由于线粒体仅占植物细胞的一小部分，因此需要对其进行纯化以开展多种研究。可通过匀浆处理，随后进行差速离心和密度梯度离心，从多种植物器官中分离得到高度纯化的线粒体组分。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
线粒体是植物中参与多种代谢途径的重要细胞器，最显著的功能是通过氧化还原化合物（如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH2））生成三磷酸腺苷（ATP）。拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组的完整注释使其成为应用最广泛的植物模式系统，因此有必要从多种器官（叶片、根或花）中纯化线粒体，以充分利用当前可用于研究拟南芥线粒体生物学的各种工具。线粒体的分离通常通过多种方法对组织进行匀浆，随后进行一系列差速离心步骤，获得粗线粒体沉淀，再通过连续胶体密度梯度离心进一步纯化。随后通过多次离心步骤去除胶体密度介质。从100 g新鲜叶片组织起始，通常可获得2 - 3 mg线粒体。对这些线粒体进行的呼吸实验显示，其典型呼吸速率为100 - 250 nmol O2 min-1 mg总线粒体蛋白-1（NADH依赖性速率），并能够利用多种底物和抑制剂来确定被氧化的底物种类以及替代氧化酶和细胞色素末端氧化酶的活性能力。本实验方案描述了利用连续胶体密度梯度从拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片中分离线粒体的方法，以及对纯化植物线粒体进行高效呼吸活性测定的技术。
引言
植物线粒体研究的历史可追溯到100多年前1早在20世纪50年代初，人们便通过差速离心法首次分离得到了完整的线粒体。20世纪80年代，胶体密度梯度技术的出现使得线粒体可在无需经历渗透压调节的情况下实现纯化。尽管梯度离心纯化的线粒体适用于大多数实验目的，但由于质谱技术具有高度敏感性，即便是相对微量的污染物也可能被检测到，并可能被错误地定位为线粒体组分。2游离流动电泳可用于去除质体和过氧化物酶体污染3，但自由流电泳是一种高度专业化的技术，绝大多数研究并不需要。此外，在确定蛋白质定位时，需要牢记蛋白质在细胞中可能存在双重或多重靶向现象。已有超过100种蛋白质被报道同时靶向叶绿体/质体和线粒体。4，且已知有多种蛋白质靶向线粒体和过氧化物酶体5此外，特定刺激下蛋白质的重新定位， 例如 氧化应激是细胞生物学中一个新兴的研究主题6因此，在研究相关生物学背景时，需要考虑蛋白质的定位，并采用多种方法来确定和验证其位置。2.
线粒体通常通过匀浆法从植物组织中分离，此过程需在打破细胞壁以释放线粒体与避免损伤线粒体之间取得平衡。传统上，使用马铃薯和花椰菜....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本方案用于从生长在土壤中的拟南芥（Arabidopsis thaliana）器官中分离完整线粒体，采用连续胶体密度梯度法。材料采集后的所有操作均在4 °C下进行。
1. 研磨介质、洗涤缓冲液和梯度溶液的制备
- 在分离前一日，按 表1 配制 300 mL 研磨缓冲液（不含抗坏血酸和半胱氨酸）以及 200 mL 2 倍洗涤缓冲液，并于 4 °C 冷藏保存。
注意：在分离当天早晨，向研磨缓冲液中加入抗坏血酸钠和 L-半胱氨酸（游离碱基），使其终浓度分别为 17.84 mM 和 20.36 mM。若线粒体将用于蛋白质印迹（Western blot）或蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）分析，则配制不含牛血清白蛋白（BSA）的 2 倍洗涤缓冲液。 - 在分离线粒体当天早晨制备梯度液（图1 和 表1）。
- 在两个烧杯中分别配制高密度和低密度梯度溶液；每种溶液 35 mL 可满足两根梯度管的需要。
- 用去离子水清洗梯度混合器的内外室及聚氯乙烯（PVC）蠕动泵管路，确保所有管路出液均匀。
- 将 2 支离心管（50 mL）略微倾斜放置于冰上，并用胶带将 PVC 蠕动泵管出口固定在离心管内壁，以确保梯度液沿管壁缓慢流下。 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
通过本方案，我们能够利用SDS-PAGE和免疫印迹法检测不同的线粒体蛋白。如图3A所示，从水培组织中分离的蛋白足以检测到微弱的条带（2 µg）。信号强度随上样量的增加而相应增强。对于从平板培养组织中分离的线粒体（图3B），可通过交替氧化酶抗体的免疫检测分析不同基因型对高光胁迫处理的响应。
线粒体的完整性、细胞色素c通路活性以及替代通路活性可通过新鲜分离的线粒体样品进行测定。在所述的分离过程中，线粒体完整性得以良好保持（图4A）。向分离的线粒体中添加不同的底物、抑制剂和效应物后，细胞色素c通路和替代氧化酶通路的氧气消耗会受到影响（图4B）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
通常，从拟南芥叶片中分离线粒体可从大约80至100株3至4周龄的植株中获得最多达3 mg的线粒体，尽管通过充分研磨通常可以获得超过5 mg的产量。产量随生长条件而变化，并随着叶片衰老而显著下降，尽管线粒体结构在衰老过程中似乎保持良好9。获得高产量最关键的步骤之一是研磨方法，用于裂解细胞以释放线粒体。虽然市面上有多种机械研磨设备可供选择，但对于拟南芥而言，使用研钵和研杵研磨在产量方面始终能获得良好效果，因其可在对细胞器损伤较小的情况下有效裂解细胞。机械研磨器虽然速度快，但需要优化，且所需研磨程度可能因组织类型而异。使用研钵和研杵时，研磨前先用刀片或剪刀将组织切碎，通常更为方便且高效。如前所述，所有操作步骤均需在4 °C下进行，从研磨结束到获得洗涤后的纯化线粒体沉淀，整个过程大约需要4小时。由于试管或梯度混合器上残留的微量去污剂或其他试剂会显著降低产量，因此这些实验中使用的所有组件均需避免使用去污剂清洗，且不得用于其他实验。最后，重要的是线粒体在梯度中需与其他组分充分分离，以便能够将其取出并进行洗涤。如果条带过于靠近管底，说明轻液与重液的混合方式需要调整，应使更多重液在混合前倾倒；相反，如果条.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究得到了澳大利亚研究理事会植物能源生物学卓越中心（CE140100008）、澳大利亚研究理事会未来奖学金（FT130100112，授予MWM）以及费奥多·林嫩研究奖学金（德国亚历山大·冯·洪堡基金会，授予JS）的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | 化学试剂 |
| 抗霉素A | Sigma-Aldrich | A8674 | 化学试剂，溶于乙醇 |
| AOX抗体 | 来自Tom Elthon | Elthon等，1989 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A0157 | 来自葫芦属植物的抗坏血酸氧化酶 |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | 化学试剂 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Bovogen | BSAS 1.0 | 化学试剂 |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | 化学试剂 |
| Criterion Stain-Free预制胶（8-16%，18孔） | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | 化学试剂 |
| 氰化物 | Sigma-Aldrich | 60178 | 化学试剂 |
| 细胞色素c | Sigma-Aldrich | C3131 | 化学试剂 |
| Difco琼脂，颗粒状 | BD Biosciences | 214530 | 化学试剂 |
| 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | D0632 | 化学试剂 |
| 乙二胺四乙酸二钠盐 | Sigma-Aldrich | E5134 | 化学试剂 |
| Gamborg B-5基础培养基 | Austratec | G398-100L | 化学试剂 |
| Gamborg维生素溶液（1000倍浓缩） | Austratec | G219-100ML | 化学试剂 |
| 山羊抗小鼠IgG（H+L）-HRP偶联物 | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | 化学试剂 |
| 山羊抗兔IgG（H+L）-HRP偶联物 | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | 化学试剂 |
| L-半胱氨酸 | Sigma | C7352-100G | 化学试剂 |
| 硫酸镁 | Sigma-Aldrich | 230391 | 化学试剂 |
| Murashige & Skoog基础盐混合物（MS） | Austratec | M524-100L | 化学试剂 |
| 粘杆菌素 | Sigma-Aldrich | T5580 | 化学试剂，溶于乙醇 |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | 化学试剂 |
| Ndufs4抗体 | 来自Etienne Meyer | Meyer等，2009 | |
| 正丙基没食子酸酯 | Sigma-Aldrich | P3130 | 化学试剂，溶于乙醇 |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 化学试剂，胶体密度梯度介质 |
| 聚乙烯吡咯烷酮（PVP40） | Sigma-Aldrich | PVP40 | 化学试剂 |
| 氰化钾 | Sigma-Aldrich | 60178 | 化学试剂 |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | Sigma-Aldrich | P5655 | 化学试剂 |
| 丙酮酸 | Sigma-Aldrich | P2256 | 化学试剂 |
| 氯化钠 | Chem-Supply | SA046 | 化学试剂 |
| 连二亚硫酸钠 | Sigma-Aldrich | 157953 | 化学试剂 |
| 钠-L-抗坏血酸 | Sigma | A4034-100G | 化学试剂 |
| 琥珀酸 | Sigma-Aldrich | S2378 | 化学试剂 |
| 蔗糖 | Chem-Supply | SA030 | 化学试剂 |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | 化学试剂 |
| 焦磷酸四钠（Na4P2O7 · 10H2O） | Sigma-Aldrich | 221368 | 化学试剂 |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi硝酸纤维素转移试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | 化学试剂 |
| 吐温X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 化学试剂，去垢剂 |
| Western封闭试剂 | Sigma | 11921681001 | 化学试剂 |
| 天平 | Mettler Toledo | XS204 | 设备 |
| 烧杯 | Isolab | 50 mL | |
| 离心机 | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | 设备 |
| 离心管 | Nalgene | 3117-9500 | 设备 |
| 循环水浴 | Julabo | 1124971 | 连接至氧电极室 |
| 锥形瓶 | Isolab | 500 mL | |
| 滴管 | 3 mL | ||
| 固定角转子 | Beckman Coulter | JA25.5 | 设备 |
| 漏斗 | Per Alimenti | 14 cm | 用于过滤 |
| 梯度制备器 | Bio-Rad | 165-4120 | 用于制备梯度 |
| 磁力搅拌器ATE | VELP Scientifica | F20300165 | 设备 |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | 过滤材料 |
| 研钵和研杵 | Jamie Oliver | 花岗岩，6英寸 | 设备 |
| O2view | Hansatech Instruments | 氧气监测软件 | |
| Oxygraph Plus系统 | Hansatech Instruments | 1187253 | 克拉克型氧电极 |
| 画笔 | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | 塑料石蜡膜 |
| 蠕动泵 | Gilson | F155001 | 用于制备梯度 |
| PVC蠕动泵管 | Gilson | F117930 | 用于制备梯度 |
| 水浴锅 | VELP Scientifica | OCB | 设备 |
参考文献
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
