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使用 DMAV 制备用于环境应用的 DMMTAV 和 DMDTAV：合成、纯化与验证

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DOI：

10.3791/56603

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2018年3月9日

 ,  ,  , 
1Korea Basic Science Institute, Seoul Center, 2Natural Science Research Institute, Yonsei University

本文内容

摘要

本文介绍了二甲基单硫代砷酸（DMMTAV）和二甲基二硫代砷酸（DMDTAV）合成的改进实验方案，通过将二甲基砷酸（DMAV）、Na2S 和 H2SO4 混合，实现 DMAV 的硫醇化反应。该改进方案提供了实验操作指南，从而克服了原有合成步骤中的局限性，避免了可能在定量分析中导致实验失败的问题。

摘要

二甲基硫代砷化合物，如一硫代二甲基砷酸（DMMTAV）和二硫代二甲基砷酸（DMDTAV），是二甲基砷酸（DMAV）经硫醇化代谢途径产生的产物，近年来在环境及人体器官中均被检出。通过定量分析DMMTAV和DMDTAV，可评估二甲基硫代砷化合物对生态环境的影响及其在环境介质中的稳定性。目前，这些化合物的合成方法尚未标准化，导致先前研究难以重复。此外，关于储存技术的信息也十分缺乏，尤其是如何在储存过程中避免物种转化的问题。同时，由于现有合成方法的相关信息极为有限，标准化学品的合成及定量分析在实验上可能存在困难。本文所提出的实验方案提供了一种经过实际优化的DMMTAV和DMDTAV合成方法，有助于利用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术（HPLC-ICP-MS）进行物种分离与定量分析。该方法在实验步骤上进行了改进，重点优化了化学试剂的配制、过滤方式以及储存条件。

引言

由于二甲基亚砷酸（DMAV已证明，该物质在摄入后会经历甲基化和硫醇化反应，从而表现出急性毒性和基因毒性。1,2，砷的硫醇化代谢途径已得到深入研究 体外 和 体内3,4 以及在环境介质中（例如， 垃圾填埋场渗滤液5,6先前的研究已发现DMA的还原型和巯基化类似物V 在活细胞中，例如, 二甲基亚胂酸（DMA）III），二甲基单硫代砷酸（DMMTAV），以及二甲基二硫代砷酸（DMDTA）V)7,8,9，与二甲基硫代砷酸盐（如 DMMTA）V 其毒性高于其他已知的无机或有机砷化合物10高毒性的硫代砷化物在强硫化条件下可能对人类和环境构成威胁，因此其大量存在具有严重的环境影响。11。然而，DMMTA 的机制V 和 DMDTAV （转）化过程及其在环境介质中的归趋仍需进一步研究。因此，需要对硫代砷化合物进行定量分析，以增进对二甲基单硫代砷酸（DMMTA）环境效应的理解。V 和 DMDTAV.

尽管标准品化学品是定量分析的关键要求，但DMMTA的标准品V 和 DMDTAV 由于物种极易转化为其他物种且合成工艺缺乏标准化，通过重复先前研究来获得这些物质十分困难。12此外，所引用的方法存在局限性，可能导致标准化学品的合成及定量分析在实际操作中遇到困难。DMMTAV 和 DMDTAV 通常通过混合DMA制备V，Na2S 和 H2SO4 在一定的摩尔比下1 或气泡产生 H2S气体通入DMA溶液第13,14卷. 气泡法的特点是通过直接供应H₂S实现氧被硫的取代2S气体具有高毒性，对于缺乏经验的操作者而言难以控制。相比之下，上述混合方法1，广泛用于DMMTA的定性分析V 和 DMDTAV 在环境研究中5,6,12，包含DMA的硫醇化反应V 与 H2S 通过混合 Na 生成2S 和 H2SO4 并生成 DMMTAV 和 DMDTAV，与直接使用 H 相比，可更方便地实现化学计量控制，从而生成目标化学品2S气体。

参考混合法操作步骤1,3,4,8,15 本研究中提到的方法在某些关键实验步骤上存在局限性，可能导致实验失败。例如，特定溶剂的详细信息（即， 去离子水的制备以及合成硫砷化合物的提取与结晶过程描述过于简略或未提供足够细节。这些零散且有限的实验步骤信息可能导致硫砷化合物生成不一致，并影响定量分析的可靠性。因此，本文所改进的实验方案详细描述了二甲基单硫代砷酸（DMMTA）的合成方法V 和 DMDTAV 定量物种分离分析用储备溶液。

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方案

1. DMMTAV的合成

  1. 化学试剂的准备与DMA的摩尔比混合五，Na2S，和 H2SO4
    注：DMAV：Na2S:H2SO4 = 1:1.6:1.6
    1. 将 5.24 g DMA 溶解V 在40 mL去离子水和N2-在50 mL离心管中，用已通惰性气体吹扫（吹扫至少30分钟）的水。
    2. 准备 Na2S试剂通过将14.41 g Na溶解于2S·9H2O，加入50 mL去离子水和N2-在250 mL烧瓶中的脱气水中。
    3. 配制 H2SO4 试剂，将3.3 mL浓硫酸（96%）加入40 mL去离子水和N2在50 mL离心管中加入已通入惰性气体除氧的水。
      注意：DMA 的最终摩尔比V：Na2S:H2SO4 = 1:1.6:1.6 1,3,4,8,15.
    4. 加入已准备好的 40 mL DMAV 溶液（步骤 1.1.1）加入 50 mL Na2S溶液转移至250 mL锥形瓶中（步骤1.1.2）。冲洗盛有DMA的试管五 用10 mL脱气水冲洗，并将此液体一并加入250 mL烧瓶中。
    5. 用带有玻璃管的三孔橡胶塞塞住烧瓶。将玻璃管用于 N2 气体流入、流出和 H2SO4 溶液入口。关闭烧瓶后立即通入 N2 气体通入烧瓶中。
      注意：应保持气体压力，使气体在反应溶液表面流动，避免溅出。
    6. 将耐酸软管连接至H的玻璃管上2SO4 使用50 mL注射器通过溶液入口加入已配制的40 mL H2SO4 溶液（步骤 1.1.3）。加入 40 mL H2SO4 溶液，缓慢且分步地进行。
      注意： 加入硫酸后会产生白色烟雾；请在通风良好的通风橱中操作。
    7. 在滴加硫酸时，定期观察烧瓶中反应混合物的颜色变化。每次滴加间隔保持在 4 - 5 mL。2SO4；混合液应呈白色浑浊溶液。
      注意：由于浓硫酸的快速加入，可能会立即出现黄色沉淀。
    8. 确保反应溶液自步骤1.1.4开始以来已静置1小时。
  2. DMMTAV 采用液-液萃取法进行提取
    1. 反应1小时后，将反应溶液倒入含有约200 mL乙醚的分液漏斗中。
    2. 振荡分液漏斗5至10分钟，通过切换活塞多次释放气体。
      注意：合成的 DMMTA五 将转移至二乙醚上层（0.713 g）·mL-1).
      注意： 乙醚气体可能有害；请使用通风良好的通风橱。
    3. 将反应溶液收集至烧杯中，并分别收集含有DMMTA的二乙醚V 在瓶中。将反应液倒回同一分液漏斗中，加入约200 mL新鲜乙醚重新振荡。重复步骤1.2.2–1.2.3三次。
    4. 将步骤 1.2.3 中收集的乙醚再次倒入同一分液漏斗中，并加入约 100 mL N2- 去除氧气的去离子水。振荡 5 - 10 分钟，弃去 N2-排尽的去离子水和少量几毫升乙醚用于纯度检测。将剩余的乙醚收集于玻璃培养皿中（内径不小于160 mm，高度不低于50 mm）。
    5. 将玻璃培养皿转移至氮气2 在防止物种转化的气氛手套箱中
      注意： 确保溶剂不会通过传递箱的出口被吸入真空泵中。
    6. 干燥至出现二甲基单硫代亚砷酸盐白色沉淀（结晶状 DMMTA）V在玻璃培养皿上形成。
      注意：此处可暂停本实验方案。
  3. 合成DMMTAV的验证V 和储存
    1. 取结晶的DMMTA白色沉淀V，并测量和记录其总重量。
      注意： 使用通风良好的通风橱或手套箱，以防止吸入硫化氢气体。
    2. 溶解结晶的 DMMTA五 在 50 mL 的 N2-排尽的去离子水，并通过0.2-µm 注射器滤器
    3. 假设所用 DMA 的总 As五 转化为 DMMTAV, 即≈9,649 mg As·L-1. 稀释 DMMTAV 储备溶液至 ≈1 毫克·L-1 和 ≈40 µg·L-1 用于电喷雾电离质谱法（ESI-MS）和高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS）的验证分析。
    4. 分析 m/z DMMTA的V 使用 ESI-MS11,16 和碎片在 m/z 155 在正离子模式下或在 m/z 负离子模式下的153表1).
      注：参见参考值 m/z (表1).
    5. 分析 DMMTA 的色谱图V 使用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS）对储备溶液进行分析11,16,17 在适当的洗脱条件下进行，并确认在文献所述的保留时间处出现主峰。
      注意：合成的 DMMTA 纯度V 应使用步骤 1.3.5 的分析结果进行计算。
    6. 经酸消解后，采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）分析总砷浓度11 并计算真实的 DMMTAV 合成 DMMTAV 的浓度V 使用稀释倍数和纯度计算储备液，如以下公式所示：
      分析的总砷浓度（As）µg·L-1) · 稀释倍数 · 纯度（%）= 真实 DMMTAV DMMTA中的浓度五 储备溶液µg·L-1)
    7. 储存 DMMTAV 4 ℃保存的储备液 °避光，4 °C 保存，用于后续定量形态分析18.

2. DMDTAV的合成

  1. DMA的化学试剂准备与摩尔比混合V ，Na2S 和 H2SO4
    注意：DMAV钠2S:H2SO4 = 1:7.5:7.5
    1. 溶解 1.38 g DMAV 在50 mL离心管中加入40 mL去离子水。
    2. 准备 Na2S试剂通过溶解18.01 g Na2S·9H2在250 mL锥形瓶中加入50 mL去离子水。
    3. 配制 H2SO4 将4 mL浓硫酸（96%）加入盛有40 mL去离子水的50 mL离心管中，配制试剂。
      注意：DMA的最终摩尔比V：Na2S:H2SO4 = 1:7.5:7.51,3,4,8,15.
    4. 加入已准备好的40 mL DMA五 溶液（步骤 2.1.1）至 50 mL Na2S溶液置于250 mL烧瓶中（步骤2.1.2）。冲洗含有DMA的试管五 用10 mL去离子水冲洗，并将此液体一并加入250 mL烧瓶中。
    5. 加入已准备好的 40 mL H2SO4 溶液（步骤 2.1.3），缓慢且分步地加入烧瓶中。
    6. 在定期滴加硫酸时，观察烧瓶中反应混合物的颜色变化。每次滴加间隔保持4 - 5 mL。2SO4混合物应呈白色/黄色浑浊溶液。
      注意：由于浓硫酸的快速加入，可能会立即出现黄色沉淀。
      注意： 加入硫酸时会产生白色烟雾，需在通风良好的通风橱中操作。
    7. 将反应液在烧瓶中避光过夜，不加盖。
      注意：此处可暂停本实验方案。
  2. DMDTAV 采用固相萃取（SPE）方法进行提取
    1. 过夜反应后，使用C18型硅胶基固相萃取柱（SPE）过滤反应溶液，以截留合成的DMDTAV 在树脂上。
      注意： 使用通风良好的通风橱。
    2. 将0.77 g乙酸铵溶解于1 L去离子水中，配制10 mM乙酸铵溶液（pH 6.3）。用该10 mM乙酸铵溶液充分冲洗C18注射器（步骤2.2.1），以洗脱吸附的DMDTA五将过滤后的乙酸铵收集至玻璃培养皿中（内径至少160 mm，高度至少50 mm）。
    3. 将玻璃培养皿转移至 N2 在防止物种转化的气氛手套箱中
      注意： 确保溶剂不会通过传递箱的出口被吸入真空泵中。
    4. 干燥至形成白色二甲基二硫代砷酸盐沉淀（结晶状 DMDTA）V)置于玻璃培养皿中。
      注意：本实验步骤可在此暂停。
  3. 合成DMDTA的验证V 和储存
    1. 取结晶的白色DMDTA沉淀V，并测量其总重量，记录测量值。
      注意： 使用通风良好的通风橱或手套箱，以防止吸入硫化氢气体。
    2. 溶解结晶的 DMDTA五 在50 mL的N2-在50 mL离心管中使用已通惰性气体除氧的去离子水，并通过0.2-µm 注射器滤器
    3. 假设所用DMA的总砷（As）量五 转化为DMDTAV, 即≈2,539 mg As·L-1. 稀释 DMDTAV 储备溶液至 ≈1 毫克·L-1 和 ≈40 µ克·L-1 分别用于ESI-MS和HPLC-ICP-MS的验证分析。
    4. 分析 m/z DMDTA的V 使用 ESI-MS11,16 和碎片在 m/z 171 在正离子模式下或在 m/z 负离子模式下的169表1).
      注：参见参考值 m/z (表1).
    5. 分析 DMDTA 的色谱图五 使用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS）对储备溶液进行分析11,16,17 在适当的洗脱条件下进行，并确认在文献所述的保留时间处出现色谱峰。
      注意：合成的 DMDTA 的纯度V 应使用步骤 2.3.5 的分析结果进行计算。
    6. 经酸消解后，采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）分析总砷浓度11 并计算真实的DMDTAV 合成DMDTA中的浓度五 使用稀释倍数和纯度，按照以下公式配制储备溶液：
      分析的总砷浓度（µg·L-1) · 稀释倍数 · 纯度（%）= 真实 DMDTA五 DMDTA的浓度五 在储备液中（µg·L-1)
    7. 储存 DMDTAVV 4 ℃保存的储备液 °避光条件下，4 °C 保存，用于后续定量形态分析18.

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结果

自从DMMTAV 已被DMA错误地制备III 合成方法19，合成DMMTA的验证V 和 DMDTAV 是合成与提取过程中的关键步骤，用于确定理想的标准化学物质。合成的化学品可通过DMMTA的峰进行验证V （分子量 154 g·mol-1）和 DMDTAV （分子量 170 g·mol-1) 质荷比 (m/z) 通过实时进样，使用电喷雾电离质谱仪（ESI-MS）的正离子或负离子模式进行检测。参考值 m/z 列于 表119DMMTA成功合成的进一步验证V 和 DMDTAV 通过将主要峰的保留时间（RT）的物种分离分析结果与参考数据进行比对，采用HPLC-ICP-MS完成。

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讨论

所开发的实验方案阐明了以往研究中未明确的关键步骤1,3,4,8,15 省略或缩写，这可能导致DMMTA过程中出现困难或失败V 和 DMDTAV 合成。由于DMMTAV 对氧化敏感1,5，用于其合成的化学试剂采用N2- 使用已除气的去离子水（步骤 1.1.1 - 1.1.3），以防止可能延缓 DMA 的反应V 巯基化及DMMTA的氧化V. DMMTAV 采用本方案制备的样品纯度为92%。参考DMDTAV 采用基于二氧化硅的C18...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由韩国国家研究基金会（NRF）通过科学技术信息通信部资助的基础科学研究院项目（项目编号：2016R1A2B4013467）支持。 & 未来规划 2016，同时也得到韩国基础科学研究所研究项目（项目编号：C36707）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
二甲胂酸Sigma-Aldrich20835-10G-F
九水合硫化钠Sigma-AldrichS2006-500G
硫酸 96%J.T.Baker0000011478
乙酸铵Sigma-AldrichA7262-500G
甲酸 98%和光纯药工业株式会社066-00461
二乙醚（优级纯）Junsei Chemical33475-0380
60 mL Bond Elut 小柱用适配帽安捷伦科技12131004固相萃取用注射器型装置
Bond Elut C18 小柱安捷伦科技14256031固相萃取用注射器型装置
HyPURITY C-18赛默飞世尔科技22105-2546305 μm，125 × 4.6 mm
手套箱韩国春川定制化 
安捷伦 1260 Infinity 生物惰性液相色谱系统安捷伦科技DEAB600252, DEACH00245
安捷伦科技 7700 系列 ICP-MS安捷伦科技JP12031510
Finnigan LCQ Deca XP MAX 质谱系统Thermo Electron CorporationLDM10627

参考文献

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DMMTA DMDTA HPLC ICP MS

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