采用可溶性硝酰基和三苯甲基探针，利用低场（L波段，1.2 GHz）电子顺磁共振技术，对乳腺癌小鼠模型肿瘤微环境中具有生理学意义的参数进行评估。
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摘要
摘要
本方案展示了基于低场电子顺磁共振（EPR）技术结合功能性顺磁探针在提供肿瘤微环境（TME）化学特征定量信息方面的应用能力，包括 pO2pH、氧化还原状态、间质无机磷酸盐（Pi）浓度和细胞内谷胱甘肽（GSH）的检测。特别是，一种 recently developed 可溶性多功能三苯甲基探针的应用提供了无与伦比的机会 体内 p的同时测量H, pO2 和 Pi in E细胞外空间（HOPE探针）。使用单个探针测量这三个参数，可实现参数间的相关性分析，且不受探针分布和测量时间的影响。
引言
肿瘤微环境在癌症进展和治疗中的关键作用正日益受到重视1在实体瘤TME的重要生理参数中，组织缺氧2酸中毒3,4，高还原能力5，细胞内GSH浓度升高6,7，以及间质性无机磷8 有充分记录。非侵入性 体内 pO2pH、Pi、GSH 和氧化还原状态的评估可为肿瘤微环境（TME）中的生物学过程提供独特见解，并有助于推进抗癌药物及靶向 TME 治疗策略的临床前筛选工具。磁共振成像（MRI）和低场电子顺磁共振（EPR）技术在组织中具有合理的射频穿透深度，因此是无创评估这些 TME 参数的最合适方法。MRI 主要依赖于水质子成像，广泛应用于临床环境中以提供解剖学分辨率，但缺乏功能分辨率。磷-31 核磁共振（31基于内源性磷酸盐信号的磷核磁共振（P-NMR）测量细胞外无机磷浓度和pH值在肿瘤微环境表征中具有潜在应用价值，但通常会被高出数倍的细胞内无机磷浓度所掩盖9,10相比之下，电子顺磁共振（EPR）测量依赖于对特异性设计的顺磁性探针进行光谱学检测和成像，从而实现功能分辨率。值得注意的是，外源性EPR探针相较于外源性核磁共振（NMR）探针具有优势，原因在于EPR本身具有更高的内在灵敏度，且不存在内源性背景EPR信号。近年来已开发出一种兼具pH和氧化还原双功能的氮氧自由基探针。11 多功能三苯甲基探针12 提供了无与伦比的机遇 体内 同时测量肿瘤微环境（TME）的多个参数，并进行与探针分布和测量时间无关的相关性分析。据我们所知，目前尚无其他方法可同时评估 体内 活体受试者中具有生理学意义的化学肿瘤微环境参数，例如 pO2pHePi、氧化还原态和谷胱甘肽。
用于 活体 功能测量的探针：
图1展示了用于获取肿瘤微环境（TME）参数的顺磁性探针的化学结构，这些探针包括颗粒型和可溶型探针。体内电子顺磁共振（EPR）测氧中，颗粒型探针因其高功能灵敏度、在活体组织中的稳定性以及极低的毒性等优势而优于可溶型探针。例如，与可溶型探针相比，颗粒型探针在组织植入部位的滞留时间更长，可实现对组织pO2长达数周的纵向测量。另一方面，可溶型探针则在空间分辨测量方面优于颗粒型探针，可通过基于EPR的成像技术实现，并且能够同时分析多种功能参数（pO2、pH、Pi、氧化还原状态和GSH）。
图1. 用于肿瘤微环境评估检测的顺磁性探针的化学结构。 包括颗粒状pO2探针LiNc-BuO（R = -O(CH2)3CH3），以及可溶性探针：兼具pH和氧化还原双重功能的探针NR；GSH敏感型探针RSSR；以及可检测细胞外 微环境中的pO2、pH和无机磷酸盐（Pi）的多功能HOPE探针。 这些探针的合成方法已在所提供的参考文献中详细描述11,12。请点击此处查看该图的放大版本。
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方案
所有动物实验均按照西弗吉尼亚大学动物护理和使用委员会（WVU IACUC）批准的方案进行。
1. 探针合成与校准
- 颗粒物 pO2-敏感的 LiNc-BuO 探针
注意： LiNc-BuO 微晶的合成与制备方法如参考文献所述13它们非常稳定，可在室温下保存数年。LiNc-BuO 颗粒探针的电子顺磁共振（EPR）线宽是一个 pO2-敏感参数。LiNc-BuO 微晶在从无氧条件至 760 mmHg 氧分压范围内，表现出线宽与氧浓度之间的理想线性依赖关系。 pO2 分压13，其中无氧条件下的本征线宽值及氧依赖性斜率（以 mG/mmHg 为单位）因不同批次的微晶制备而略有差异。因此，每个特定批次均需进行校准。- 称取60 mg的LiNc-BuO微晶。
- 为进行氧敏感性校准，将微晶悬浮于3 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中（浓度为20 mg/mL），在5 mL玻璃圆底试管中，于冰上使用探头式超声仪以20 kHz频率、7 W功率超声处理5分钟。
- 将1 mL超声处理后的微晶置于L波段（1.2 GHz）电子顺磁共振波谱仪的表面线圈谐振器中的玻璃管内，在生理温度下采集连续波（CW）电子顺磁共振谱 37 °C 氧气浓度分别为 0、1、2、4、8 和 20.9%。通过气体控制器输送的混合气体向溶液中通气，以维持设定的氧气浓度，并使用连接恒温器的水浴装置控制温度。采用以下电子顺磁共振（EPR）波谱仪参数进行信号采集：调制幅度 100 mG，调制频率 100 kHz，扫描宽度 5 G，扫描时间 60 s。
- 为了获得更好的信噪比（SNR），应使用等于线宽60%的调制幅度值例如，对于1 G的线宽，使用0.6 G的调制幅度。
- 替代性简化的校准步骤：在通入空气的溶液和无氧溶液中记录电子顺磁共振（EPR）谱图14在后一种情况下，根据参考文献，通过向1 mL探针溶液中添加10 mM葡萄糖和100 U/mL葡萄糖氧化酶，以维持样品的无氧状态。14.
- 使用洛伦兹函数拟合电子顺磁共振（EPR）谱图以确定线宽（LW）。评估微晶对 pO2 LW 依赖关系的斜率 pO2，即（LW的值空气−LW缺氧)/pO2air，其中 LW空气 和 LW缺氧 分别为空气和缺氧条件下的光谱线宽； pO2air = 152 mmHg
- 双功能pH和氧化还原探针，NR
注意： NR探针的合成方法如参考文献所述11在室温下，该物质无论是固态还是水溶液状态均保持稳定。合成的NR探针应保存于 4 °C氮超精细分裂，aN，以及信号幅度衰减速率是NR探针对pH敏感的光谱参数（探针pKa = 6.6 时 37 °C，pH敏感范围为5.6至7.6）以及探针微环境的还原能力。- 从冰箱中取出NR，将容器置于室温下回温10 - 15分钟。准确称取6.34 mg NR，溶于1 mL生理盐水中，并使用pH计通过逐滴加入HCl或NaOH将pH调节至7.2。所得NR溶液（10 mM）作为储备液使用。
- 按照以下步骤对NR探针进行pH校准（参见参考文献）11首先，将0.1 mL NR储备液加入0.9 mL的2 mM Na-磷酸盐缓冲液（含150 mM NaCl）中。使用pH计，通过逐量加入HCl或NaOH，将所得的1 mM NR溶液滴定至所需pH值。使用连接恒温器的水浴控制温度。
- 使用L波段EPR波谱仪，记录样品在1.5 mL微量离心管中的EPR谱图。EPR波谱仪采集参数如下：调制幅度为2.5 G；调制频率为100 kHz；扫描宽度为60 G；扫描时间为20 s。
- 测量超精细分裂常数（aN) 作为EPR谱图中低场和高场组分之间距离的一半，并将其对pH作图，以获得用于L波段EPR pH测量的校准曲线。
- GSH敏感的RSSR探针
注意： RSSR探针的合成方法如参考文献所述15. 将合成的NR探针储存于 4 °C脂溶性RSSR二硫代双自由基化合物可轻易穿过细胞膜，与细胞内GSH反应，为GSH的测定提供了一种可靠方法。 在体 使用电子顺磁共振（EPR）16,17。该方法基于高反应速率 与RSSR探针反应，使细胞内主要的GSH硫醇池中的二硫键断裂（见 方案 1导致两个自由基片段之间的自旋交换被取消，表现为双自由基谱成分的减少以及相应单自由基成分的增加。对于双自由基RSSR探针，单自由基成分振幅的增加速率与GSH浓度成正比，是便于检测GSH的EPR谱参数。根据该参数评估GSH浓度 在体 EPR 测量之前，需在相应的温度和 pH 条件下对 RSSR 与 GSH 反应速率进行校准，步骤如下。- 从冰箱中取出 RSSR，将容器置于室温下回温（10–15 分钟）。称取 4.05 mg NR，溶于 1 mL DMSO 溶液中。将配制好的 RSSR 溶液（10 mM）作为储备液使用。
- 确定速率常数 k 的值观察，即在适宜的温度和pH条件下，RSSR与GSH的反应如下。
- 首先，加入 20 µL 将 RSSR 储存液（10 mM）加入 0.98 mL 的 1 mM Na-磷酸盐缓冲液（pH 7.2，150 mM NaCl）中，配制成 0.2 mM 的 RSSR 探针溶液。
- 配制浓度为 1、2 和 5 mM 的 GSH 溶液，溶剂为 pH 7.2 的 0.1 M Na-磷酸盐缓冲液。为准确评估靶器官细胞中 GSH 的浓度，从 体内 测量，这些 体外 校准必须在接近细胞内pH值的pH条件下进行。
- 将0.2 mM RSSR溶液与1.3.4步骤中配制的任一种GSH溶液等体积混合，使探针的终浓度为0.1 mM，GSH的终浓度分别为0.5、1或2.5 mM。
- RSSR 与 GSH 溶液混合后立即放入 EPR 谐振腔中，每 12 秒记录一次 EPR 谱，持续 10 分钟。随后计算单自由基谱幅增长的动力学。 使用以下EPR波谱仪采集参数：调制幅度，1 G；调制频率，100 kHz；扫描宽度，60 G；扫描时间，10–60 s。
- 将测得的EPR动力学曲线拟合为单指数形式，并计算指数动力学的时间常数。 τ. 线性回归（1/τ = k观察 × [GSH]）可提供GSH与RSSR反应的观测速率常数数值（例如，在 34 °C 和 pH 7.2，k观察 = 2.8 ± 0.2 M-1s-1)11.
- 多功能HOPE探针 pO2pH 和 Pi 评估
注意： 单磷酸化三苯甲基HOPE探针的合成方法如参考文献所述12 并保持在 4 °C. HOPE 在 pH 条件下的连续波电子顺磁共振（CW EPR）谱 << pKa （A - 酸性形式）和 pH >> pKa （B型—基本形式）由磷的超精细裂分引起的双重峰表示，aP典型的仪器设置如下：调制幅度，37.5 mG；调制频率，100 kHz；扫描宽度，0.9 G；扫描时间，20–60 s。在中等pH值（5 < pH < 8) 当A态和B态均存在时，HOPE探针的EPR谱图表现为四重峰。HOPE的单个EPR线宽为a pO2 标记（准确性， ≈ 1 mmHg pO2 范围：1–100 mmHg）。质子化HOPE（A型）的比例可作为pH值在6至8.0范围内的标记（准确度， ± 0.05）。通过谱图模拟提取的质子交换速率值（以 mG 表示）与 Pi 相关，可作为 Pi 的标志物（准确性， ± 0.1 mM，范围为0.1–20 mM）。校准程序在生理温度下进行（37 °C），溶液离子强度（NaCl，150 mM）以及HOPE探针浓度为0.2 mM，如先前参考文献所述12,18，如下所述。- 从冷冻箱中取出HOPE探针，将容器置于室温下回温（10-15分钟）。
- 称取10.7 mg HOPE探针，溶于1 mL生理盐水中，并调节pH至7.4。加入 20 µL 将制备好的HOPE储备液（10 mM）取0.98 mL加入0.98 mL生理盐水中，配制成0.2 mM的HOPE探针溶液。
- 使用 pH 电极对 HOPE 探针溶液（0.2 mM）进行滴定校准，加入少量 NaOH 或 HCl 调节 pH，确保样品最终稀释度低于 1%。使用已在相应 pH 范围内校准的 pH 电极测量 pH 值 37 °C 使用美国国家标准局（National Bureau of Standards）推荐的参比溶液的pH值。pH测量期间，使用连接至循环器的夹套反应杯，以精确控制参比溶液和滴定溶液的温度。通过向探针溶液中添加10 mM葡萄糖和100 U/mL葡萄糖氧化酶，维持无氧条件。
- 在无氧条件下且不含磷酸盐的环境中，分别于 pH ≤ 5 和 pH ≥ 8 时获取 A 型和 B 型的 EPR 谱。
- 使用相应的光谱获取本征光谱参数。即，将光谱线模拟为洛伦兹函数与高斯函数的卷积，其中高斯函数用于近似HOPE探针未分辨的超超精细结构。通过将计算得到的电子顺磁共振（EPR）光谱拟合至实验光谱，可获得参数a的值P 和洛伦兹线宽（ΔLpp），由横向弛豫率 1/T 决定2 （其中 1/T2 = (√3/2)Lpp 用于测量连续波电子顺磁共振（CW EPR）中射频吸收线的导数，以及高斯分布的线宽，G。
注意： 以下参数来自按照步骤 1.4.2 中指定条件测得的光谱：aP(A) = 3.63 G，aP(B) = 3.37 G；1/T2(A) = 23.6 mG；1/T2(B) = 9 mG；G(A) = 40 mG；G(B) = 45 mG（参见参考文献）8). - 获取 HOPE 的 EPR 谱 在中等pH值（5 < pH < 8). 模拟所获得的电子顺磁共振（EPR）谱中高场组分，采用参考文献中适用于非耦合或弱耦合体系中多部位间交换的理论19 如前所述18. 利用获得的A态和B态的内禀参数（见步骤1.4.5）以减少变量数目。将计算得到的光谱拟合至实验光谱，以确定A组分的分数（pA），并绘制 p 的依赖关系图A pH值的影响。利用pA 在后续研究中将pH作为pH校准曲线使用。
注意： 拟合 pH 依赖性 pA 通过标准滴定曲线可得到解离常数 pK 的值a （HOPE）= 6.98在 体内 研究中，由于需要额外时间采集电子顺磁共振（EPR）谱图中磷超精细分裂的低场与高场组分之间的间隙信号，获取HOPE探针的完整EPR谱图并不现实。因此，在后续示例研究中，仅测量并分析了EPR谱图的高场组分。 - 探针校准的 pO2在不同氧气浓度下获取HOPE探针的电子顺磁共振（EPR）谱。
- 控制 pO2 通过气体控制器输送的混合气体对溶液进行鼓泡，以调节溶液的值。控制溶液温度（37 °C使用连接至恒温器的水浴装置。
- 模拟EPR谱图，并按照步骤1.4.6所述将其拟合至实验谱图，以确定氧诱导弛豫速率的数值。
注意： A型和B型HOPE探针的氧诱导弛豫速率值在测量时均为0.49 mG/mmHg 37 °C8. - 为进行[Pi]的探针校准，需在不同磷酸盐浓度下获取HOPE探针的电子顺磁共振（EPR）谱。使用pH值接近pK的HOPE自由基溶液a (pKa = 6.9 时 37 °C)18 并用不同浓度的磷酸盐进行滴定。按照上述步骤中所述，保持温度和气体组成不变。
- 模拟EPR谱图，并按照步骤1.4.6所述将其拟合至实验谱图，以确定Pi诱导的交换速率值。
注意： Pi诱导的交换速率对[Pi]的依赖性被用于后续研究中的校准。
2. 乳腺癌的小鼠模型
- MMTV-PyMT 自发性肿瘤模型
- 使用 4–8 周龄雌性 Friend 病毒 B 型易感性/NIH（FVB/N）小鼠乳腺肿瘤病毒启动子（MMTV）多瘤病毒中 T 抗原（PyMT+）小鼠，其已自发形成乳腺肿瘤，用于 体内 EPR 研究。
- 为比较正常乳腺组织与肿瘤组织的微环境，使用年龄匹配的同窝雌性小鼠作为对照，该小鼠缺乏 PyMT 癌基因（PyMT−，“野生型”）20。
- 在异氟烷麻醉下，每周对小鼠进行一次 L 波段 EPR 波谱分析，持续四周（见下文探针递送方法）。
- 使用空气-异氟烷混合气体（3% 异氟烷）麻醉小鼠，并将小鼠置于可调节的实验台上，呈右侧卧位，使肿瘤（乳腺组织）靠近表面线圈谐振器。
- 小鼠定位后，通过瘤内（i.t.）注射给予探针，调节 EPR 波谱仪，并采集 5–10 分钟的 EPR 谱图。
- 在同一 EPR 检测过程中，测量 2–3 个乳腺肿瘤（来自 MMTV-PyMT+ 小鼠）或无肿瘤的乳腺组织（来自 PyMT− 小鼠）。
- 原位 MET-1 肿瘤模型
- 在 37 °C、5% CO2 和 95% 相对湿度条件下，使用含 10% 胎牛血清（FBS）、10 µg/mL 胰岛素、5 ng/mL 重组人表皮生长因子（rhEGF）和 1% PSA（青霉素 G 钠、硫酸链霉素和两性霉素 B）的 DMEM 培养基，在 T175 培养瓶中培养 FVB/N 背景的 Met-1 小鼠乳腺癌细胞，至约 80% 汇合度。
- 吸除培养基，并用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）（1.54 mM KH2PO4、155 mM NaCl 和 2.71 mM Na2HPO4-7H2O，不含氯化钙或氯化镁，pH = 7.4）冲洗贴壁细胞。
- 加入 5 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液并轻轻摇动培养瓶以消化细胞；细胞脱落后，向培养瓶中加入 10 mL 含 10% FBS 的 DMEM 培养基，收集细胞悬液。
- 将细胞悬液在 4 °C 下以 132 × g 离心 10 分钟。使用血细胞计数板计数细胞，并重悬于最低量 DMEM 培养基中，调整浓度为每 100 µL 含 1 × 106 个细胞。
- 使用胰岛素注射器（29G1/2 针头），缓慢将 100 µL 肿瘤细胞悬液注射至 8 周龄雌性 FVB/N 野生型小鼠第 4 对乳腺脂肪垫中。
- 每隔一天通过触诊监测肿瘤形成情况（约 2–3 周后出现）、肿瘤生长（肉眼观察）及小鼠健康状况（肉眼观察）。
- 每周使用游标卡尺测量一次肿瘤尺寸，并利用以下公式计算肿瘤体积：
3. 探针递送用于 体内 功能测量
- 使用颗粒状 LiNc-BuO 探针（方案 I）进行 pO₂ 测量2 通过植入已内化LiNc-BuO微晶的肿瘤细胞，如前所述在原位肿瘤模型中进行测量14,21 如下所述。
- 对于MET-1肿瘤模型，为实现LiNc-BuO微晶在MET-1细胞内的内化，将LiNc-BuO微晶悬浮于DMEM中，浓度为20 mg/mL，在冰上将悬液置于5 mL玻璃圆底试管中，使用探头式超声仪在20 kHz、7 W功率条件下超声处理5分钟。
- 添加 100 µL 将2 mg LiNc-BuO悬浮液加入含约30%汇合度MET-1细胞的T75培养瓶中，培养液体积为10 mL。所有操作均在生物安全柜中进行，培养基中含青霉素和链霉素以减少潜在污染。
- 将细胞置于培养箱中孵育 37 °C 72 小时或直至细胞汇合度达到约 80%。
- 吸弃培养基。用10 mL PBS洗涤细胞5次。加入5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞。收集细胞。按照上述2.2.4步骤所述条件离心。取部分细胞样品，用台盼蓝染色法检测细胞活率及数量。
- 将细胞重悬于浓度为 1 x 106 每 100 µL 最小必需培养基（minimal DMEM）
- 使用胰岛素注射器，缓慢注射 100 µL 将含有内化LiNc-BuO微晶的细胞悬液注入8周龄雌性FVB/N小鼠的第4对乳腺脂肪垫中 野生型小鼠，如步骤 2.2.5 中所述。
- 按照步骤 2.2.6 和 2.2.7 所述，监测肿瘤的起始与生长。
- 在自发性或原位模型中使用颗粒状 LiNc-BuO 探针（方案 II）。将 LiNc-OBu 微晶注射至目标部位， 例如使用胰岛素注射器将，注入正常乳腺组织或乳腺肿瘤中。
- 可溶性探针
- 使用麻醉机通过吸入空气-异氟烷混合气体（流速1.0 L/min，异氟烷浓度2-3%）对小鼠进行麻醉，并将其放置于电子顺磁共振（EPR）波谱仪的检测间隙中。
- 调节仪器，然后注入 NR（10-30 µL，10 mM），HOPE探针（10−30 µL，0.5–2 mM）溶于生理盐水（pH 7.2）或溶于DMSO的RSSR探针10 µL，10 mM）溶液（i.t.）。
4. 体内 功能测量
- 进行电子顺磁共振（EPR）波谱测量时，使用麻醉机通过吸入空气-异氟烷混合气体对小鼠进行麻醉，具体操作如步骤 3.3.1 所述。
- 使用 L 波段（1.2 GHz）EPR 波谱仪进行功能测量，步骤如下：
- 将表面线圈谐振器放置于正常乳腺组织或乳腺肿瘤表面，并调节波谱仪。
- 在植入后数周内，对植入的颗粒探针采集 5−10 分钟的 EPR 谱；对于可溶性探针，则在注射探针后立即采集 5−10 分钟的 EPR 谱。
- 分析 NR 探针的 EPR 谱，确定其超精细分裂常数 aN 和信号强度 I(t)。利用步骤 1.2.4 中获得的校准曲线，将 aN 值转换为 pH 值。将信号强度 I(t) 衰减速率分析为相对于初始强度 I(t = 0) 的相对变化，以任意单位每秒（s-1）计算。
- 将 GSH 敏感型 RSSR 探针 EPR 谱中单自由基组分的增加拟合为单指数函数，获得指数动力学的时间常数，用于计算 GSH 浓度。
- 按照步骤 1.4.5 所述方法，将多功能 HOPE 探针的高场组分 EPR 谱与实验谱进行拟合，得到 pH、pO2 和 Pi 的数值。
5. 统计学分析
- 进行数据处理和统计分析。对于符合正态分布的数据集，使用皮尔逊相关系数检验（Pearson's r Correlation test）；对于数据分布正态性被拒绝的数据集，使用斯皮尔曼等级相关分析（Spearman's Rank Order Correlation）进行相关性分析。
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结果
使用 LiNc-BuO 探针评估组织 pO2：
按照步骤1.1中所述方法，我们对新制备的LiNc-BuO微晶悬浮液进行了校准。 图2 显示了LiNc-BuO探针的典型线宽氧依赖性，以及在缓冲液悬浮体系和雌性C57Bl/6小鼠乳腺肿瘤组织中测得的代表性EPR谱图，肿瘤组织通过注射内化颗粒的细胞诱导成瘤（步骤3.1）。利用线宽校准可计算组织中的氧浓度 pO2 值 （相当于图 (b) 所示光谱的 7.5 mmHg） 图2).
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讨论
本文所述方法可实现对化学肿瘤微环境（TME）关键参数的无创体内评估，这些参数包括pO2、pH、氧化还原状态、间质无机磷（Pi）浓度以及细胞内谷胱甘肽（GSH）浓度。磁共振技术，如磁共振成像（MRI）和低场电子顺磁共振（EPR），是无创体内分析这些TME参数的首选方法。MRI能够可视化解剖结构，但缺乏功能敏感性。相比之下，EPR技术结合功能性自旋探针使用时，可对微环境的局部参数提供功能敏感性。据我们所知，目前尚无其他方法能够在活体受试者中同时评估诸如pO2、pHe、Pi、氧化还原状态和GSH等具有生理重要性的体内化学TME参数。
所描述的实验方案基于使用低场L波段电子顺磁共振（EPR）技术及专门设计的顺磁性探针。文中介绍了四种探针 图1 可被视为一种有效的 体内 肿瘤微环境评估检测。探针的可获得性是所述方法的重要先决条件 体内 EPR ...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 CA194013、CA192064 和 U54GM104942 的支持。感谢 WVCTSI 为 VVK、AB 和 TDE 提供的启动资金。作者感谢 M. Gencheva 博士和 K. Steinberger 在示意图实验方面提供的协助。本内容仅由作者负责，不代表 NIH 的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| L波段电子顺磁共振波谱仪 | 德国 Magnettech | L波段（1.2 GHz）电子顺磁共振（EPR）波谱仪，用于体外和体内顺磁性分子谱图的采集 | |
| 温度 &和气体控制器 | Noxygen，德国 | 温度 &温度与气体控制器，用于控制和调节温度及气体成分 | |
| 超声波破碎仪 | Fisher Scientific | ||
| GSH（还原型谷胱甘肽） | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| MMTV-PyMT 小鼠 | 内部 | ||
| DMEM | 赛默飞世尔科技 | 11995065 | |
| Met-1 小鼠乳腺癌细胞 | 内部 | ||
| C57Bl/6野生型小鼠 | 杰克逊实验室 | ||
| 胰蛋白酶 | 赛默飞世尔科技 | 25200056 | |
| 台盼蓝排斥染料 | 赛默飞世尔科技 | T10282 | |
| Ohmeda Fluotec 3 | |||
| 异氟烷（IsoFlo） | 雅培实验室 | ||
| 磷酸氢二钠 | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| 磷酸二氢钠 | sigma-奥德里奇 | S07051 | |
| 氯化钠 | sigma-奥德里奇 | S7653 | |
| 盐酸 | sigma-奥德里奇 | 320331 | |
| 氢氧化钠 | sigma-奥德里奇 | S8045 | |
| 葡萄糖 | sigma-奥德里奇 | ||
| 葡萄糖氧化酶 | sigma-奥德里奇 | ||
| Lauda 循环器 E100 | Lauda-Brikmann | ||
| pH计 Orion | 赛默飞世尔科技 | ||
| LiNc-BuO 探针 | 内部 | 八(正丁氧基)萘菁探针的合成参照文献13进行 | |
| NR探针 | 内部 | 硝基氧化物探针根据参考文献11合成。 | |
| RSSR探针 | 内部 | 二硝基氧化物探针根据参考文献15合成。 | |
| HOPE 探针 | 内部 | 单磷酸化三芳基甲基探针根据参考文献12合成。 |
参考文献
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