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改进的原代胶质细胞三维水凝胶培养方法 体外 神经炎症建模

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DOI：

10.3791/56615

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2017年12月8日

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1Department of Psychiatry, University of Alberta, 2Alberta Innovates-Health Solutions Interdisciplinary Team in Smart Neural Prostheses (Project SMART), University of Alberta, 3Department of Chemical and Materials Engineering, University of Alberta, 4Division of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Alberta, 5Centre for Neuroscience, University of Alberta

本文内容

摘要

本文介绍了一种大鼠脑源性胶质细胞（包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞）的三维培养方案。我们展示了原代细胞培养、甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）水凝胶的合成、HAMA光聚合与细胞包封，以及用于共聚焦显微镜和扫描电子显微镜成像的样品处理方法。

摘要

在中枢神经系统中，多种急性损伤和神经退行性疾病，以及旨在增强功能的植入装置或工程化生物材料，均会导致相同的结果：过度的炎症反应引发胶质增生、细胞毒性，和/或形成胶质瘢痕，从而共同加剧损伤或阻碍正常修复。为了建立一个用于模拟胶质瘢痕形成并研究炎症过程的系统，我们开发了一种三维细胞支架，可容纳原代培养的胶质细胞：包括调控异物反应并启动炎症事件的小胶质细胞、响应刺激形成纤维瘢痕的星形胶质细胞，以及通常对炎症性损伤敏感的少突胶质细胞。本研究提供了一种基于透明质酸的三维水凝胶支架的详细分步制备、培养及显微表征方法，其中封装了大鼠脑源性胶质细胞。此外，还展示了通过共聚焦免疫荧光和扫描电子显微镜对细胞包封效果及水凝胶支架进行表征的实验方案，并演示了通过引入商业化的基底膜混合物等生物活性底物对支架进行修饰，以改善细胞整合能力的方法。

引言

中枢神经系统（CNS）的炎症长期以来被认为是急性（例如，缺血性卒中、创伤性脑和脊髓损伤）和慢性（例如，阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病）CNS损伤的标志性特征，但目前越来越被认识到是神经退行性疾病和神经精神疾病发生的致病因素。持续或不适当的炎症可导致神经损伤和脱髓鞘（例如，多发性硬化症），并对大脑发育（例如，精神分裂症、自闭症）和情绪状态（例如，抑郁症、焦虑症、双相情感障碍）产生负面影响。此外，利用可植入设备（例如，脑机接口1,2,3、深部脑刺激4,5、脊髓内微刺激6,7,8,9,10）的新型治疗策略会在设备与中枢神经系统之间的界面处引发可预测的炎症反应，从而导致保护性组织反应，可能在植入物的整个使用寿命期间造成疗效下降或设备失效11。中枢神经系统中的炎症通常由小胶质细胞启动，小胶质细胞作为中枢神经系统内的常驻免疫细胞，负责组织监视并介导对异物的免疫反应（综述见12）。根据损伤的严重程度，小胶质细胞会向其他细胞类型发出信号并将其募集至损伤部位。具体而言，小胶质细胞激活星形胶质细胞，后者继而作为次要的炎症细胞，形成致密的保护性屏障以限制损伤区域13,14。小胶质细胞还可启动外周免疫系统细胞的活性级联反应，可能导致血脑屏障（BBB）破坏，从而允许免疫细胞浸润（参见文献15中的综述）。

对于植入中枢神经系统的装置而言，装置植入所导致的组织损伤以及异物装置的持续存在可能引发一种称为胶质瘢痕形成的过程。在此过程中，小胶质细胞迁移至损伤部位并在此增殖，同时启动炎性因子的释放，以中和潜在威胁并募集更多的胶质细胞。随后，活化的星形胶质细胞发生肥大，并开始包裹植入装置，形成连续的纤维性屏障16。炎性信号还会促使神经元突起从植入物周围回缩，并最终募集成纤维细胞以加强正在形成的胶质瘢痕17。负责以髓鞘包裹神经元以增强传导功能的少突胶质细胞无法在此过程中存活，且远处的细胞亦被瘢痕与植入物隔离开来18。胶质瘢痕显著降低了植入装置的功能和使用寿命，尤其是记录电极，最终限制了神经接口的正常功能19。

已有多种方法被用于提高中枢神经系统（CNS）植入装置的生物相容性及界面活性20,21,22,23。目前已有综述详细阐述了这些神经接口的生物相容性设计24。其中最显著的策略包括在电极周围包覆相容性涂层，如聚乙二醇（PEG）、聚乳酸-共-乙醇酸（PLGA）25，或通过导电聚合物（如聚（3,4-乙烯二氧噻吩）（PEDOT）和聚吡咯（PPy））对电极进行改性26,27,28,29,30,31。此外，还采用了具有生物活性的涂层，利用来源于细胞外基质（如胶原蛋白、纤连蛋白和透明质酸）的配体，为神经组织生长提供信号引导32,33,34,35,36,37。这些涂层的生物活性还进一步结合生长因子释放系统加以研究，以模拟细胞的自然分泌行为30,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50。同时，一些研究团队选择通过重塑电极的几何结构、柔韧性和组成，以减小装置与组织之间的力学性能失配51,52,53,54,55,56,57。总体而言，这些策略已推动下一代神经接口装置取得诸多令人瞩目的改进，然而长期相容性仍是持续存在的问题，且复杂的、耗时的in vivo模型可能阻碍进一步进展。

基于动物模型的方法可能会限制电极生物相容性测试的实验通量，并增加成本。体外实验方法虽采用常规细胞培养技术，成本较低，但难以重现器械与组织相互作用的诸多复杂性58。特别是，使用二维细胞培养测试表面涂层时，难以模拟电极的几何结构以及机械性能不匹配和微小运动所产生的影响，而这些因素被认为会引发宿主反应，进而导致器械失效59,60。

为克服二维细胞培养相关的问题，已开发出用于多种应用及药理学研究的神经细胞水凝胶培养方法61，以指导神经细胞分化62，以理解疾病通路63,64，或与其他细胞类型共培养以模拟细胞迁移、神经保护，或构建组织微环境模型61水凝胶可轻松制备成不同尺寸和几何形状，能够包载多种原代或永生化细胞培养物，并且非常适用于共聚焦荧光显微镜等常用技术进行分析。为了构建胶质瘢痕形成过程的模型，我们近期开发并表征了一种基于透明质酸的三维水凝胶系统，用于高通量检测胶质细胞对植入电极的反应图1)65该系统具有多个显著优势：1）原代胶质细胞（小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞）被包封于由透明质酸聚合物构成的三维基质中，透明质酸是内源性细胞外基质的组成成分；2）基质刚度可进行“调节”，以模拟脑或脊髓组织的力学特性；3）可通过台面式快速操作，利用绿光光聚合技术将细胞包封于基质中，从而在包封过程中最大限度降低细胞毒性。该系统可实现以下关键特性 体内 生物相容性：以与组织类似的方式将装置插入水凝胶中，并对植入装置的细胞反应在多种参数下进行监测65这些因素包括装置与各种结构的水凝胶涂层之间的机械性能不匹配，以及电刺激脉冲。该系统还包括少突胶质细胞及其相关前体细胞，这些细胞常存在于胶质瘢痕中并被募集。它们的损伤、死亡以及被小胶质细胞吞噬，是炎症性损伤的高度指示性标志；作为瘢痕减轻或功能恢复的模型，这些细胞能够展示神经元的再髓鞘化过程66.

本文介绍一种合成和制备杂交透明质酸水凝胶的方法，该方法结合市售基底膜制剂，以改善细胞包埋效果。此外，我们将展示原代培养的胶质细胞（小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞）的包埋过程，并利用免疫细胞化学染色和共聚焦显微镜对细胞培养生长情况进行分析。

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方案

该实验方案经阿尔伯塔大学动物护理与使用委员会批准，涉及通过断头法处死出生第1天的Sprague Dawley大鼠幼鼠并提取脑组织。

1. 小胶质细胞和星形胶质细胞的分离67,68

注意：所有用于分离和细胞培养的培养基均需在水浴中预热至 37 °C。Hank's 平衡盐溶液（HBSS）含有 1% 青霉素-链霉素（PS）。所有添加 Ham's F12 营养混合物的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM/F12）均补充有 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素（PS）。仅含胰蛋白酶的混合液不添加 FBS。本实验方案中的所有材料均为无菌（经过滤、酒精处理、购买时已灭菌或经高压灭菌），自步骤 1.8 之后的每一步均须在生物安全柜中采用无菌技术操作。

  1. 每个大脑组织，预先将15 mL HBSS和12.5 mL DMEM/F12在50 mL锥形离心管中加热至37 °C，并在15 mL锥形离心管中预热约2 mL含1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰蛋白酶。额外加热25 mL DMEM/F12。胰蛋白酶需提前约10分钟预热，以防止酶活性丧失。
  2. 将足量预热的HBSS倒入无菌的6 cm和10 cm培养皿中，以覆盖皿底表面。每两个大脑组织准备一个10 cm培养皿，并额外准备一个6 cm培养皿。
  3. 每个10 cm2培养皿中放置最多两个大脑组织（图2A）。
  4. 在解剖显微镜下，使用弯头和直头镊子沿中线分离大脑皮层，并分离小脑与脑干。每个大脑组织可获得三个组织部分（图2B）。
  5. 从每个组织部分上剥离含有血管的薄而半透明的组织层（脑膜），并弃去，将剩余组织转移至另一个培养皿中。用镊子夹住组织切面暴露出的薄层，小心拉扯，直至大部分组织“悬垂”于脑组织之外，最后轻轻拉拽将其完全去除。该步骤前、中、后的代表性图像见图2C-2E。
  6. 在生物安全柜中，移除培养皿中剩余的HBSS，小心保留组织。用手术刀将组织切碎，然后转移至预热的含胰蛋白酶的15 mL离心管中。
  7. 将该离心管置于37 °C水浴中孵育25分钟，以进行酶消化。
  8. 在室温下以500 × g离心2分钟，弃去上清液。
  9. 使用10 mL移液管加入10 mL预热的DMEM/F12以灭活胰蛋白酶，并吹打溶液5次以进一步分散组织。
  10. 在室温下以500 × g离心2分钟，弃去上清液。
  11. 使用10 mL移液管将沉淀重悬于10 mL预热的DMEM/F12中，并将悬液转移至50 mL锥形离心管中。
  12. 使用带18号针头的10 mL注射器吹打悬液3次。
  13. 将该悬液按每份12.5 mL DMEM/F12（每份对应一个大脑组织）分装。
  14. 用移液器将吹打后的悬液以每1 mL分装至12孔板中（每脑组织一孔）。
  15. 置于37 °C、5% CO2的湿润细胞培养箱中孵育。三天后更换培养基，之后每隔三天更换一次新鲜培养基。两周后，细胞可用于实验。

2. 大分子单体合成69

  1. 在50 mL锥形离心管中称取375 mg透明质酸（HA）盐，并加入37.5 mL蒸馏水。
  2. 用涡旋振荡器处理溶液1分钟，然后超声处理混合物，直至溶液呈现均匀状态并失去凝胶状黏度。此过程可能需要6小时。
  3. 将溶液转移至含有磁力搅拌子（38 mm）的100 mL烧杯中，在室温下剧烈搅拌。
  4. 小心地向混合的HA溶液中滴加5.0 M NaOH，并用pH试纸测量，直至pH稳定在8至12之间。
  5. 收集3 mL新鲜的甲基丙烯酸酐（MA，94%），储存时需以氮气保护。
    注意：若MA长时间（数天）暴露于空气中，会失去反应活性。
    警告：所有MA操作均应在通风橱中进行。
  6. 向混合的HA溶液中加入200 µL MA。该反应会使溶液pH降至8以下。
  7. 重复步骤2.4至2.6，直至将3 mL MA全部加入溶液中。此过程可能需要1至2小时。
  8. 将反应液在4 °C下静置过夜，不进行搅拌。
  9. 将溶液转移至盛有400 mL冷乙醇（EtOH）的500 mL烧杯中，在4 °C下沉淀24至72小时。56
  10. 小心倾去大部分溶液至另一烧杯中以待处理，将沉淀物收集至50 mL锥形离心管中。必要时可分装至2–4个离心管中。
  11. 在室温下以200 × g离心2分钟，弃去上清液。
  12. 用冷EtOH补满离心管，用涡旋振荡器混合1分钟，重复步骤2.10–2.11。
  13. 加入25 mL无菌去离子水，用涡旋振荡器混合1分钟，超声处理（>20 kHz）1小时，然后在4 °C下过夜孵育。
  14. 将溶液置于-80 °C冰箱中冷冻15分钟或直至完全冻结，或在液氮中速冻。
    警告：使用液氮时，应佩戴防护手套、面罩和围裙。
  15. 将样品在低于0.1 mBar和-30 °C条件下冷冻干燥24至48小时，直至形成雪状粉末。
  16. 此时可通过1H核磁共振检测样品纯度，确认HA主链上甲基丙烯酸酯质子（6.1和5.6 ppm处峰）相对于甲基质子（1.9 ppm）的含量。甲基丙烯酸酯质子与甲基质子的最小比值达到95%即可接受。69

3. 凝胶形成与三维包封65

  1. 盖玻片与模具准备
    1. 在50 mL锥形离心管中，配制50 mL含2% 3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯的蒸馏水溶液。
    2. 将18 mm玻璃盖玻片放入溶液中，室温下摇动孵育1小时。可一次性加入最多50个盖玻片。
    3. 将盖玻片依次浸入3个盛有100 mL去离子水的烧杯中进行清洗。
    4. 在40 °C下，使用干燥器和烘箱在真空环境中过夜干燥盖玻片。
    5. 用镊子将单个盖玻片迅速浸入70% EtOH中。
    6. 未干燥前，将每张盖玻片放入12孔板的孔中。
    7. 用无菌去离子水洗涤并抽吸每个孔（每孔1 mL）。
    8. 向每个孔中加入1 mL无菌的2 µg/mL多聚-L-赖氨酸（PLL），并孵育 >2 h
    9. 吸除PLL溶液，让盖玻片自然风干。
    10. 将聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具浸入（参见 图1) 于70%乙醇中，将一个盖玻片置于每个模具中央，静置风干，使模具与玻璃之间形成密封。
      1. 以10:1的比例将PDMS预混试剂倒入平底聚苯乙烯培养皿中制备PDMS模具。所制备的PDMS用量应足以形成厚度约为1 mm的片状结构。为在PDMS中形成孔腔，使用内径为10 mm的圆形打孔器对PDMS片进行切割。
  2. 细胞制备
    注意：本方案的所有步骤均须在生物安全柜中采用无菌技术进行。所有步骤中使用的磷酸盐缓冲液（PBS）均需调节至 pH 7.4。
    1. 在HAMA中进行细胞包封前24小时，更换12孔板中来自步骤1.15的两周原代培养物的培养基。每孔加入1 mL DMEM/F12培养基（含10% FBS和1% PS）。
    2. 为每块12孔板的细胞准备12.5 mL稀释胰蛋白酶（0.25%胰蛋白酶-EDTA用DMEM/F12培养基稀释至30%），以及25 mL DMEM/F12培养基（含10% FBS和1% PS），置于37 °C水浴中预热。
    3. 使用10 mL血清移液管从培养板中收集条件培养基（> 每孔加入0.5 mL，彻底吸除残留液体，每孔替换为1 mL稀释胰蛋白酶溶液（0.075%胰蛋白酶-EDTA），于培养箱中（37 °C，5% CO₂）孵育20–30分钟2直至融合的细胞层从培养板上脱落。
    4. 用1 mL移液器回收悬浮的细胞材料（呈单个漂浮团块），收集至15 mL锥形离心管中。加入等体积的DMEM/F12（含10% FBS和1% PS）稀释，于室温下以200 × g离心2 min，弃去上清液。
    5. 将细胞沉淀重悬于10 mL预热的DMEM/F12培养基（含10% FBS和1% PS）中，用10 mL移液管吹打5次，然后在200 × g下离心2分钟。
    6. 弃去上清液，用5 mL温热的DMEM/F12重悬细胞，转移至50 mL锥形离心管中。
    7. 使用一个10 mL注射器和18号针头，将细胞溶液吹打混悬3次，并通过40 µm细胞筛过滤至新的锥形离心管中。
    8. 收集10 µL细胞悬液，用预热的DMEM/F12培养基按1:100稀释，使用自动细胞计数仪进行细胞计数
    9. 在37 °C水浴中孵育，直至包封步骤。
  3. 细胞封装
    注意：本方案中的所有步骤均须在生物安全柜中以无菌技术进行。
    1. 对于每块含3D水凝胶的12孔板，将细胞制备过程中收集的12.5 mL DMEM/F12和12.5 mL条件化DMEM/F12培养基预热。
    2. 称取甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）的质量，使其终浓度为0.5%（w/v）。将上述HAMA溶于无菌过滤的磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成2%（w/v）的溶液；该浓度为终浓度的4倍，以预留细胞及其他试剂的添加体积。制备一个12孔板的水凝胶所需溶液约为350 µL PBS，其中含7 mg HAMA。
    3. 超声处理（>20 kHz）溶液中，直至HAMA完全溶解，持续60分钟。
    4. 分别配制三乙醇胺（TEA）和1-乙烯基-2-吡咯烷酮（NVP）的10%溶液，以及曙红Y（EY）的1 mM溶液，均用1 mL无菌PBS（pH 7.4）分装。
    5. 对于一个12孔板，配制终体积为1.4 mL、浓度为1 × 10⁶ 的混合液7 细胞，0.5% wt/vol HAMA（350 µL 的 2% wt/vol 溶液），0.1% TEA（14 µL 的 10% 溶液），0.1% NVP（14 µL 的 10% 溶液），0.01 mM EY（14 µL 的 1 mM 溶液），以及 20% 基底膜混合物（280 µL 储备液）。其余体积用 PBS 补足。
    6. 轻轻混匀溶液，然后用1 mL吸头将100 µL溶液加入每个PDMS模具中。
    7. 将样品置于密闭的20 cm × 20 cm × 20 cm盒内，用高强度绿色LED光（~520 nm，60 mW）在室温下照射5分钟。
    8. 向12孔板的每个孔中加入1 mL温热的DMEM/F12完全培养基。
    9. 用拇指和食指夹住每张盖玻片，用弯头镊子小心地将PDMS模具缓慢剥离，注意不要移动凝胶，然后将其放入含有预温培养基的孔中。
    10. 每孔加入额外的1 mL温热DMEM/F12。
    11. 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育培养板2 连续培养2周，每周通过移液从每个孔中移除1 mL培养基，并补充1 mL DMEM/F12。

4. 显微镜观察

  1. 免疫细胞化学
    注意：使用倒置共聚焦显微镜对这些样品进行成像，并使用 ImageJ 软件处理和显示图像。在 HAMA 培养 3 周后，小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和细胞核将被标记。
    1. 将 10% 磷酸盐缓冲福尔马林（pH 7.0）在 37 °C 水浴中预热。
      注意：尽管福尔马林可在通风橱外使用，但该物质对组织具有反应性，应小心操作并始终佩戴手套。废弃物应单独处理。
    2. 小心吸除培养板中的培养基，并向每孔加入 1 mL 的 10% 福尔马林。
    3. 将培养板在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 20 分钟。
    4. 吸除每孔中的液体，向每孔加入 2 mL PBS（pH 7.4），并孵育 15 分钟。
    5. 重复步骤 4.1.4 两次。
    6. 吸除培养板中的液体，每孔加入 1 mL 含 10% 正常马血清（NHS）和 0.5% Triton X-100 的 PBS 溶液，并以最低速度轻轻摇动 1 小时。
    7. 重复步骤 4.1.4 三次。
    8. 吸除液体，每孔加入 1 mL 下列抗体混合液（溶于 PBS）：兔抗离子化钙结合接头分子（Iba1）1:1,000、鸡抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）1:5,000、小鼠抗 2',3'-环核苷酸 3'-磷酸二酯酶（CNPase）1:1,000、1% NHS 和 0.1% 细胞穿膜表面活性剂。在 4 °C 下过夜孵育，尽可能轻柔地摇动培养板。
    9. 重复步骤 4.1.4 三次，每次孵育 1 小时。
    10. 吸除液体，每孔加入 1 mL 下列二抗混合液（溶于 PBS）：647 nm 激发的驴抗兔抗体 1:200、546 nm 激发的山羊抗鸡抗体 1:200、488 nm 激发的驴抗小鼠抗体 1:200、1% NHS 和 1:1,000 蓝色核染料。室温孵育 1 小时，轻柔摇动培养板。
    11. 重复步骤 4 三次，每次孵育 1 小时。
    12. 为保存水凝胶，吸除缓冲液，将样品浸入 0.5 mL 细胞封片剂中 1 分钟。用移液器吸出封片剂，轻轻将盖玻片置于凝胶上方，在玻璃之间形成一层。在盖玻片未覆盖的一侧加入少量封片剂，以防止水凝胶干燥。
      注意：为便于故障排查，可在步骤 4.1.11 对凝胶进行成像，以确认标记效果正常后再进行后续处理。
  2. 扫描电子显微镜（SEM）
    注意：为观察水凝胶结构，使用扫描电子显微镜对样品进行成像。
    1. 将 2.5% 戊二醛和 2% 多聚甲醛溶于 PBS（0.1 M）的固定液混合物在 37 °C 水浴中预热。
      注意：这些试剂对组织具有高度反应性，应小心操作并佩戴手套。应尽可能在通风橱内操作，并单独处理废弃物。
    2. 吸除细胞培养板中的培养基，加入 1 mL 预热的固定液混合物。
    3. 将培养板在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 20 分钟。
    4. 将培养板置于 4 °C（冰箱或冷却器）中过夜。
    5. 吸除各孔中的固定液，每孔加入 1 mL PBS。
    6. 吸除每块培养板中的液体，每孔加入 2 mL PBS，并孵育 15 分钟。
    7. 再重复步骤 4.2.6 两次。
    8. 吸除 PBS，每孔加入 1 mL 用 PBS 缓冲的 1% 四氧化锇溶液。
      注意：在样品干燥前，此步骤及后续所有步骤均应在通风橱内进行。
    9. 固定反应持续 30 分钟。四氧化锇液体释放的蒸气可同时固定同板中的其他样品；因此，在此步骤前应合理分隔样品。
      注意：四氧化锇对组织具有高度反应性且易挥发，具有危险性，必须在通风橱内佩戴手套操作。其废液及初次冲洗液均应单独处理。
    10. 重复步骤 4.2.6 三次。
    11. 吸除液体，按以下列表顺序依次加入脱水试剂混合物，并在室温下孵育指定时间。先逐步加入乙醇（EtOH），再加入六甲基二硅氮烷（HMDS）。各阶段的具体浓度参见表 2。
      注意：加入 HMDS 时，盖玻片可能与塑料板强烈粘连，难以取出。可在首次加入 HMDS 后，在盖玻片下方放置一小块塑料平台以防止粘连。在第二次乙醇孵育后，可将样品取出并在液氮中短暂淬灭数秒，以实现冷冻断裂。
    12. 小心取出干燥后的样品，使用双面导电胶带将其固定在扫描电子显微镜样品台（stub）上。
    13. 用最少剂量的金对样品进行溅射镀膜。将样品放入样品座，以 15 mA 电流运行仪器 2 分钟。

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结果

为了高通量地模拟神经组织宿主反应及胶质瘢痕 体外 系统需要一种具有基质材料的三维细胞支架，该材料应具备生物相容性，且在过程中不引发细胞毒性反应 原位 形成，并可通过生物活性成分进行修饰以引导有益的生物学响应。为此，我们构建了一种基于透明质酸的三维细胞支架系统，并包载了原代混合胶质细胞群体，用于研究细胞间相互作用及胶质细胞的生物反应性。我们对细胞与支架进行了简要的可视化观察。通过共聚焦免疫荧光显微镜显示了细胞亚群的形态，包括少突胶质细胞（绿色标记CNPase）、小胶质细胞（红色标记Iba1）和星形胶质细胞（黄色标记GFAP）图 3Ai-ii -Ci-ii）。支架与细胞形态的结合情况也通过扫描电镜（SEM）显示图 3Aiii-iv - Ciii-iv）。在这些图像中，展示了低倍（i 和 iii）和高倍（ii 和 iv）的代表性图像。一种二维PLL盖玻片包被...

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讨论

为了实现构建三维培养系统以模拟胶质细胞生物反应性及胶质瘢痕形成过程的目标，我们开发了一种能够支持原代培养的小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞，并可对细胞形态及细胞间相互作用进行充分表征的系统。从所示显微图像可见，每种细胞类型在二维、三维HAMA以及三维HAMA-基底膜混合平台上的形态存在明显差异。在二维系统中，细胞形态明显沿表面平面方向伸展；而在三维HAMA中，小胶质细胞和星形胶质细胞通常在基质内体积更小，少突胶质细胞簇则例外。扫描电镜图像显示，细胞在HAMA材料上通常呈更圆润的形态。这可能主要是由于细胞被包埋在基质中，其迁移能力以及突起自由伸展和生长的空间受到限制。在HAMA中，星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞突起生长通常呈放射状。尽管这些细胞能够延伸出突起，但其排列方式表明它们在基质中的移动能力以及与其他细胞相互作用的能力受限。此外，先前的研究已表明，冷冻断裂后的HAMA具有多孔结构，但缺乏相互连通的网络结构，这可能解释了突起生长受限的现象65,70。部分细胞可能未能在光聚合过程中存活而仅被保留在基质中，但在我们...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢自然科学与工程研究委员会（NSERC）、加拿大创新基金会（CFI）、阿尔伯塔创新与健康解决方案（AIHS）、阿尔伯塔卫生服务局以及戴维脑研究基金提供的财务支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1. 透明质酸甲基丙烯酰化（HAMA）合成与光聚合所需材料
透明质酸（HA）Sigma-Aldrich53747-10G来源于链球菌 Streptococcus equi，分子量：1.5 - 1.8 × 10⁶
甲基丙烯酸酐（MA）Sigma-Aldrich275585-100ML
氢氧化钠（NaOH）Sigma-Aldrich221465-25G
乙醇（EtOH）Commerical Alcohols Inc.无水
磷酸盐缓冲液（pH 7.4）片剂Fisher Scientific18912014
三乙醇胺（TEA）Sigma-Aldrich90279-100ML
1-乙烯基-2-吡咯烷酮（NVP）Sigma-AldrichV3409-5G
伊红Y（EY）Sigma-AldrichE6003-25G
聚二甲基硅氧烷（PDMS）Sylgard 184 硅弹性体试剂盒Dow Corning
3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯Sigma-Aldrich440159-100ML
烧杯（100 mL）Corning1000-100
烧杯（500 mL）Corning1000-600
pH试纸（Labstick）Sigma-Aldrich9580
名称公司货号备注
2. 胶质细胞分离与细胞培养所需材料
P1-2日龄Sprague Dawley大鼠幼崽Charles RiverCD Sprague Dawley大鼠品系编号001
解剖剪刀 - 细刃（小型）Fine Science Tools14081-09
手术剪刀 - Toughcut（大型）Fine Science Tools14130-17
精细镊子（Dumont #5）Fine Science Tools11521-10
弯头精细镊子（Dumont #7）Fine Science Tools11271-30
Hank's平衡盐溶液（HBSS）Gibco14170-112
DMEM/F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基与Ham's F-12营养混合物）Gibco11320-033
青霉素-链霉素（PS）Gibco15140-122
胎牛血清（FBS）Gibco12483-020
0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）Gibco25200-072
聚-L-赖氨酸（PLL）Sigma-AldrichP-6282
50 mL 圆锥形离心管Fisher Scientific05-539-13
15 mL 圆锥形离心管Fisher Scientific05-539-5
12孔组织培养板（Cellstar）Greiner Bio-One665 108
10 mL 血清移液管Fisher Scientific13-676-10F
25 mL 血清移液管Fisher Scientific12-676-10K
培养皿（60 mm × 15 mm）Fisher ScientificFB0875713A
培养皿（100 mm × 15 mm）Fisher ScientificFB0875712
显微镜盖玻片（18 mm）Fisher Scientific12-545-100 18CIR
名称公司货号备注
3. 显微镜观察（共聚焦显微镜与扫描电子显微镜）所需材料
小鼠单克隆抗CNP酶抗体abcamab6319
兔抗Iba1抗体Wako Laboratory Chemicals019-17741
鸡抗GFAP抗体abcamab4674
Hoechst 33342Fisher Scientific62249
Fluoromount-G封片剂Fisher Scientific00-4958-02
福尔马林Sigma AldrichHT501128-4L缓冲液配制（10%）
吐温-20（Triton X-100）Fisher ScientificBP151-500
马血清Gibco16050-122
多聚甲醛Electron Microscopy Sciences157-8缓冲液配制（8%）
戊二醛Electron Microscopy Sciences16019缓冲液配制（8%）
四氧化锇Electron Microscopy Sciences19152缓冲液配制（2%）
六甲基二硅氮烷（HMDS）Electron Microscopy Sciences16700
乙醇（EtOH）Electron Microscopy Sciences15055无水
显微镜载玻片（25 × 75 × 1 mm）VWR International48311-703

参考文献

  1. Shih, J. J., Krusienski, D. J., Wolpaw, J. R. Brain-Computer Interfaces in Medicine. Mayo Clin. Proc. 87, 268-279 (2012).
  2. Kennedy, P. R., Bakay, R. A. Restoration of neural output from a paralyzed patient by a direct brain connection. Neuroreport. 9, 1707-1711 (1998).
  3. Kennedy, P. R., Bakay, R. A., Moore, M. M., Adams, K., Goldwaithe, J. Direct control of a computer from the human central nervous system. IEEE Trans. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 8, 198-202 (2000).
  4. Mayberg, H. S., et al. Deep Brain Stimulation for Treatment-Resistant Depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
  5. Dougherty, D. D., et al. A Randomized Sham-Controlled Trial of Deep Brain Stimulation of the Ventral Capsule/Ventral Striatum for Chronic Treatment-Resistant Depression. Biol. Psychiatry. 78, 240-248 (2015).
  6. Bamford, J. A., Marc Lebel, R., Parseyan, K., Mushahwar, V. K. The Fabrication, Implantation, and Stability of Intraspinal Microwire Arrays in the Spinal Cord of Cat and Rat. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 25, 287-296 (2017).
  7. Holinski, B. J., et al. Intraspinal microstimulation produces over-ground walking in anesthetized cats. J. Neural Eng. 13, 056016(2016).
  8. Toossi, A., Everaert, D. G., Azar, A., Dennison, C. R., Mushahwar, V. K. Mechanically Stable Intraspinal Microstimulation Implants for Human Translation. Ann. Biomed. Eng. 45, 681-694 (2017).
  9. Saigal, R., Renzi, C., Mushahwar, V. K. Intraspinal microstimulation generates functional movements after spinal-cord injury. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 12, 430-440 (2004).
  10. Lau, B., Guevremont, L., Mushahwar, V. K. Strategies for generating prolonged functional standing using intramuscular stimulation or intraspinal microstimulation. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 15, 273-285 (2007).
  11. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J. Neurosci. Methods. 148, 1-18 (2005).
  12. Sierra, A., et al. Surveillance, phagocytosis, and inflammation: how never-resting microglia influence adult hippocampal neurogenesis. Neural Plast. 2014, 610343(2014).
  13. Holm, T. H., Draeby, D., Owens, T. Microglia are required for astroglial Toll-like receptor 4 response and for optimal TLR2 and TLR3 response. Glia. 60, 630-638 (2012).
  14. Gao, Z., et al. Reciprocal modulation between microglia and astrocyte in reactive gliosis following the CNS injury. Mol. Neurobiol. 48, 690-701 (2013).
  15. Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J. Biochem. (Tokyo). 159, 491-496 (2016).
  16. Griffith, R. W., Humphrey, D. R. Long-term gliosis around chronically implanted platinum electrodes in the Rhesus macaque motor cortex. Neurosci. Lett. 406, 81-86 (2006).
  17. Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Exp. Neurol. 195, 115-126 (2005).
  18. Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
  19. Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Res. 983, 23-35 (2003).
  20. Park, D. -W., et al. Graphene-based carbon-layered electrode array technology for neural imaging and optogenetic applications. Nat. Commun. 5, 5258(2014).
  21. McAllister, J. P., et al. Biocompatibility of Penetrating Recording Electrode Arrays Implanted Chronically in the Feline Visual Cortex. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1528(2005).
  22. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. J. Neurochem. 109, 117-125 (2009).
  23. Chung, H., et al. In vivo Biocompatibility and Stability of Polyimide Microelectrode Array for Retinal Stimulation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 5072(2003).
  24. Aregueta-Robles, U. A., Woolley, A. J., Poole-Warren, L. A., Lovell, N. H., Green, R. A. Organic electrode coatings for next-generation neural interfaces. Front. Neuroengineering. 7, (2014).
  25. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24, 4337-4351 (2003).
  26. Yang, J., et al. Ordered surfactant-templated poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) conducting polymer on microfabricated neural probes. Acta Biomater. 1, 125-136 (2005).
  27. Ludwig, K. A., et al. Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) polymer coatings facilitate smaller neural recording electrodes. J. Neural Eng. 8, 014001(2011).
  28. Kim, D. -H., Abidian, M., Martin, D. C. Conducting polymers grown in hydrogel scaffolds coated on neural prosthetic devices. J. Biomed. Mater. Res. A. 71, 577-585 (2004).
  29. George, P. M., et al. Fabrication and biocompatibility of polypyrrole implants suitable for neural prosthetics. Biomaterials. 26, 3511-3519 (2005).
  30. Stauffer, W. R., Cui, X. T. Polypyrrole doped with 2 peptide sequences from laminin. Biomaterials. 27, 2405-2413 (2006).
  31. Green, R. A., Lovell, N. H., Wallace, G. G., Poole-Warren, L. A. Conducting polymers for neural interfaces: challenges in developing an effective long-term implant. Biomaterials. 29, 3393-3399 (2008).
  32. Gumbiner, B. M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell. 84, 345-357 (1996).
  33. Chan, G., Mooney, D. J. New materials for tissue engineering: towards greater control over the biological response. Trends Biotechnol. 26, 382-392 (2008).
  34. Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Impact of co-incorporating laminin peptide dopants and neurotrophic growth factors on conducting polymer properties. Acta Biomater. 6, 63-71 (2010).
  35. Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Cell attachment functionality of bioactive conducting polymers for neural interfaces. Biomaterials. 30, 3637-3644 (2009).
  36. Koss, K. M., Unsworth, L. D. Neural tissue engineering: Bioresponsive nanoscaffolds using engineered self-assembling peptides. Acta Biomater. 44, 2-15 (2016).
  37. Koss, K. M., et al. Brain biocompatibility and microglia response towards engineered self-assembling (RADA)4 nanoscaffolds. Acta Biomater. 35, 127-137 (2016).
  38. Evans, A. J., et al. Promoting neurite outgrowth from spiral ganglion neuron explants using polypyrrole/BDNF-coated electrodes. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 241-250 (2009).
  39. Yu, X., Bellamkonda, R. V. Tissue-engineered scaffolds are effective alternatives to autografts for bridging peripheral nerve gaps. Tissue Eng. 9, 421-430 (2003).
  40. Houweling, D. A., Lankhorst, A. J., Gispen, W. H., Bär, P. R., Joosten, E. A. Collagen containing neurotrophin-3 (NT-3) attracts regrowing injured corticospinal axons in the adult rat spinal cord and promotes partial functional recovery. Exp. Neurol. 153, 49-59 (1998).
  41. Wells, M. R., et al. Gel matrix vehicles for growth factor application in nerve gap injuries repaired with tubes: a comparison of biomatrix, collagen, and methylcellulose. Exp. Neurol. 146, 395-402 (1997).
  42. Barras, F. M., Pasche, P., Bouche, N., Aebischer, P., Zurn, A. D. Glial cell line-derived neurotrophic factor released by synthetic guidance channels promotes facial nerve regeneration in the rat. J. Neurosci. Res. 70, 746-755 (2002).
  43. Fine, E. G., Decosterd, I., Papaloïzos, M., Zurn, A. D., Aebischer, P. GDNF and NGF released by synthetic guidance channels support sciatic nerve regeneration across a long gap. Eur. J. Neurosci. 15, 589-601 (2002).
  44. Burdick, J. A., Ward, M., Liang, E., Young, M. J., Langer, R. Stimulation of neurite outgrowth by neurotrophins delivered from degradable hydrogels. Biomaterials. 27, 452-459 (2006).
  45. Piantino, J., Burdick, J. A., Goldberg, D., Langer, R., Benowitz, L. I. An injectable, biodegradable hydrogel for trophic factor delivery enhances axonal rewiring and improves performance after spinal cord injury. Exp. Neurol. 201, 359-367 (2006).
  46. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, 497-504 (2006).
  47. Taylor, S. J., Sakiyama-Elbert, S. E. Effect of controlled delivery of neurotrophin-3 from fibrin on spinal cord injury in a long term model. J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 116, 204-210 (2006).
  48. Jhaveri, S. J., et al. Release of nerve growth factor from HEMA hydrogel-coated substrates and its effect on the differentiation of neural cells. Biomacromolecules. 10, 174-183 (2009).
  49. Lee, A. C., et al. Controlled release of nerve growth factor enhances sciatic nerve regeneration. Exp. Neurol. 184, 295-303 (2003).
  50. Matsumoto, K., et al. Neurite outgrowths of neurons with neurotrophin-coated carbon nanotubes. J. Biosci. Bioeng. 103, 216-220 (2007).
  51. Khaled, I., et al. A Flexible Base Electrode Array for Intraspinal Microstimulation. IEEE Trans. Biomed. Eng. 60, 2904(2013).
  52. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed. Microdevices. 16, 43-53 (2014).
  53. Hsu, H. -L., et al. Flexible UV-ozone-modified carbon nanotube electrodes for neuronal recording. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 2177-2181 (2010).
  54. Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med. Biol. Eng. Comput. 48, 945-954 (2010).
  55. Lin, C. -M., Lee, Y. -T., Yeh, S. -R., Fang, W. Flexible carbon nanotubes electrode for neural recording. Biosens. Bioelectron. 24, 2791-2797 (2009).
  56. Richter, A., et al. A simple implantation method for flexible, multisite microelectrodes into rat brains. Front. Neuroengineering. 6, 6(2013).
  57. Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Trans. Biomed. Eng. 48, 361-371 (2001).
  58. Polikov, V. S., Block, M. L., Fellous, J. -M., Hong, J. -S., Reichert, W. M. In vitro model of glial scarring around neuroelectrodes chronically implanted in the CNS. Biomaterials. 27, 5368-5376 (2006).
  59. Sohal, H. S., Clowry, G. J., Jackson, A., O'Neill, A., Baker, S. N. Mechanical Flexibility Reduces the Foreign Body Response to Long-Term Implanted Microelectrodes in Rabbit Cortex. PloS One. 11, e0165606(2016).
  60. Moshayedi, P., et al. The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nervous system. Biomaterials. 35, 3919-3925 (2014).
  61. Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog. Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
  62. Pöttler, M., Zierler, S., Kerschbaum, H. H. An artificial three-dimensional matrix promotes ramification in the microglial cell-line, BV-2. Neurosci. Lett. 410, 137-140 (2006).
  63. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 42-51 (2014).
  64. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12, 207-218 (2014).
  65. Jeffery, A. F., Churchward, M. A., Mushahwar, V. K., Todd, K. G., Elias, A. L. Hyaluronic acid-based 3D culture model for in vitro testing of electrode biocompatibility. Biomacromolecules. 15, 2157-2165 (2014).
  66. Fitch, M. T., Silver, J. CNS Injury, Glial Scars, and Inflammation. Exp. Neurol. 209, 294-301 (2008).
  67. Churchward, M. A., Todd, K. G. Statin treatment affects cytokine release and phagocytic activity in primary cultured microglia through two separable mechanisms. Mol. Brain. 7, 85(2014).
  68. Lai, A. Y., Todd, K. G. Differential regulation of trophic and proinflammatory microglial effectors is dependent on severity of neuronal injury. Glia. 56, 259-270 (2008).
  69. Hachet, E., Van Den Berghe, H., Bayma, E., Block, M. R., Auzély-Velty, R. Design of biomimetic cell-interactive substrates using hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13, 1818-1827 (2012).
  70. Eslami, M., Javadi, G., Agdami, N., Shokrgozar, M. A. Expression of COLLAGEN 1 and ELASTIN Genes in Mitral Valvular Interstitial Cells within Microfiber Reinforced Hydrogel. Cell J (Yakhteh). , (2015).
  71. Shaltouki, A., Peng, J., Liu, Q., Rao, M. S., Zeng, X. Efficient Generation of Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells in Defined Conditions. STEM CELLS. 31, 941-952 (2013).

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