需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

γH2AX与53BP1免疫荧光显微镜检测用于分析DNA双链断裂的形成与修复

16.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/56617

⸱

2017年11月3日

 ,  ,  , 
1Department of Hematology and Oncology, Medical Faculty Mannheim of the Heidelberg University

本文内容

摘要

本文提供了一种通过γH2AX和53BP1的免疫荧光显微镜分析DNA双链断裂的实验方案。

摘要

DNA 双链断裂（DSB）是一种严重的 DNA 损伤。对 DSB 的形成与修复进行分析，在基因组完整性、基因毒性、辐射生物学、衰老、癌症及药物开发等广泛的研究领域中均具有重要意义。在 DSB 发生后，组蛋白 H2AX 在丝氨酸 139 位点被磷酸化，形成跨越数个兆碱基对区域的离散核焦点，可通过免疫荧光显微镜检测。此外，53BP1（p53 结合蛋白 1）是另一种重要的 DSB 响应蛋白，可促进非同源末端连接修复 DSB，同时抑制同源重组。根据 γH2AX 和 53BP1 的特定功能，联合使用免疫荧光显微镜对 γH2AX 和 53BP1 进行分析，可能是深入研究 DSB 的合理方法。本文提供了一套配有方法学注释的逐步操作方案。具体而言，在 NHDF 细胞系的正常成纤维细胞中展示了细胞周期对 γH2AX 焦点模式的影响。进一步地，在一名健康个体的 X 射线照射淋巴细胞中展示了 γH2AX 焦点作为生物标志物的价值。最后，通过 γH2AX 和 53BP1 的免疫荧光显微镜分析，对一名急性髓系白血病患者的 CD34+ 细胞中的遗传不稳定性进行了研究。

引言

DNA 持续受到内源性（例如，复制应激、活性氧物质、DNA 本身的不稳定性）和外源性（例如，化学自由基、辐射）因素的损伤（图1）1,2,3,4。在各类 DNA 损伤中，DNA 双链断裂（DSB）是一种尤为严重的损伤形式，可能引发细胞死亡或癌变。每个细胞在每个细胞周期中可能产生约 50 个 DSB5。在哺乳动物细胞中，同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）是修复 DSB 的主要通路（图2）。HR 发生在 S 期晚期至 G2 期，利用完整的姐妹染色单体作为模板，实现潜在无错误的修复。相比之下，NHEJ 在整个细胞周期中均有活性，但在连接断裂末端前可能发生碱基的添加或切除，因此具有潜在致突变性。此外，当 NHEJ 缺陷时，替代性末端连接可作为一种缓慢且具致突变性的备用修复机制被激活6,7。

DSB 会在每个 DSB 周围数兆碱基对（megabase pairs）的区域内诱导组蛋白 H2AX 在丝氨酸 139 位点（Serine 139）发生磷酸化。形成的细胞核焦点被称为 γH2AX 焦点，可通过免疫荧光显微镜检测8。γH2AX 促进更多 DSB 响应蛋白的募集，并参与染色质重塑、DNA 修复和信号转导过程9。由于每个 γH2AX 焦点被认为代表一个单独的 DSB，因此可通过免疫荧光显微镜对 DSB 进行定量分析，该方法已在癌细胞系和患者样本中得到验证10,11,12,13,14。53BP1（p53 结合蛋白 1）是介导 DSB 修复的另一关键蛋白。它参与 DSB 响应蛋白的募集、检查点信号传导以及 DSB 末端的联会过程15。此外，53BP1 在 DSB 修复通路的选择中发挥关键作用：它促进 DSB 通过非同源末端连接（NHEJ）方式进行修复，同时抑制同源重组修复（HR）16。鉴于 γH2AX 和 53BP1 在 DSB 修复中的真实功能，通过免疫荧光显微镜同时分析 γH2AX 和 53BP1 可能是精确研究 DSB 形成与修复过程的有效方法。

本文提供了一种在细胞核中进行γH2AX和53BP1免疫荧光显微镜检测的分步实验方案。具体而言，该技术应用于正常成纤维细胞系NHDF、健康个体的X射线照射后淋巴细胞以及急性髓系白血病患者的CD34+细胞。方法的详细步骤结合所展示的结果进行说明。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本文所述所有方法均经海德堡大学曼海姆医学院伦理委员会二批准。已从所有个体获取书面知情同意书。

1. 材料准备

  1. 抗凝剂储存液：在0.9%氯化钠溶液中配制每毫升含200 I.U.肝素的抗凝剂储存液。在采集血液或骨髓样本前，向每支采集管（采集体积为9 mL）中加入2 mL该抗凝剂储存液。
  2. 红细胞裂解液：配制10× 红细胞裂解液，称取82.91 g氯化铵、7.91 g碳酸氢铵和2 mL 0.5 M乙二胺四乙酸溶液，用双蒸水溶解并调节pH至8.0，定容至1 L。
  3. 固定液：在微量离心管中加入8.3 µL 1 M氢氧化钾溶液至360 mg多聚甲醛（PFA）中。用磷酸盐缓冲液（PBS）定容至1 mL刻度，于95 °C加热块中加热，得到1 mL 36% PFA溶液。将1 mL 36% PFA溶液转移至15 mL容量的离心管中，加入8 mL PBS，混匀得到9 mL 4% PFA储存液。分装4% PFA储存液，于-18 °C保存，用于后续细胞固定。
    注意：1）氢氧化钾溶液具有腐蚀性，操作时需注意眼部和皮肤防护。2）PFA具有致癌性，避免皮肤接触和吸入。应在通风橱内配制固定液。
  4. 通透液：将50 µL Octoxinol 9加入50 mL PBS中，配制成约0.1% Octoxinol 9的溶液。
  5. 封闭液：将蛋白封闭剂与PBS混合，分别配制成5%和2%的封闭液，于6 – 8 °C保存。

2. 样品制备

  1. 细胞培养中的成纤维细胞：在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中，使用添加了10%胎牛血清、4 mM谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基培养NHDF细胞系的人类成纤维细胞。
    1. 制备载有贴壁成纤维细胞的显微镜载玻片
      1. 从具有指数生长期NHDF成纤维细胞的培养瓶（75 cm2生长面积）中移除培养基。向培养瓶中加入10 mL PBS，通过手动轻轻摇晃培养瓶1分钟，温和洗涤贴壁的成纤维细胞。
      2. 移除PBS，向培养瓶中加入1 mL胰蛋白酶。轻轻摇晃培养瓶，确保所有贴壁细胞均被胰蛋白酶覆盖。随后从培养瓶中移除胰蛋白酶，并将培养瓶放入37 °C培养箱中孵育5分钟。
      3. 将培养瓶从培养箱中取出，向其中加入10 mL RPMI 1640培养基。反复吹打数次以分散成纤维细胞。
      4. 取0.3 mL分散后的成纤维细胞悬液，分别加入到显微镜载玻片的两个区域上，将载玻片放入培养箱中孵育24小时，使成纤维细胞贴附于载玻片表面。如需对成纤维细胞核内的γH2AX和53BP1进行免疫染色，请继续进行步骤3.1。
  2. 患者样本
    1. 血液样本：使用已加入2 mL抗凝剂储备液的采血管，向管中加入7 mL血液。将样本在室温（即，18 - 20 °C）下保存过夜。次日，通过密度梯度离心法分离处于G0/G1期的静息单个核细胞（步骤2.2.3）。
    2. 骨髓样本：使用已加入2 mL抗凝剂储备液（步骤1.1）的采血管，向管中加入7 mL骨髓液。将样本在室温（即，18 - 20 °C）下保存过夜。次日，通过密度梯度离心法分离处于G0/G1期的静息单个核细胞（步骤2.2.3）。使用CD34微珠和细胞分离柱进一步分离CD34+细胞。
    3. 通过密度梯度离心法分离单个核细胞
      注：单个核细胞通过密度梯度离心法从血液和骨髓样本中分离17,18,19。
      1. 将肝素抗凝的血液样本用PBS按1:1比例稀释，肝素抗凝的骨髓样本用PBS按1:3比例稀释。通过将细胞悬液在移液器中反复吸入和推出两次，轻柔地重悬细胞。
      2. 向新试管中加入适量密度梯度介质。将稀释后的血液或骨髓样本轻柔地铺加在密度梯度介质上方，注意避免两层液体混合。
      3. 在室温下以400 × g离心30分钟。用移液器吸除上层血浆层，然后小心收集位于密度梯度介质上方的单个核细胞层，并将其转移至新的试管中。
      4. 向试管中的单个核细胞加入至少三倍体积的PBS。通过将细胞悬液在移液器中反复吸入和推出两次，轻柔重悬细胞。在室温下以400 × g离心10分钟。
      5. 离心后弃去上清液，向细胞沉淀中加入10 mL 4 °C的1× 红细胞裂解液。通过将细胞悬液在移液器中反复吸入和推出两次，轻柔重悬细胞，将试管置于冰上5分钟。随后加入30 mL 4 °C的PBS，并在室温下以400 × g离心10分钟。
    4. 细胞涂片（cytospin）的制备
      1. 使用患者样本的单个核细胞制备两张细胞涂片（即，一张用于γH2AX免疫荧光染色，另一张用于γH2AX与53BP1联合免疫荧光染色），每张涂片使用1.0 × 105个细胞，在300 × g条件下离心10分钟（图3 和 4）。

3. γH2AX 和 53BP1 免疫荧光染色

  1. 固定与通透：使用 200 µL 的 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞 10 分钟。固定后，在摇床上用 30 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。随后使用 200 µL 的 0.1% Octoxinol 9 对细胞进行通透处理，持续 10 分钟。通透后，在摇床上用 30 mL 的 5% 封闭液轻柔洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。最后将细胞置于 30 mL 新鲜的 5% 封闭液中封闭 1 小时。
  2. 抗体孵育
    1. 将一组细胞与小鼠单克隆抗-γH2AX 抗体（1:500）孵育，另一组细胞与小鼠单克隆抗-γH2AX 抗体（1:500）及兔多克隆抗-53BP1 抗体（1:500）共同孵育，4 °C 过夜。
    2. 孵育结束后，在摇床上用 30 mL 的 2% 封闭液轻柔洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
    3. 吸除封闭液后，将第一组细胞与 Alexa488 标记的山羊抗小鼠二抗（1:500）孵育，第二组细胞与 Alexa488 标记的山羊抗小鼠二抗（1:500）及 Alexa555 标记的驴抗兔二抗（1:500）共同孵育，室温孵育 1 小时。
  3. 封片：将载玻片放入培养皿中，用 30 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）在摇床上轻柔洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。吸除 PBS 后，使用含 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂封片。小心地将盖玻片覆盖在封片剂上，避免产生气泡。封片后至少等待 3 小时，待封片剂完全固化，再通过荧光显微镜观察细胞。

4. γH2AX 和 53BP1 焦点的分析

  1. 荧光显微镜观察：使用配备DAPI、Alexa 488和Cy3滤光片的荧光显微镜，在100X 物镜放大倍数下分析细胞核中的γH2AX和53BP1焦点。用相机记录图像，并使用适当的成像软件处理图像。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

在G0/G1期和G2期，γH2AX焦点在细胞中呈现为清晰的荧光点，此时对γH2AX焦点的分析最为准确（图5A）。相比之下，由于DNA复制过程导致γH2AX在整个细胞核内弥散分布形成细小颗粒，使得S期细胞中γH2AX焦点的分析变得复杂（图5B）。

细胞固定采用4% PFA（10分钟），透化采用0.1% Octoxinol 9（10分钟）。甲醇也可用于固定和透化，但甲醇可能严重破坏细胞核，并导致γH2AX焦点弥散，因此与使用4% PFA和0.1% Octoxinol 9处理获得的γH2AX焦点相比，其焦点可能不够清晰明显。

选择高效的抗体对于实现有效的免疫荧光显微镜检测至关重要。实验中分别采用小鼠单克隆抗-γH2AX一...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

γH2AX和53BP1的免疫荧光显微镜检测是一种用于分析多种研究领域中DNA双链断裂（DSB）形成与修复的有用方法。影响实验结果的关键参数包括细胞周期阶段、用于细胞固定和通透的试剂、抗体的选择，以及荧光显微镜的硬件和软件。

通过正常成纤维细胞系NHDF的指数生长期细胞，展示了细胞周期对γH2AX焦点模式的影响。在G0/G1 期和G2期，γH2AX焦点表现为清晰的荧光点状结构，而在S期则呈现为弥散分布的全核γH2AX斑点（图5）。G0/G1期和G2期中清晰可辨的γH2AX焦点提示存在短暂性或构成性DNA损伤，这些损伤可能是在反复的细胞周期过程中积累所致；相反，S期中出现的弥散斑点仅为短暂现象，可能与DNA复制过程相关。由于全核分布的γH2AX斑点可能干扰真实γH2AX焦点的分析，建议在分析时排除S期细胞，这可通过识别S期特异性的γH2AX模式轻松实现。此外，也可通过检测DAPI信号强度或使用S期特异性标志物（例如，Cyclin A）来排除S期细胞。另外，在制备细胞涂片前，将样品于室温（...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

该项目由德国 José Carreras 白血病基金会（DJCLS 14 R/2017）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMI 培养基Sigma-AldrichR0883细胞培养基
肝素钠ratiopharmPZN 3029843 肝素 5,000 I.U. / mL
0.9% 氯化钠溶液B. BraunPZN 1957154抗凝剂储备液的组分
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02分离单个核细胞的培养基
胰蛋白酶溶液 10XSigma-Aldrich59427C用于细胞培养中成纤维细胞解离的酶
CD34 MicroBead 试剂盒Miltenyi Biotec130-046-702CD34+ 髓系祖细胞的分离
诊断用显微镜载玻片赛默飞世尔科技ER-203B-CE24显微镜载玻片
Megafuge 1.0 RHeraeus75003060 台式离心机 
细胞离心涂片装置
盖子Heraeus76003422无微管操作用盖子
细胞容器Heraeus75003416带两个锥形孔的细胞容器
夹子载体Heraeus75003414用于固定细胞容器和载玻片的支架
支撑插入件Heraeus75003417用于固定夹子载体的支撑插件
Triton X-100（辛基苯基聚氧乙烯醚-9）赛默飞世尔科技85112用于细胞膜透化的洗涤剂
1 M 氢氧化钾溶液默克密理博109107配制多聚甲醛溶液所必需
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148固定剂
磷酸盐缓冲液Sigma-AldrichD8537平衡盐溶液
Chemiblocker默克密理博2170封闭剂
小鼠单克隆抗-γH2AX 抗体（JBW301）默克密理博05-636用于检测的初级抗体 γH2AX
多克隆兔抗53BP1抗体（NB100-304）Novus BiologicalsNB100-304用于检测53BP1的一抗
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠抗体InvitrogenA-11001二抗
Alexa Fluor 555 标记的驴抗兔抗体InvitrogenA-31572二抗
Vectashield封片剂Vector LaboratoriesH-1200含DAPI用于DNA染色
Axio Scope.A1Zeiss490035荧光显微镜
Cool Cube 1 CCD相机MetasystemsH-0310-010-MS用于数字记录的摄像系统
Isis 软件元系统不适用显微镜软件

参考文献

  1. Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
  2. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
  3. Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
  4. IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994).
  5. Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
  6. Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
  7. Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
  8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  9. Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
  10. Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
  11. Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
  12. Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
  13. Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
  14. Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
  15. Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
  16. Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
  17. Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
  18. Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
  19. Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
  20. Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
  21. Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
  22. Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
  24. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
  25. Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

H2AX 53BP1 CD34 H2AX
γH2AX与53BP1免疫荧光显微镜检测用于分析DNA双链断裂的形成与修复
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。