本方案描述了一种小型即用型卡盒的制备方法，该卡盒可用于单次检测中对多种核酸进行可视化检测，操作简便。该方法采用毛细管阵列，实现对转基因目标物的多重、高效检测。
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摘要
摘要
在疾病诊断、微生物监测、转基因生物（GMO）检测以及法医学分析中，迫切需要一种能够在单次操作简便的检测中实现多靶标、快速且成本可控的多种核酸检测方法。我们此前已报道了一种名为CALM（Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids，基于毛细管阵列的环介导等温扩增用于多重可视化核酸检测）的技术平台。本文中，我们描述了该平台在制备工艺和性能方面的优化改进。本研究采用一种小型、即用型检测盒，通过毛细管阵列组装实现多种核酸的可视化多重检测。在将环介导等温扩增（LAMP）引物组固定于各毛细管之前，毛细管阵列已预先处理形成疏水与亲水交替的图案。加载适配器组装完成后，仅需一次移液操作，利用毛细作用力即可将LAMP反应混合液自动分配并隔离至各个毛细管中。LAMP扩增反应在各毛细管中并行进行，结果可通过手持式紫外手电筒照射后肉眼观察判读。利用该平台，我们成功实现了对转基因样品中8种常见元件和基因的高特异性与高灵敏度检测。综上所述，本文所述平台旨在促进多种核酸的联合检测，我们相信其将在需要高通量核酸分析的诸多领域获得广泛应用。
引言
在临床诊断1,2,3、转基因检测4,5,6、微生物监测7,8,9、法医学分析10,11以及资源通常有限的现场检测（POCTs）12,13,14等广泛领域中，亟需低成本、快速且易于使用的多核酸同步检测系统。
聚合酶链式反应（PCR）及其衍生方法，如实时PCR和多重PCR，是这些领域中最常用的检测技术。然而，这些方法通常一次检测只能检测一个目标15，且需要电力供应和复杂的专业设备。
另一种用于检测核酸的有前景技术是环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP），该技术于2000年首次被报道16。LAMP是一种高效率的DNA检测方法。理论上，它可在一小时内将模板从1个拷贝扩增至109个拷贝，整个过程在恒定温度下进行（即，60–65 °C之间）。成功的扩增会产生大量不溶性副产物焦磷酸盐，导致浊度发生变化17，这种变化可直接通过肉眼观察。通过添加金属离子或荧光染料（如Calcein18、核酸染料19和羟基萘酚蓝20），也可观察到颜色变化。由于具有高灵敏度和操作简便等优势，LAMP正被广泛应用于核酸检测中。
目前，多重LAMP检测主要有两种策略。一种是在同一反应管中加入多组LAMP引物，同时进行多个LAMP反应21,22,23。然而，由于不同引物组之间存在内在的干扰和竞争，该方法的检测多重性和扩增效率会受到限制。此外，在同一反应中区分不同的LAMP产物也可能存在困难。另一种策略基于物理隔离，即将不同的引物组分隔到独立的微型反应单元中，从而实现多个LAMP反应的并行进行24,25。这类方法通常基于微流控芯片技术，为高通量LAMP反应提供了潜在解决方案。然而，芯片的制造以及多组引物的多重预包被过程较为复杂，可能增加成本并降低实验的可重复性。
最近，一些研究描述了在毛细管中进行LAMP反应，以避免微流控芯片复杂的制备过程，并实现了低成本检测26,27。然而，在高通量分析方面，这些毛细管类似于微型化的PCR条状管，因为样品和反应试剂（包括不同的引物组）必须分别制备并输送至毛细管内的不同反应单元。为了实现并行和多重分析，需要额外的设备，例如多通道注射泵，以实现样品或试剂的并行加样。
为了克服现有核酸多重检测方法的局限性，我们开发了一种微型化平台，该平台将可视化LAMP技术与毛细管阵列相结合。该平台具有多靶标检测能力、体积小巧、成本低廉且操作简便28。本文详细描述了毛细管阵列的制备方法以及在阵列中进行LAMP反应的操作步骤。本方案以转基因生物（GMO）检测为模型已实现标准化。重要的是，该方案还可用于其他核酸靶标的高通量检测。
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方案
注意：本方案假设用于形成所需微通道形状的不锈钢模具和加载适配器已经制备完成（3D 文件作为补充文件1和补充文件2提供）。本方案还假设植物DNA的提取工作已经完成。
1. 基于毛细管阵列的即用型卡盒的制备
- 清洁不锈钢模具。
- 用洗涤剂、乙醇和去离子水清洗不锈钢模具，以去除潜在污染物。用氮气吹干模具。
- 清洗毛细管
- 佩戴安全护目镜、实验服和化学防护手套。
- 将毛细管放入烧杯中，用30 mL丙酮清洗5分钟以去除有机物，然后用去离子水冲洗毛细管。
注意：应在通风橱中操作丙酮。 - 加入10 mL H2O2 烧杯中，然后加入 30 mL 的 H2SO4 进入 H2O2 缓慢振荡以防止过热。确保溶液（piranha溶液）完全覆盖毛细管至少30分钟。
注意：操作芬太尼溶液（H2SO4/2O2 3:1，v/v. 若皮拉尼亚溶液洒出，应立即用大量水冲洗，并用纸巾擦拭表面。
注意：毛细管的彻底清洗是确保LAMP反应成功的关键步骤之一。清洗过程中需摇动酸缸以去除毛细管中的气泡，必要时可延长清洗时间。 - 用大量水冲洗掉piranha溶液。分别用乙醇和去离子水冲洗毛细管，每次5分钟。将毛细管置于干燥烘箱中干燥。
- 倒入聚二甲基硅氧烷（PDMS）
- 在50 mL离心管中按1:1比例称取PDMS基础剂与固化剂。通常混合5 g弹性体基础剂与5 g弹性体固化剂。
- 用玻璃棒将混合物充分搅拌约5分钟。将含有PDMS的试管置于真空干燥器中脱气30分钟。
- 将PDMS缓慢倒入不锈钢模具的圆柱形腔中。将PDMS置于干燥烘箱中，在80 °C下固化3 h。 60 °C
注意：倾倒PDMS时需小心避免产生气泡。倾倒完成后，静置5分钟，使PDMS中的气泡自然消除。
- 从PDMS上移除模具
- PDMS 固化后，通过拔出圆柱形模具来脱模。用手术刀切割模具边缘，将 PDMS 从圆柱体上剥离。
- 用乙醇和去离子水将聚二甲基硅氧烷（PDMS）清洗三遍。用氮气将PDMS支架吹干。
- 将PDMS支撑材料的下表面处理为疏水性。将PDMS支撑材料浸入超疏水涂层中1秒，室温下干燥10分钟。
- 将毛细管插入PDMS支撑中
- 将清洗后的4 mm毛细管插入PDMS支撑板的孔中，使毛细管有0.5 mm部分露出PDMS支撑板的上表面。确保毛细管末端处于同一水平面。
- 将毛细管的外表面和PDMS支撑物的顶面处理为疏水性。
- 添加 15 µL 在PDMS支撑体的顶面涂覆超疏水涂层。注意，由于毛细作用力，涂层会立即扩散至整个顶面（包括PDMS支撑体的顶面以及毛细管暴露部分的外表面）。
- 将超疏水改性的毛细管阵列空气干燥。
- 将引物固定到毛细管阵列中
- 配制引物溶液。称取0.65 g壳聚糖（分子式：(C6H11一氧化氮4)n）并用醋酸调节pH至4.5–5.5，将壳聚糖溶解于50 mL去离子水中，使其浓度达到1.3%。按如下方法配制引物组分混合液： 表1。参见 补充表1 引物
- 添加 1.6 µL 按照预先设计的顺序，将一组引物混合物加入毛细管阵列中对应的毛细管内。
注意：剩余的两根空白毛细管设为阴性对照。 - 将芯片固定在标准平底96孔板的透明孔中，并将芯片干燥 60 °C 至少 2 小时。
| LAMP 引物固定混合液组分（初始浓度） | 体积 (μL) |
| ddH2O | 17.0 |
| 壳聚糖 (1.3%) | 1.0 |
| FIP/BIP 引物 (20 μM) | 2.0/2.0 |
| LoopF/LoopB 引物 (20 μM) | 1.0/1.0 |
| F3/B3 引物 (20 μM) | 0.5/0.5 |
| 总体积 | 25.0 |
表1：LAMP引物固定试剂的组分。 表格左列列出了LAMP引物固定反应液的各组分，右列列出了每种组分的体积。
- 按如下步骤组装卡盒：将一个上样适配器安装到固定阵列的顶部，确保适配器的凹面完全覆盖所有十根毛细管的暴露部分（见图1）。
图1：样品盒的制造与组装。（a）不锈钢模具及PDMS支撑体。模具由三部分组成：圆筒、挡板和柱板。（b）PDMS支撑体制作及毛细管样品盒组装示意图。整个过程包含5个步骤：1. 浇注PDMS，2. 脱模，3. 插入毛细管并进行表面涂层，4. 引物固定，5. 样品盒锚定。1. 将PDMS倒入模具的圆筒中；2. 推出挡板，将模具从PDMS支撑体上取下；3. 涂覆PDMS支撑体的下表面，然后将毛细管插入PDMS支撑体中，最后涂覆PDMS支撑体的上表面及暴露的毛细管。粗蓝色线条表示超疏水涂层；4. 将引物组加载至各毛细管中；5. 将毛细管阵列固定在一个96孔板中，并在其上安装样品加载适配器。具体细节已在实验方案步骤1.1–1.9中描述。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 在毛细管阵列中进行LAMP反应
- 准备反应混合液
- 按照表2配制LAMP反应混合液。
- 根据表2中指定的顺序将试剂加入混合液中，在加入钙黄绿素后涡旋振荡反应混合液5秒。Bst聚合酶加入后，轻轻倒置离心管20次。
| LAMP 组分 （初始浓度） | 体积 (μL) |
| ddH2O | 11.6 |
| MgSO4 (100 mM) | 2.0 |
| dNTPs (25 mM) | 1.4 |
| 甜菜碱 (5 M) | 4.0 |
| 缓冲液 (10x) | 2.5 |
| 钙黄绿素 (1.25 mM) | 0.5 |
| MnCl2 (25 mM) | 0.5 |
| Bst 聚合酶 (8 U/μL) | 1.5 |
| 植物 DNA (10 ng/μL) | 1.0 |
| 总体积 | 25.0 |
表2：毛细管阵列LAMP的反应体系。 左侧列出了毛细管阵列LAMP反应体系的组分，右侧列出了各组分的体积。
- 加入试剂并密封反应卡盒
- 使用标准的 100 µL 吸头吸取 20 µL LAMP 反应混合液。将吸头插入加样适配器的入口并锁定。轻柔地将反应混合液注入适配器的储液盘中；反应混合液将迅速充满储液盘，并通过毛细作用自动填充至毛细管中。
- 取下带有锁定吸头的适配器，使用适用于 PCR 的透明密封膜密封反应孔。
注意：只有与亲水性储液盘中的反应混合液接触的毛细管才能被填充。因此，请确保所有毛细管的顶端处于同一高度（见 图 2）。
图2：使用加样适配器的样品加样示意图。 图中以蓝色溶液为例展示加样过程。将移液枪头插入入口，缓慢将样品注入适配器中，然后连同已锁定的枪头一起移除适配器。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 将毛细管阵列置于63 °C的培养箱中孵育1小时。
3. 结果读取与数据分析
- 获取荧光发射图像。
- 将紫外滤光片固定在小型手持式紫外LED手电筒的顶部表面，以滤除可见光。
- 使用紫外手电筒激发解离的钙黄绿素产生荧光。通过数码相机或智能手机从毛细管阵列顶部拍摄图像。
- 拍摄图像时，应尽可能将相机对准毛细管区域并放大，以获得高质量、清晰的图像。
- 分析结果
- 使用图像分析软件打开图像，然后选择“图像>模式>灰度>是”和“图像>模式>16位>是”。选择“文件>另存为>格式>TIFF”，将图像转换为16位TIFF格式。
- 提取荧光强度值
- 打开微阵列分析软件。将16位TIFF格式的图像拖入软件界面，然后选择波长为“532 nm”、颜色为“绿色”来显示图像。
- 创建一个新的区块以定位毛细管中的荧光信号。选择“工具>新建区块”，并在“区块”和“特征”界面中分别输入列数和行数为“1;1”和“2;5”。
- 右键点击并选择“特征”模式，然后调整位置和直径以匹配毛细管的荧光区域。选择“分析”以提取荧光强度值。
- 选择“文件>保存设置为”以保存区块文件，并选择“文件>保存结果为”以保存荧光强度结果。计算信噪比（SNR），以判断毛细管中是否成功完成LAMP反应。
注意：通过记录斑点的灰度值获得毛细管信号，信噪比（SNR）定义为目标前景信号平均值与两个阴性对照前景信号平均值之比。确定阳性信号的阈值设定为SNR >2。
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结果
在该方法中，样品加载过程中防止不同毛细管之间的交叉污染至关重要。为此引入了壳聚糖，其可将引物保留在各个毛细管内。为验证该方法是否有效，我们预先将ADH1（玉米内源性参考基因）引物组以“T”和“U”图案固定在毛细管盒中，如 图3a 所示。结果正如预期，仅有含有引物组的毛细管显示出阳性信号（图3b）。
图 3：毛细管检测结果示例。
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讨论
本文展示的CALM平台将LAMP技术与毛细管阵列相结合，可在单次检测中同时鉴定多个与转基因生物相关的基因靶标，该检测方法高效且操作简便。
为了在卡盒中成功进行多重 LAMP 反应，需要注意三个关键点。首先，确保毛细管上端的高度一致，以及毛细管阵列的亲水与疏水图案设计，是实现所有毛细管同时加载试剂的关键。在将毛细管初步插入 PDMS 支撑层后，应使用一块平板对齐毛细管，以确保所有毛细管均能接触到加样适配器凹槽中的反应混合液。在对毛细管阵列进行超疏水涂层处理时，切勿让涂层渗入毛细管内表面。仅需将涂层施加于顶层 PDMS 支撑层的上表面，使涂层自然扩散至毛细管上部的外表面即可。如果偶尔出现并非所有毛细管都被试剂填充的情况，可考虑直接向特定毛细管中加载试剂。
其次，需注意LAMP试剂的配制。由于LAMP反应温度相对较低，且Bst DNA聚合酶较为脆弱，整个配制过程应在冰上轻柔、快速地进行。在加入Bst聚合酶后，建议轻轻振荡反应管以混匀LAMP反应体系，避免剧烈涡旋。操作不当可能导致反应失败。本实验中...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究部分得到了中国国家自然科学基金（31370813、3147670、31670831 和 31600672）、国家转基因植物专项基金（2016ZX08012-003、2016ZX08012-005）、新世纪优秀人才支持计划、中国国家重点研发计划（2016YFA0500601）以及中国博士后科学基金（2016M591667）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| UltraEverDry（超疏水涂层） | UltraTech | 4001 | 供应商：Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | 道康宁（Dow Corning） | 8332557 | |
| Bst DNA聚合酶 | 新英格兰生物实验室（New England BioLabs） | M0275L | |
| 甜菜碱（betain） | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| 钙黄绿素（calcein） | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | 新英格兰生物实验室（New England BioLabs） | B1003S | |
| 脱氧核苷三磷酸混合物（dNTPs） | 上海生工（Shanghai Sangon） | B804BA0022 | |
| 壳聚糖（chitosan） | 上海生工（Shanghai Sangon） | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 软件 | Adobe Systems Inc., CA, USA | 图像分析 | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | 微阵列分析软件 | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 三维建模软件 | |
| 紫外滤光片（ZWB2） | YXSensing | 供应商：淘宝（taobao） |
参考文献
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