本文介绍了一种大鼠脑源性胶质细胞（包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞）的三维培养方案。我们展示了原代细胞培养、甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）水凝胶的合成、HAMA光聚合与细胞包封，以及用于共聚焦显微镜和扫描电子显微镜成像的样品处理方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
在中枢神经系统中，多种急性损伤和神经退行性疾病，以及旨在增强功能的植入装置或工程化生物材料，均会导致相同的结果：过度的炎症反应引发胶质增生、细胞毒性，和/或形成胶质瘢痕，从而共同加剧损伤或阻碍正常修复。为了建立一个用于模拟胶质瘢痕形成并研究炎症过程的系统，我们开发了一种三维细胞支架，可容纳原代培养的胶质细胞：包括调控异物反应并启动炎症事件的小胶质细胞、响应刺激形成纤维瘢痕的星形胶质细胞，以及通常对炎症性损伤敏感的少突胶质细胞。本研究提供了一种基于透明质酸的三维水凝胶支架的详细分步制备、培养及显微表征方法，其中封装了大鼠脑源性胶质细胞。此外，还展示了通过共聚焦免疫荧光和扫描电子显微镜对细胞包封效果及水凝胶支架进行表征的实验方案，并演示了通过引入商业化的基底膜混合物等生物活性底物对支架进行修饰，以改善细胞整合能力的方法。
引言
中枢神经系统（CNS）的炎症长期以来被认为是急性（例如，缺血性卒中、创伤性脑和脊髓损伤）和慢性（例如，阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病）CNS损伤的标志性特征，但目前越来越被认识到是神经退行性疾病和神经精神疾病发生的致病因素。持续或不适当的炎症可导致神经损伤和脱髓鞘（例如，多发性硬化症），并对大脑发育（例如，精神分裂症、自闭症）和情绪状态（例如，抑郁症、焦虑症、双相情感障碍）产生负面影响。此外，利用可植入设备（例如，脑机接口1,2,3、深部脑刺激4,5、脊髓内微刺激6,7,8,9,10）的新型治疗策略会在设备与中枢神经系统之间的界面处引发可预测的炎症反应，从而导致保护性组织反应，可能在植入物的整个使用寿....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
该实验方案经阿尔伯塔大学动物护理与使用委员会批准，涉及通过断头法处死出生第1天的Sprague Dawley大鼠幼鼠并提取脑组织。
1. 小胶质细胞和星形胶质细胞的分离67,68
注意：所有用于分离和细胞培养的培养基均需在水浴中预热至 37 °C。Hank's 平衡盐溶液（HBSS）含有 1% 青霉素-链霉素（PS）。所有添加 Ham's F12 营养混合物的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM/F12）均补充有 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素（PS）。仅含胰蛋白酶的混合液不添加 FBS。本实验方案中的所有材料均为无菌（经过滤、酒精处理、购买时已灭菌或经高压灭菌），自步骤 1.8 之后的每一步均须在生物安全柜中采用无菌技术操作。
- 每个大脑组织，预先将15 mL HBSS和12.5 mL DMEM/F12在50 mL锥形离心管中加热至37 °C，并在15 mL锥形离心管中预热约2 mL含1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰蛋白酶。额外加热25 mL DMEM/F12。胰蛋白酶需提前约10分钟预热，以防止酶活性丧失。
- 将足量预热的HBSS倒入无菌的6 cm和10 cm培养皿中，以覆盖皿底表面。每两个大脑组织准备一个10....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
为了高通量地模拟神经组织宿主反应及胶质瘢痕 体外 系统需要一种具有基质材料的三维细胞支架，该材料应具备生物相容性，且在过程中不引发细胞毒性反应 原位 形成，并可通过生物活性成分进行修饰以引导有益的生物学响应。为此，我们构建了一种基于透明质酸的三维细胞支架系统，并包载了原代混合胶质细胞群体，用于研究细胞间相互作用及胶质细胞的生物反应性。我们对细胞与支架进行了简要的可视化观察。通过共聚焦免疫荧光显微镜显示了细胞亚群的形态，包括少突胶质细胞（绿色标记CNPase）、小胶质细胞（红色标记Iba1）和星形胶质细胞（黄色标记GFAP）图 3Ai-ii -Ci-ii）。支架与细胞形态的结合情况也通过扫描电镜（SEM）显示图 3Aiii-iv - Ciii-iv）。在这些图像中，展示了低倍（i 和 iii）和高倍（ii 和 iv）的代表性图像。一种二维PLL盖玻片包被.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
为了实现构建三维培养系统以模拟胶质细胞生物反应性及胶质瘢痕形成过程的目标，我们开发了一种能够支持原代培养的小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞，并可对细胞形态及细胞间相互作用进行充分表征的系统。从所示显微图像可见，每种细胞类型在二维、三维HAMA以及三维HAMA-基底膜混合平台上的形态存在明显差异。在二维系统中，细胞形态明显沿表面平面方向伸展；而在三维HAMA中，小胶质细胞和星形胶质细胞通常在基质内体积更小，少突胶质细胞簇则例外。扫描电镜图像显示，细胞在HAMA材料上通常呈更圆润的形态。这可能主要是由于细胞被包埋在基质中，其迁移能力以及突起自由伸展和生长的空间受到限制。在HAMA中，星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞突起生长通常呈放射状。尽管这些细胞能够延伸出突起，但其排列方式表明它们在基质中的移动能力以及与其他细胞相互作用的能力受限。此外，先前的研究已表明，冷冻断裂后的HAMA具有多孔结构，但缺乏相互连通的网络结构，这可能解释了突起生长受限的现象65,70。部分细胞可能未能在光聚合过程中存活而仅被保留在基质中，但在我们.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢自然科学与工程研究委员会（NSERC）、加拿大创新基金会（CFI）、阿尔伯塔创新与健康解决方案（AIHS）、阿尔伯塔卫生服务局以及戴维脑研究基金提供的财务支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1. 透明质酸甲基丙烯酰化（HAMA）合成与光聚合所需材料 | |||
| 透明质酸（HA） | Sigma-Aldrich | 53747-10G | 来源于链球菌 Streptococcus equi，分子量：1.5 - 1.8 × 10⁶ |
| 甲基丙烯酸酐（MA） | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| 乙醇（EtOH） | Commerical Alcohols Inc. | 无水 | |
| 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）片剂 | Fisher Scientific | 18912014 | |
| 三乙醇胺（TEA） | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| 1-乙烯基-2-吡咯烷酮（NVP） | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
| 伊红Y（EY） | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS）Sylgard 184 硅弹性体试剂盒 | Dow Corning | ||
| 3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯 | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
| 烧杯（100 mL） | Corning | 1000-100 | |
| 烧杯（500 mL） | Corning | 1000-600 | |
| pH试纸（Labstick） | Sigma-Aldrich | 9580 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 2. 胶质细胞分离与细胞培养所需材料 | |||
| P1-2日龄Sprague Dawley大鼠幼崽 | Charles River | CD Sprague Dawley大鼠品系编号001 | |
| 解剖剪刀 - 细刃（小型） | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| 手术剪刀 - Toughcut（大型） | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| 精细镊子（Dumont #5） | Fine Science Tools | 11521-10 | |
| 弯头精细镊子（Dumont #7） | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Hank's平衡盐溶液（HBSS） | Gibco | 14170-112 | |
| DMEM/F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基与Ham's F-12营养混合物） | Gibco | 11320-033 | |
| 青霉素-链霉素（PS） | Gibco | 15140-122 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 12483-020 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA） | Gibco | 25200-072 | |
| 聚-L-赖氨酸（PLL） | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
| 12孔组织培养板（Cellstar） | Greiner Bio-One | 665 108 | |
| 10 mL 血清移液管 | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
| 25 mL 血清移液管 | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
| 培养皿（60 mm × 15 mm） | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| 培养皿（100 mm × 15 mm） | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 显微镜盖玻片（18 mm） | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 3. 显微镜观察（共聚焦显微镜与扫描电子显微镜）所需材料 | |||
| 小鼠单克隆抗CNP酶抗体 | abcam | ab6319 | |
| 兔抗Iba1抗体 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
| 鸡抗GFAP抗体 | abcam | ab4674 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
| Fluoromount-G封片剂 | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| 福尔马林 | Sigma Aldrich | HT501128-4L | 缓冲液配制（10%） |
| 吐温-20（Triton X-100） | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| 马血清 | Gibco | 16050-122 | |
| 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | 缓冲液配制（8%） |
| 戊二醛 | Electron Microscopy Sciences | 16019 | 缓冲液配制（8%） |
| 四氧化锇 | Electron Microscopy Sciences | 19152 | 缓冲液配制（2%） |
| 六甲基二硅氮烷（HMDS） | Electron Microscopy Sciences | 16700 | |
| 乙醇（EtOH） | Electron Microscopy Sciences | 15055 | 无水 |
| 显微镜载玻片（25 × 75 × 1 mm） | VWR International | 48311-703 |
参考文献
- Shih, J. J., Krusienski, D. J., Wolpaw, J. R. Brain-Computer Interfaces in Medicine. Mayo Clin. Proc. 87, 268-279 (2012).
- Kennedy, P. R., Bakay, R. A. Restoration of neural output from a paralyzed patient by a direct brain connection. Neuroreport. 9, 1707-1711 (1998....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
