通过点击化学实现骨形态发生蛋白2在固体表面的定点固定

摘要

掺杂骨形态发生蛋白2（BMP2）的生物材料已被用作治疗骨不连骨折的一种新治疗策略。为了克服因该因子不可控释放所导致的副作用，我们提出一种新的策略，可将该因子定点固定，从而制备出具有增强成骨能力的材料。

摘要

用于治疗难愈性长骨缺损的多种治疗策略已得到广泛研究。目前的治疗方法存在若干局限性，因而促使人们将生物材料与成骨生长因子（如骨形态发生蛋白，BMPs）联合使用。常用的吸附或包封方法需要超生理剂量的BMP2，通常导致所谓的初始突释效应，从而引发多种严重不良副作用。克服这些问题的一种可能策略是将蛋白共价连接至支架材料上。此外，为确保产品结果的可重复性，偶联应以位点特异性方式进行。因此，我们构建了一种BMP2变异体，通过密码子扩展技术在BMP2蛋白成熟区引入一种非天然氨基酸（丙炔基-L-赖氨酸），获得BMP2-K3Plk。利用铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC），将BMP2-K3Plk偶联至功能化微珠上。实验证实了偶联后的BMP2-K3Plk仍具有生物学活性 关键词：难愈性骨缺损，骨形态发生蛋白2，BMP2-K3Plk，非天然氨基酸，密码子扩展，位点特异性偶联，铜催化叠氮-炔环加成，生物材料，生长因子递送，组织工程 体外 BMP2-K3Plk功能化微珠的成骨活性已在基于细胞的实验中得到证实。当功能化微珠与C2C12细胞接触时，能够在微珠局部限定的邻近区域诱导碱性磷酸酶（ALP）的表达。因此，通过该技术可制备出能够触发细胞向成骨谱系分化的功能化支架。此外，由于BMP2通过位点特异性偶联实现了定向控制，所需BMP2剂量更低。该方法确保BMP始终以其适宜的空间取向暴露于细胞表面受体，而这一点在采用非位点特异性偶联技术连接因子时无法实现。该工艺产物具有高度可控性，因而可获得性质均一的材料，提升其在修复临界尺寸骨缺损中的应用潜力。

引言

骨组织工程与骨再生的最终目标是克服在治疗骨不连骨折时常见治疗方法所存在的缺陷与局限性。目前主要采用自体或异体移植作为治疗策略，尽管二者均存在若干缺点。理想的骨移植材料应具备诱导成骨的能力，即同时具有骨诱导和骨传导作用，从而实现移植物与宿主骨之间的骨整合。目前，仅有自体移植被视为 "金标准" 因为它具备理想骨移植材料的全部特性。然而，它也存在一些重要的缺点，例如手术时间较长，以及需要额外的创伤部位，通常会带来更多的并发症（例如慢性疼痛、血肿形成、感染、美容缺陷 等等。。而异体移植材料在所有常规方面的特性均不理想¹近年来，替代性骨移植技术不断改进，旨在制备具有骨诱导性、骨传导性、生物相容性和可生物降解性的支架材料。由于许多生物材料本身并不具备所有这些成骨特性，因此通常将不同的生长因子（主要是BMP2和BMP7）引入支架中，以增强其成骨潜能。².

作为一项关键标准，此类生长因子递送系统应能够随时间推移实现可控剂量的释放，以促进细胞募集与黏附、细胞长入及血管生成等关键生物学事件。然而，骨形态发生蛋白（BMPs）以及其他成骨生长因子通常以非共价方式固定化³包埋和吸附技术由于存在初始突释现象，需要使用超生理剂量的蛋白质，从而导致严重的缺点 体内 通常通过诱导骨质增生、骨溶解、肿....

方案

1. BMP2 变体 BMP2-K3Plk 的制备

1. 通过PCR介导的定点突变克隆BMP2-K3Plk¹²
   1. 从 p25N-hmBMP2 载体中扩增人成熟 BMP2（hmBMP2）（参见 材料表）使用上游引物（5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3'）和下游引物（5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3'）进行扩增，该引物在BMP2成熟区第一个赖氨酸位置引入琥珀终止密码子（TAG）。使用33.5 µL的H₂O，10 µL PCR 反应混合液，1.5 µL 10 µM dNTP 储存液，1.5 µL 正向引物（10 pmol/µL），1.5 µL 反向引物（10 pmol/µL），1 µL p25N-hmBMP2（10 ng/µL），以及 1 µL DNA 聚合酶（参见 材料表在PCR仪中进行（95 °C 变性5分钟，30个循环：95 °C 变性1分钟，60 °C 退火1分钟，72 °C 延伸1分钟，最后72 °C 延伸10分钟）。
   2. 使用市售试剂盒纯化PCR产物，具体操作遵循生产商说明书（参见 材料表).
   3. 在37 °C下使用16 µL H，用限制性内切酶NdeI消化P....

结果

本文介绍了一种将新型BMP2变体BMP2-K3Plk共价偶联到市售叠氮功能化琼脂糖微珠的方法（图1）。通过检测C2C12细胞中碱性磷酸酶（ALP）基因的表达，验证了所制备的BMP2-K3Plk变体的生物活性。体外实验结果显示，野生型BMP2（BMP2-WT）与BMP2-K3Plk诱导的ALP表达水平相似（图2）。

硫酸铜（CuSO₄）与抗坏血酸钠（NaAsc）之间的氧化还原反应会产生活性氧物种，可能影响 BMP2-K3Plk 的结构完整性，从而影响其生物活性。为验证该蛋白的结构完整性，我们进行了过夜孵育实验，使用 CuSO₄ 和 NaAsc 处理，结果显示 BMP2-WT 出现浓度依赖性降解（通过还原条件下的 SDS-PAGE 检测，

讨论

通过遗传密码子扩展技术生成带标签的蛋白质变体，可将多种非天然氨基酸类似物引入蛋白质一级序列中的几乎任意位置。对于BMP2等骨形态发生蛋白（BMP），常见的标签（如6-组氨酸（His）标签）只能引入到N端，因为该蛋白的C端埋藏于三级结构内部，无法从外部接触。在其他位置引入标签时，标签的尺寸很可能引起结构改变，从而破坏BMP的生物活性。此外，在BMP2序列中引入突变可能影响其复性效率，并可能改变其他蛋白质参数，例如修饰后蛋白质的等电点。因此，既定蛋白质生产流程中的每一步都可能需要根据所获得的蛋白质变体特性进行调整。BMP2-K3Plk的制备确实需要对野生型BMP2的既定表达方法进行修改。我们测试了不同的培养时间或丙氨酰-L-赖氨酸（Plk）浓度（数据未显示），以获得最高的表达产量。幸运的是，复性、分离和纯化步骤无需进一步调整。我们此前已报道，在本实验室制备的其他BMP2变体中，某些蛋白质特性发生了显著变化，因而需要对BMP生产方法的多个步骤进行修改¹⁸。所获得的BMP2-K3Plk表现出与野生型蛋白相当的生物学活性。但在高浓度BMP2条件下出现差异，这可能是由于BMP2-K3Plk变体在培养基.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>材料
1-步法 NBT/BCIP	赛默飞世尔科技	34042	将溶液加入细胞中
3-叠氮-7-羟基香豆素	BaseClick	BCFA-047-1	用于点击反应的化学物质
低熔点琼脂糖	Biozym	840101	ALP 检测用琼脂糖
叠氮基琼脂糖微珠	Jena Bioscience	CLK-1038-2	用于反应的珠子
BamHI（快速消化酶）	赛默飞世尔科技	FD0054	限制性内切酶
BMP受体IA（BMPR-IA）EC	--	--	本实验室制备
考马斯亮蓝 G-250 染料	赛默飞世尔科技	20279	SDS-PAGE 考马斯亮蓝染色所用化学试剂
无水硫酸铜（CuSO₄）4)	Alfa Aesar	A13986	用于点击反应的化学物质
DNA聚合酶和反应缓冲液	Kapabiosystems	KK2102	KAPA HiFi PCR 试剂盒
杜尔贝科’s 改良的 Eagle’DMEM GlutaMAX培养基	Gibco	61965-026	细胞培养基
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma Aldrich GmbH	E5134-1kg	用于终止点击反应的化学物质
异丙基 ß异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）	卡尔·罗斯有限公司	2316.5	细菌诱导（终浓度 1 mM）
NdeI（Fast Digest 酶）	赛默飞世尔科技	ER0581	限制性内切酶
NHS 活化的德克萨斯红	生命技术	T6134	与受体偶联
对-硝基苯基磷酸盐	Sigma Aldrich GmbH	N4645-1G	碱性磷酸酶
p25N-hmBMP2	--	--	质粒由 Walter Sebald 惠赠予 J. Nickel
pET11a-pyrtRNA	--	--	由维尔茨堡大学药剂学与生物药剂学教席提供
丙炔基-L-赖氨酸（Plk）	--	--	由维尔茨堡大学药剂学与生物药剂学教席提供
pSRFduet-pyrtRNAsynth	--	--	由维尔茨堡大学药剂学与生物药剂学教席提供
Qiagen 胶回收试剂盒	Qiagen	28704	凝胶纯化
Qiagen PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104	PCR 纯化
L-抗坏血酸钠	Sigma Aldrich GmbH	A7631-100G	用于点击反应的化学物质
T4 DNA连接酶	赛默飞世尔科技	EL0011	连接反应
三(3-羟丙基三唑基甲基)胺（THPTA）	BaseClick	BCMI-006-100	用于点击反应的化学物质
4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇	Sigma Aldrich GmbH	X100-1L	Triton X-100
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>仪器设备
Amicon 浓缩装置 400 ml	默克股份公司	UFSC40001	浓缩单元
Amicon Ultra-15 离心滤过装置	默克股份公司	UFC901024	离心浓缩装置
ÄKTA avant FPLC	ÄKTA	--	FPLC 仪器
Avanti J-26XP	贝克曼库尔特	393124	细菌培养离心机
细菌摇床培养箱	Infors HT		用于细菌培养的摇床培养箱
FluorChem Q 系统	ProteinSimple	--	SDS-PAGE 成像与分析系统
荧光显微镜	Keyence	BZ-9000（BIOREVO）
Fractogel® EMD SO3- （M）	默克股份公司	116882	离子交换色谱柱材料
Greiner CELLSTAR® 96 孔板	Sigma	M5811-40EA	用于细胞培养的96孔板（ALP检测）
Heraeus Multifuge X1R	赛默飞世尔科技	--	离心
M-20 微孔板摆动桶转子	赛默飞世尔科技	75003624	用于ALP染色过程中微孔板的微型离心机转子
微型离心机 - 5417R	Eppendorf	--	离心
OriginPro 9.1 G	OriginLab	--	用于ALP检测数据分析的统计软件
多聚赖氨酸载玻片	赛默飞世尔科技	10143265	显微镜载玻片
转子 JA-10	贝克曼库尔特	--	Avanti J-26XP 离心机转子
转子 JLA 8.1	贝克曼库尔特	--	Avanti J-26XP 离心机转子
转子 JA 25.50	贝克曼库尔特	--	Avanti J-26XP 离心机转子
Tecan infinite M200 多功能酶标仪	Tecan Deutschland GmbH	--	用于ALP检测的多功能酶标仪
热循环仪 - Labcycler 梯度	SensoQuest GmbH	--	PCR
TxRed - 显微镜滤光片	Keyence		荧光显微镜滤光片
超滤再生纤维素圆盘，3 kDa	默克股份公司	PLBC04310	使用 Amicon 浓缩装置 400 ml
超滤再生纤维素圆盘，10 kDa	默克股份公司	PLGC04310	使用 Amicon 浓缩装置 400 ml