰上操作）：使用975 µL M-PER哺乳动物组织蛋白提取试剂、15 µL蛋白酶和磷酸酶抑制剂、10 µL 100 µM PMSF抑制剂。
   4. 在4 °C下以13,000 × g离心15分钟，通过细胞裂解液离心回收上清液中的蛋白质。
   5. 使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。
   6. 向蛋白样品（至少 20 - 30 µg 蛋白）中加入 4x Laemmli 上样缓冲液，在 100 °C 加热 3 分钟。
   7. 使用预制的4 - 20%凝胶，每份样品上样20 - 30 µg Laemmli蛋白溶液和5 - 10 µL蛋白标准品。
   8. 用1× TRIS/甘氨酸/SDS缓冲液填充Western blot电泳槽，以110 V电压运行30–60分钟（当时间到达后检查染料是否已迁移至凝胶底部，若未到达则继续电泳数分钟）
   9. 电转印将蛋白质转移至PVDF膜（参见 材料表) 使用半干式系统。
   10. 用适当的蛋白溶液（5% 脱脂牛奶/BSA）在室温下于摇床上孵育膜 1 小时以封闭。
   11. 用抗IQGAP1一抗抗体在5%脱脂牛奶溶液中配制1:400的稀释液（参见 材料表).
   12. 将膜置于一抗溶液中，于4°C摇床孵育过夜。
   13. 次日，弃去抗体溶液，用 T-TBS 1x 浸泡 溶液（1× T-TBS：1× 在室温下于摇床上用含0.1% Tween20的Tris盐水缓冲液孵育7分钟。
   14. 弃去 T-TBS 1× 溶液并更换，重复3次。
   15. 通过添加用于标准 Western 印迹检测的二抗（见 材料表）并将膜置于摇床上，室温孵育2小时。
   16. 弃去抗体溶液，用 T-TBS 1x 浸泡 在室温下于摇床中振荡溶液 7 分钟。
   17. 弃去 T-TBS 1× 溶液并更换，重复3次。
   18. 将膜在化学发光溶液中浸泡5分钟，然后在化学发光成像仪上对膜进行成像。

3. 通过候选R基因敲低恢复靶向治疗抑制剂敏感性

1. 细胞准备
   1. 通过胰蛋白酶消化制备单细胞悬液。在细胞铺板当天进行转染。
      1. 用 PBS 洗涤 NCI-N87 细胞，并在 37 °C 下用 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 溶液孵育 5 - 10 分钟。加入两倍体积含 10% 胎牛血清的 RPMI 培养基以中和胰蛋白酶（例如，每 1 mL 胰蛋白酶加入 2 mL 培养基）。
      2. 使用台盼蓝染色法和血细胞计数板计数细胞。每种条件接种 2.5 × 10⁵ 个细胞（60% 汇合度）至 T25 cm² 培养瓶中。
         注：最佳接种细胞数量取决于细胞系的倍增时间和实验持续时间。目标是在整个实验期间维持目标基因的敲低效果。进行转染和克隆形成实验时，九个 T25 cm² 培养瓶最为理想（3 个用于对照组，3 个用于阴性转染对照组，3 个用于靶基因转染组）。
2. 反向转染
   1. 为每个 T25 cm² 培养瓶配制靶基因和阴性对照转染混合液，步骤如下：
      1. 将 12.5 µL 的每种靶向基因 siRNA 寡核苷酸或阴性对照 siRNA 寡核苷酸稀释于最低必需转染培养基中（比例为 1:55；参见 材料表）。
      2. 加入阳离子脂质体转染试剂（与靶向基因 siRNA 寡核苷酸按 1:1 比例添加；参见 材料表）。室温孵育 20 分钟。
         注：转染混合液的总体积为 700 µL。
      3. 将 700 µL 转染混合液加入每个 T25 cm² 培养瓶中。在 37 °C 下孵育细胞 1 - 3 天。
   2. 通过 RT-PCR 和 Western blot 分析验证基因敲低效果。通过克隆形成实验再次确认假定的 R 基因敲低对靶向治疗药物敏感性恢复的影响（重复步骤 1.5）。

结果

图1概述了实验流程的框架。选取三种高表达HER2且对曲妥珠单抗敏感（IC₅₀ < 药物峰血浆浓度，图2A，左图）的胃癌细胞系，将其培养于含有靶向治疗药物的培养基中。起始剂量设定为曲妥珠单抗峰血浆浓度的1/10（10 µg/mL），并在8至12个月期间逐步增加至400 µg/mL。随后，我们获得了三个具有稳定耐药表型的亚克隆，其IC₅₀值均低于曲妥珠单抗的峰血浆浓度（图2A，右图）。其中，耐药性最强的亚克隆HR NCI N87的耐药指数（RR）IC₅₀值达到28.57（图2B）。IQGAP1在HR NCI N87亚系的耐药表型中似乎发挥着关键作用。蛋白和基因表达分析支持了这一假设：耐药亚克隆中IQGAP1蛋白水平约为亲本细胞的5倍；相应地，HR NCI N87亚系中I...

讨论

尽管个体化治疗和靶向治疗已引起越来越多的关注，但这些所谓的“智能”疗法与传统化疗药物一样，面临着一个主要障碍，即药物耐药性的快速且不可预测的获得。i.e.，为了提高靶向治疗的效果，必须通过更深入地理解导致耐药的机制来解决耐药性问题。本文介绍了一种广泛可行的in vitro方法，用于在癌细胞系模型中研究靶向治疗药物获得性耐药的机制。

由于所用细胞系之间存在内在的遗传异质性以及对药物敏感性的差异，靶向治疗耐药亚克隆的建立是本实验方案中最关键且最难标准化的步骤。因此，获得耐药亚克隆所需的时间可能有所不同。长期暴露于抗癌分子药物通常会引起显著的肿瘤生长抑制。然而，在持续药物暴露一段时间后（8 - 12 个月），细胞会恢复生长，其生长速率与未经处理的对照细胞相似。

此外，尽管基因表达数据已被用于推测与基因相关的靶向治疗耐药性，但表达水平的差异并不总能反映蛋白质功能异常，也不一定与耐药表型相关。由于假定的耐药基因表达与靶向治疗耐药性之间的关系复杂，还需进一步开展分子水平的研究，例如包括基因/蛋白质相互作...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Trizol试剂	Invitrogen	15596026	TRIzol试剂是一种用于从多种生物样本中分离高质量总RNA，或同时分离RNA、DNA和蛋白质的试剂
ISCRIPT cDNA合成试剂盒	Bio-Rad	1708891	iScript cDNA合成试剂盒是一种灵敏且易于使用的第一链cDNA合成试剂盒，适用于基于实时定量PCR的基因表达分析。
TaqMan 基因表达检测	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems TaqMan 基因表达检测包含一对未标记的 PCR 引物和一条 TaqMan 探针，该探针在 5′ 端带有 Applied Biosystems 的 FAM 或 VIC 荧光染料标记’ 末端和小沟结合物（MGB）以及非荧光淬灭剂（NFQ）位于3端’ 结束。
M-PER 哺乳动物蛋白提取试剂	赛默飞世尔科技	78501	Thermo Scientific M-PER 哺乳动物蛋白提取试剂旨在高效提取培养的哺乳动物细胞中的总可溶性蛋白。
Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液（100X）	赛默飞世尔科技	78440	Thermo Scientific Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液（100X）提供了一种单一溶液的便捷选择，可为细胞和组织裂解液中的蛋白质样品提供全面保护。
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	赛默飞世尔科技	23225	Thermo Scientific Pierce BCA 蛋白检测试剂盒是一种双组分、高精度、可耐受去垢剂的比色法蛋白检测试剂，通过测定 562 nm 处吸光度（A562nm）来定量待测样品的总蛋白浓度，并以标准蛋白为参照。
4x Laemmli 上样缓冲液	Bio-Rad	1610747	使用4倍浓度的Laemmli上样缓冲液制备用于SDS-PAGE的样品。如需还原样品，在与样品混合前向缓冲液中加入还原剂（如2-巯基乙醇）。
4–20% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶	Bio-Rad	456-1094	长寿命TGX（Tris-甘氨酸延长型）凝胶具有新型配方，可用于标准变性蛋白质分离以及天然电泳。
Precision Plus Protein WesternC 印迹标准品	伯乐（Bio-Rad）	1610376	Precision Plus Protein 预染标准品提供四种规格：Dual Color、All Blue、Kaleidoscope 和 Dual Xtra。这四种规格在凝胶电泳中的迁移模式相同，均含有三条高亮度参考条带（25、50 和 75 kD）。
10x Tris/甘氨酸/SDS	伯乐（Bio-Rad）	1610732	10x Tris/甘氨酸/SDS 是一种预混的电泳运行缓冲液，用于通过 SDS-PAGE 分离蛋白质样品。
Trans-Blot Turbo Mini PVDF 转膜试剂盒	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini PVDF 转膜试剂盒，用于通过 Trans-Blot Turbo 转膜系统快速高效地将蛋白质从迷你凝胶转移。每个真空密封、即用型转膜试剂盒包含两组缓冲液饱和的离子储液垫和一张预湿的 PVDF 膜。
Precision Protein StrepTactin-HRP 结合物	伯乐（Bio-Rad）	1610381	StrepTactin-辣根过氧化物酶（HRP）偶联物，用于化学发光或比色法检测 Western 印迹上的 Precision Plus Protein 未标记蛋白标准品或 Precision Plus Protein WesternC 蛋白标准品。
Immun-Star WesternC 溶液	Bio-Rad	5572	Immun-Star WesternC 溶液是一种蛋白质检测方法，可检测中等飞克水平的蛋白质含量。
通用阴性对照	Invitrogen	12935300	阴性对照siRNA与小鼠、大鼠或人类基因序列无显著序列相似性。该对照已在基于细胞的筛选实验中经过测试，证实对细胞增殖、活力或形态无显著影响。
opti-MEM Glutamax 培养基	赛默飞世尔科技	51985026	Opti-MEM培养基是一种改良的最低必需培养基（MEM），可在不影响细胞生长速率或形态的前提下，将胎牛血清的添加量减少至少50%。
Silencer Select 预设计 &和经过验证的siRNA	Ambion	4390824	RNA干扰（RNAi）是研究多种细胞类型中蛋白质功能时有效降低基因表达的最佳方法。
Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂	Invitrogen	13778075	Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂为 siRNA 递送提供了先进且高效的解决方案。在多种细胞系中，包括常见细胞类型、干细胞和原代细胞，以及传统上难以转染的细胞类型，尚无其他针对 siRNA 的转染试剂能够实现如此简便高效的 siRNA 递送。
小鼠抗 IQGAP1	Invitrigen	33-8900	工作浓度：5% 脱脂牛奶溶液中按1:400稀释
山羊抗小鼠 IgG-HRP：sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	工作浓度：1:10000，溶于5%脱脂牛奶溶液中
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	这是一种丝氨酸蛋白酶和乙酰胆碱酯酶的抑制剂
用于RT-PCR的热循环仪	MJ Research	MJ Research PTC-200 热循环仪	它可实现温度均匀性以及最高达3的升降温速率°C/秒。该方案也可使用其他热循环仪进行
实时荧光定量RT-PCR仪	应用生物系统公司	7500 RT-PCR 系统	这是一个五色荧光平台，采用基于荧光的聚合酶链式反应（PCR）试剂，通过比较C值实现相对定量T 检测类型。该方案也可使用其他热循环仪进行。
微量分光光度计	赛默飞世尔科技	Nanodrop	它利用少量样本即可实现对核酸的准确、快速测定
印迹系统	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo 系统	它可在几分钟内完成半干转印
图像采集系统与凝胶成像记录	伯乐（Bio-Rad）	Chemidoc 图像系统	化学发光检测易于使用