本方案描述了一种小型即用型卡盒的制备方法，该卡盒可用于单次检测中对多种核酸进行可视化检测，操作简便。该方法采用毛细管阵列，实现对转基因目标物的多重、高效检测。
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本文内容
摘要
摘要
在疾病诊断、微生物监测、转基因生物（GMO）检测以及法医学分析中，迫切需要一种能够在单次操作简便的检测中实现多靶标、快速且成本可控的多种核酸检测方法。我们此前已报道了一种名为CALM（Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids，基于毛细管阵列的环介导等温扩增用于多重可视化核酸检测）的技术平台。本文中，我们描述了该平台在制备工艺和性能方面的优化改进。本研究采用一种小型、即用型检测盒，通过毛细管阵列组装实现多种核酸的可视化多重检测。在将环介导等温扩增（LAMP）引物组固定于各毛细管之前，毛细管阵列已预先处理形成疏水与亲水交替的图案。加载适配器组装完成后，仅需一次移液操作，利用毛细作用力即可将LAMP反应混合液自动分配并隔离至各个毛细管中。LAMP扩增反应在各毛细管中并行进行，结果可通过手持式紫外手电筒照射后肉眼观察判读。利用该平台，我们成功实现了对转基因样品中8种常见元件和基因的高特异性与高灵敏度检测。综上所述，本文所述平台旨在促进多种核酸的联合检测，我们相信其将在需要高通量核酸分析的诸多领域获得广泛应用。
引言
在临床诊断1,2,3、转基因检测4,5,6、微生物监测7,8,9、法医学分析10,11以及资源通常有限的现场检测（POCTs）12,13,14等广泛领域中，亟需低成本、快速且易于使用的多核酸同步检测系统。
聚合酶链式反应（PCR）及其衍生方法，如实时PCR和多重PCR，是这些领域中最常用的检测技术。然而，这些方法通常一次检测只能检测一个目标15，且需要电力供应和复杂的专业设备....
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方案
注意：本方案假设用于形成所需微通道形状的不锈钢模具和加载适配器已经制备完成（3D 文件作为补充文件1和补充文件2提供）。本方案还假设植物DNA的提取工作已经完成。
1. 基于毛细管阵列的即用型卡盒的制备
- 清洁不锈钢模具。
- 用洗涤剂、乙醇和去离子水清洗不锈钢模具，以去除潜在污染物。用氮气吹干模具。
- 清洗毛细管
- 佩戴安全护目镜、实验服和化学防护手套。
- 将毛细管放入烧杯中，用30 mL丙酮清洗5分钟以去除有机物，然后用去离子水冲洗毛细管。
注意：应在通风橱中操作丙酮。 - 加入10 mL H2O2 烧杯中，然后加入 30 mL 的 H2SO4 进入 H2O2 缓慢振荡以防止过热。确保溶液（piranha溶液）完全覆盖毛细管至少30分钟。
注意：操作芬太尼溶液（H2SO4/2O2 3:1，v/v. 若皮拉尼亚溶液洒出，应立即用大量水....
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结果
在该方法中，样品加载过程中防止不同毛细管之间的交叉污染至关重要。为此引入了壳聚糖，其可将引物保留在各个毛细管内。为验证该方法是否有效，我们预先将ADH1（玉米内源性参考基因）引物组以“T”和“U”图案固定在毛细管盒中，如 图3a 所示。结果与预期一致，仅有含有引物组的毛细管显示出阳性信号（图3b）。
图 3：毛细管检测结果示例。
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讨论
本文展示的CALM平台将LAMP技术与毛细管阵列相结合，可在单次检测中同时鉴定多个与转基因生物相关的基因靶标，该检测方法高效且操作简便。
为了在卡盒中成功进行多重 LAMP 反应，需要注意三个关键点。首先，确保毛细管上端的高度一致，以及毛细管阵列的亲水与疏水图案设计，是实现所有毛细管同时加载试剂的关键。在将毛细管初步插入 PDMS 支撑层后，应使用一块平板对齐毛细管，以确保所有毛细管均能接触到加样适配器凹槽中的反应混合液。在对毛细管阵列进行超疏水涂层处理时，切勿让涂层渗入毛细管内表面。仅需将涂层施加于顶层 PDMS 支撑层的上表面，使涂层自然扩散至毛细管上部的外表面即可。如果偶尔出现并非所有毛细管都被试剂填充的情况，可考虑直接向特定毛细管中加载试剂。
其次，需注意LAMP试剂的配制。由于LAMP反应温度相对较低，且Bst DNA聚合酶较为脆弱，整个配制过程应在冰上轻柔、快速地进行。在加入Bst聚合酶后，建议轻轻振荡反应管以混匀LAMP反应体系，避免剧烈涡旋。操作不当可能导致反应失败。本实验中.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究部分得到了中国国家自然科学基金（31370813、3147670、31670831 和 31600672）、国家转基因植物专项基金（2016ZX08012-003、2016ZX08012-005）、新世纪优秀人才支持计划、中国国家重点研发计划（2016YFA0500601）以及中国博士后科学基金（2016M591667）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| UltraEverDry（超疏水涂层） | UltraTech | 4001 | 供应商：Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | 道康宁（Dow Corning） | 8332557 | |
| Bst DNA聚合酶 | 新英格兰生物实验室（New England BioLabs） | M0275L | |
| 甜菜碱（betain） | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| 钙黄绿素（calcein） | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | 新英格兰生物实验室（New England BioLabs） | B1003S | |
| 脱氧核苷三磷酸混合物（dNTPs） | 上海生工（Shanghai Sangon） | B804BA0022 | |
| 壳聚糖（chitosan） | 上海生工（Shanghai Sangon） | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 软件 | Adobe Systems Inc., CA, USA | 图像分析 | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | 微阵列分析软件 | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 三维建模软件 | |
| 紫外滤光片（ZWB2） | YXSensing | 供应商：淘宝（taobao） |
参考文献
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, Suppl 1. 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Opota, O., Jaton,....
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