γH2AX与53BP1免疫荧光显微镜检测用于分析DNA双链断裂的形成与修复

摘要

本文提供了一种通过γH2AX和53BP1的免疫荧光显微镜分析DNA双链断裂的实验方案。

摘要

DNA 双链断裂（DSB）是一种严重的 DNA 损伤。对 DSB 的形成与修复进行分析，在基因组完整性、基因毒性、辐射生物学、衰老、癌症及药物开发等广泛的研究领域中均具有重要意义。在 DSB 发生后，组蛋白 H2AX 在丝氨酸 139 位点被磷酸化，形成跨越数个兆碱基对区域的离散核焦点，可通过免疫荧光显微镜检测。此外，53BP1（p53 结合蛋白 1）是另一种重要的 DSB 响应蛋白，可促进非同源末端连接修复 DSB，同时抑制同源重组。根据 γH2AX 和 53BP1 的特定功能，联合使用免疫荧光显微镜对 γH2AX 和 53BP1 进行分析，可能是深入研究 DSB 的合理方法。本文提供了一套配有方法学注释的逐步操作方案。具体而言，在 NHDF 细胞系的正常成纤维细胞中展示了细胞周期对 γH2AX 焦点模式的影响。进一步地，在一名健康个体的 X 射线照射淋巴细胞中展示了 γH2AX 焦点作为生物标志物的价值。最后，通过 γH2AX 和 53BP1 的免疫荧光显微镜分析，对一名急性髓系白血病患者的 CD34+ 细胞中的遗传不稳定性进行了研究。

引言

DNA 持续受到内源性（例如，复制应激、活性氧物质、DNA 本身的不稳定性）和外源性（例如，化学自由基、辐射）因素的损伤（图1）^1,2,3,4。在各类 DNA 损伤中，DNA 双链断裂（DSB）是一种尤为严重的损伤形式，可能引发细胞死亡或癌变。每个细胞在每个细胞周期中可能产生约 50 个 DSB⁵。在哺乳动物细胞中，同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）是修复 DSB 的主要通路（图2）。HR 发生在 S 期晚期至 G2 期，利用完整的姐妹染色单体作为模板，实现潜在无错误的修复。相比之下，NHEJ 在整个细胞周期中均有活性，但在连接断裂末端前可能发生碱基的添加或切除，因此具有潜在致突变性。此外，当 NHEJ 缺陷时，替代性末端连接可作为一种缓慢且具致突变性的备用修复机制被激活^6,7。

DSB 会在每个....

方案

本文所述所有方法均经海德堡大学曼海姆医学院伦理委员会二批准。已从所有个体获取书面知情同意书。

1. 材料准备

1. 抗凝剂储存液：在0.9%氯化钠溶液中配制每毫升含200 I.U.肝素的抗凝剂储存液。在采集血液或骨髓样本前，向每支采集管（采集体积为9 mL）中加入2 mL该抗凝剂储存液。
2. 红细胞裂解液：配制10× 红细胞裂解液，称取82.91 g氯化铵、7.91 g碳酸氢铵和2 mL 0.5 M乙二胺四乙酸溶液，用双蒸水溶解并调节pH至8.0，定容至1 L。
3. 固定液：在微量离心管中加入8.3 µL 1 M氢氧化钾溶液至360 mg多聚甲醛（PFA）中。用磷酸盐缓冲液（PBS）定容至1 mL刻度，于95 °C加热块中加热，得到1 mL 36% PFA溶液。将1 mL 36% PFA溶液转移至15 mL容量的离心管中，加入8 mL PBS，混匀得到9 mL 4% PFA储存液。分装4% PFA储存液，于-18 °C保存，用于后续细胞固定。
   注意：1）氢氧化钾溶液具有腐蚀性，操作时需注意眼部和皮肤防护。2）PFA具有致癌性，避免皮肤接触和吸入。应在通风橱内配制固定液。
4. 通透液：将50 µL Octoxinol 9加入50 mL PBS中，配制成约0....

结果

在G0/G1期和G2期，γH2AX焦点在细胞中呈现为清晰的荧光点，此时对γH2AX焦点的分析最为准确（图5A）。相比之下，由于DNA复制过程导致γH2AX在细胞核内广泛弥散形成斑点状信号，使得S期细胞中γH2AX焦点的分析变得复杂（图5B）。

细胞固定采用4% PFA（10分钟），透化处理采用0.1% Octoxinol 9（10分钟）。甲醇也可用于固定和透化，但甲醇可能严重破坏细胞核，并使γH2AX焦点弥散，因此与使用4% PFA和0.1% Octoxinol 9处理获得的γH2AX焦点相比，其焦点可能不够清晰明显。

高效抗体的选择对于免疫荧光显微镜实验至关重要。本实验分别采用小鼠单克隆抗-γH2AX一抗和兔多克.......

讨论

γH2AX和53BP1的免疫荧光显微镜检测是一种用于分析多种研究领域中DNA双链断裂（DSB）形成与修复的有用方法。影响实验结果的关键参数包括细胞周期阶段、用于细胞固定和通透的试剂、抗体的选择，以及荧光显微镜的硬件和软件。

通过正常成纤维细胞系NHDF的指数生长期细胞，展示了细胞周期对γH2AX焦点模式的影响。在G0/G1 期和G2期，γH2AX焦点表现为清晰的荧光点状结构，而在S期则呈现为弥散分布的全核γH2AX斑点（图5）。G0/G1期和G2期中清晰可辨的γH2AX焦点提示存在短暂性或构成性DNA损伤，这些损伤可能是在反复的细胞周期过程中积累所致；相反，S期中出现的弥散斑点仅为短暂现象，可能与DNA复制过程相关。由于全核分布的γH2AX斑点可能干扰真实γH2AX焦点的分析，建议在分析时排除S期细胞，这可通过识别S期特异性的γH2AX模式轻松实现。此外，也可通过检测DAPI信号强度或使用S期特异性标志物（例如，Cyclin A）来排除S期细胞。另外，在制备细胞涂片前，将样品于室温（.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 培养基	Sigma-Aldrich	R0883	细胞培养基
肝素钠	ratiopharm	PZN 3029843	肝素 5,000 I.U. / mL
0.9% 氯化钠溶液	B. Braun	PZN 1957154	抗凝剂储备液的组分
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-02	分离单个核细胞的培养基
胰蛋白酶溶液 10X	Sigma-Aldrich	59427C	用于细胞培养中成纤维细胞解离的酶
CD34 MicroBead 试剂盒	Miltenyi Biotec	130-046-702	CD34+ 髓系祖细胞的分离
诊断用显微镜载玻片	赛默飞世尔科技	ER-203B-CE24	显微镜载玻片
Megafuge 1.0 R	Heraeus	75003060	台式离心机
细胞离心涂片装置
盖子	Heraeus	76003422	无微管操作用盖子
细胞容器	Heraeus	75003416	带两个锥形孔的细胞容器
夹子载体	Heraeus	75003414	用于固定细胞容器和载玻片的支架
支撑插入件	Heraeus	75003417	用于固定夹子载体的支撑插件
Triton X-100（辛基苯基聚氧乙烯醚-9）	赛默飞世尔科技	85112	用于细胞膜透化的洗涤剂
1 M 氢氧化钾溶液	默克密理博	109107	配制多聚甲醛溶液所必需
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	固定剂
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	D8537	平衡盐溶液
Chemiblocker	默克密理博	2170	封闭剂
小鼠单克隆抗-γH2AX 抗体（JBW301）	默克密理博	05-636	用于检测的初级抗体 γH2AX
多克隆兔抗53BP1抗体（NB100-304）	Novus Biologicals	NB100-304	用于检测53BP1的一抗
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠抗体	Invitrogen	A-11001	二抗
Alexa Fluor 555 标记的驴抗兔抗体	Invitrogen	A-31572	二抗
Vectashield封片剂	Vector Laboratories	H-1200	含DAPI用于DNA染色
Axio Scope.A1	Zeiss	490035	荧光显微镜
Cool Cube 1 CCD相机	Metasystems	H-0310-010-MS	用于数字记录的摄像系统
Isis 软件	元系统	不适用	显微镜软件