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方法文章

快速检测人类神经前体细胞（NPCs）中的神经发育表型

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DOI：

10.3791/56628

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2018年3月2日

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1Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics, Rutgers University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

增殖、迁移和神经突生长等神经发育过程在神经精神疾病中常受到干扰。因此，我们提供了快速且可重复地评估人诱导多能干细胞来源的神经前体细胞（NPCs）中这些神经发育过程的实验方案。这些方案还可用于评估相关生长因子和治疗药物对NPC发育的影响。

摘要

人类大脑发育经历一系列精确协调的过程，早期阶段以细胞增殖、迁移和神经突生长为特征；后期阶段则以轴突/树突生长和突触形成为特征。在神经发育障碍中，这些过程中的一个或多个常常受到干扰，导致大脑结构和功能异常。随着人类诱导多能干细胞（hiPSC）技术的出现，研究人员现在可以获得丰富的人类细胞资源，这些细胞可被分化为几乎任何类型的细胞，包括神经元。这些细胞可用于研究正常的大脑发育以及疾病发病机制。目前已有多种利用hiPSC建模神经精神疾病的研究方案，通常使用终末分化的神经元或称为类器官的三维培养系统。尽管这些方法在研究人类疾病发病机制方面已被证明具有重要价值，但仍存在一些局限性。将hiPSC分化为神经元以及生成类器官的过程耗时较长且成本较高，可能限制可评估的实验数量和变量范围。此外，虽然终末分裂后的神经元和类器官可用于研究包括树突发育和突触形成在内的疾病相关过程，但无法用于研究细胞增殖和迁移等早期发育过程。在自闭症等神经发育障碍中，大量遗传学和尸检证据表明早期发育过程存在缺陷。神经前体细胞（NPCs）是一类高度增殖的细胞群体，可能是研究个体发育过程及疾病起始机制的合适模型。我们现在将从小鼠和大鼠皮层培养研究中获得的方法拓展应用于人类NPCs。使用NPCs使我们能够在短短数天内探究疾病相关的表型，并明确不同变量（例如，生长因子、药物）对增殖、迁移和分化等发育过程的影响。最终，这一工具集可被以可重复且高通量的方式用于识别神经发育障碍中的疾病特异性机制和表型。

引言

利用较为简单的生物体和小鼠模型，已阐明了大脑基本发育机制以及疾病发病过程。尽管取得了这些进展，许多神经精神疾病的确切病因仍不明确，因为简单生物体中的研究发现并非都直接适用于人类疾病的复杂方面。此外，人脑更高的复杂性常常使得在动物中模拟人类发育过程和疾病状态变得困难。随着人类诱导多能干细胞（hiPSCs）技术的发展与进步，体细胞可被重编程为干细胞，随后分化为神经元细胞，从而用于研究人类疾病。hiPSCs技术与"组学"技术（基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学）的进步有望彻底改变人们对人类大脑发育的理解。这些技术如今使得以逐例分析为基础，对神经精神疾病进行"精准医学"方式的表征成为可能。

目前，hiPSC疾病建模领域的主流方法是将细胞在单层培养中分化为特定的神经元亚型，或使用一种称为类器官的三维培养系统来模拟大脑发育的某些方面1,2,3。这些系统在研究和揭示人类发育及疾病独特特征方面已显示出极高的价值4,5,6,7。然而，无论是神经元培养还是类器官，通常都需要数周至数月的培养时间才能进入可研究状态。这些实验方案耗时较长，且维持培养体系所需的资源量较大，常常限制了可开展的实验数量以及可测试的变量（如生长因子或药物）数量。此外，许多利用终末分化神经元和类器官开展的研究主要聚焦于树突发育或突触形成等发生在发育后期的过程。尽管这些过程已被证实与自闭症和精神分裂症等发育性疾病的病理机制相关，但在明确神经元分化之前发生的早期发育事件同样对疾病发生至关重要8,9,10,11,12,13。事实上，近期的基因组学研究显示，包含细胞增殖、突起生长和细胞迁移的胎儿中期在自闭症的致病过程中尤为关键11,14。因此，研究神经干细胞和前体细胞群体对于深入理解这些早期发育过程具有重要意义。类器官系统因其三维结构和组织化的特征被认为更能真实模拟人类大脑发育，其中确实包含可用于研究部分早期事件的前体细胞池。然而，类器官中的前体细胞群体通常较为稀疏，且更接近放射状胶质细胞，而非典型的神经干细胞或前体细胞5,15。因此，建立一种高通量的方法，在具有活跃增殖能力的细胞群体中研究神经发育的早期阶段将具有重要意义。

在实验室中，我们建立了一种利用人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的神经前体细胞（NPCs）的研究方案。NPCs 是一类具有高度增殖能力的神经干细胞与祖细胞混合群体，可用于研究神经发育过程，如细胞增殖、细胞迁移以及初始突起（神经突）的延伸。这些检测方法源于我们实验室数十年来成功用于大鼠和小鼠皮层培养物中神经发育研究的技术16,17,18,19,20,21,22,23。重要的是，已有研究表明，在大鼠和小鼠培养系统中定义的表型及调控信号能够高度预测体内（in vivo）活跃的分子机制，这体现了这些技术的重要价值16,17,18,19,24。在 hiPSCs 初始分化为 NPCs 后，这些方法使我们能够在数天内研究关键的发育过程。该方法具有多项优势：（1）所需仪器设备简单，易于实施；（2）可在短时间内开展大量实验重复，从而快速验证结果的可重复性；（3）可快速且经济高效地测试诸如包被基质、生长因子作用以及药物活性等培养变量。此外，我们充分利用了细胞外生长因子作为多种发育过程关键调控因子的明确作用。通过将 NPCs 暴露于特定的发育信号分子，直接刺激细胞增殖、神经突生长和细胞迁移等事件，我们发现这些处理可增强对在对照条件下不明显的缺陷的识别能力19,25,26,27,28。同样，药物效应的易检测性为采用精准医学策略测试不同治疗干预措施的有效性提供了有力途径。因此，本方案提供了一种高通量、可重复且简便的方法，用于研究早期脑发育、疾病发病机制，以及生长因子和药物对神经发育表型的潜在有益影响。

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方案

1. 安全操作规程与生物安全柜的维护

  1. 生物安全等级2级（BSL-2）安全操作规程
    1. 遵循所在机构关于操作BSL-2级材料的指导方针。根据机构规定处置BSL-2级材料。明确标识用于BSL-2级材料的房间和设备。穿戴所有个人防护装备（PPE），包括实验服和手套。
  2. 生物安全柜维护
    1. 使用经认证可用于BSL-2级材料的生物安全柜。
    2. 开启生物安全柜内的紫外灯至少15分钟，随后用10%次氯酸钠溶液喷洒表面。让溶液静置15分钟，擦拭柜内表面，并在使用前开启气流。
  3. 放射性氚标记[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷（氚）安全操作规程
    注意：氚属于第5类放射源，即“最不可能造成危险”的类别。操作放射性物质时应遵循所在机构的指导方针。部分机构可能要求具备操作氚的资质认证或许可。
    1. 接受所在机构提供的关于如何正确操作和处置氚的培训。根据机构政策，将放射性废物放入指定的专用容器中进行处置。操作氚时穿戴个人防护装备（PPE）。

2. 从iPSCs进行神经诱导

注意：为制备神经前体细胞（NPCs），采用了一种经轻微修改的方案，该方案随市售神经诱导试剂盒提供。该试剂盒包含 Neurobasal（NB）培养基和50倍浓度的神经诱导添加剂（NIS），用于配制1倍浓度的神经诱导培养基（NIM）。NIS 还用于配制100% 扩增培养基（见第3.1节）。该方案的链接见材料与设备及参考文献部分43。

  1. 当iPSCs融合度达到70 - 80%时进行传代。
  2. 将300,000个iPSCs接种至已包被hESC级细胞外基质模拟凝胶（ECM-mimic gel）的6孔板中的1个孔内，每孔含2 mL无饲养层iPSC培养基，并添加5 μM ROCK抑制剂。有关使用ECM-mimic gel包被孔板的步骤，请参见第3.2节。
  3. 次日，移除iPSC培养基（含ROCK抑制剂），用1x PBS洗涤iPSCs一次，随后向孔中加入2 mL NIM。
    注意：50 mL NIM的配制方法为，将1 mL 50x NIS和250 µL（终浓度50 units/mL，5 μL/mL）青霉素/链霉素（P/S）加入49 mL NB培养基中混合而成。
  4. 每2天更换一次神经诱导培养基：吸除旧培养基，更换为2 mL新鲜NIM，直至细胞融合（约4 - 5天）。细胞融合后改为每天换液一次。
  5. 在NIM中培养7天后对细胞进行传代，并接种至已包被ECM-mimic gel的6孔板中，每孔加入2 mL 100%扩增培养基和5 μM ROCK抑制剂。此时的细胞定义为第0代（P0）神经前体细胞（NPCs）。有关100%扩增培养基的配制方法，请参见下方第3.1节。
  6. 使用第3.4节所述方法进行细胞传代。待细胞传至第2代（P2）并达到融合状态后，再进行解离，用于NPC标志物染色及后续实验接种（图1）。

3. 神经前体细胞的培养基、包被及维持

  1. NPC 维持用培养基的制备（100% 扩增培养基）：
    1. 通过将 24.5 mL DMEM/F12 与 24.5 mL NB 混合，配制 50 mL 的 100% 扩增培养基。
    2. 向 DMEM/F12 + NB 溶液中加入 1 mL 的 50x NIS。向培养基中加入 250 μL 的 P/S 溶液。
      注意：培养基可在 4 °C 冷藏，最多可使用 2 周。可通过按相同比例调整 DMEM/F12 + NB + NIS 的体积来配制更小体积的培养基。
  2. 用于 NPC 维持的 ECM 模拟凝胶包被培养板的制备
    1. 根据所需工作液体积（6 mL）分装 ECM 模拟凝胶。由于 ECM 模拟凝胶的稀释倍数因批次和批号而异，请参考分析证书计算分装体积。
    2. 将一份 ECM 模拟凝胶在冰上解冻，并溶于 6 mL 冷的 DMEM/F12 培养基中。
    3. 向 6 孔板的每孔中加入 1 mL ECM 模拟凝胶/DMEM/F12 溶液。将 6 孔板在 37 °C 下孵育 30 分钟。
    4. 孵育 30 分钟后吸除 ECM 模拟凝胶溶液，更换为 100% 扩增培养基；或不吸除 ECM 模拟凝胶溶液，直接将培养板在 4 °C 冷藏保存（最长 1 周）。
  3. NPC 的维持
    1. 将 NPC 以每孔 150 万个细胞的密度接种至含 2 mL 100% 扩增培养基的 ECM 模拟凝胶包被孔中。
    2. 将 NPC 在 37 °C、5% CO2 的湿润环境中孵育。
    3. 对于 P3 及更低代次或刚复苏的 NPC，在培养基中加入 5 μM 的 ROCK 抑制剂以防止过度细胞死亡。24 小时后更换培养基以去除 ROCK 抑制剂。
    4. 每 4 至 9 天传代一次，具体时间取决于细胞达到融合状态的时间。当细胞形成致密单层并完全覆盖培养皿底部时，即视为融合。
    5. 将 NPC 以每 6 孔板一孔 100 万至 150 万个细胞的密度接种（见第 3.4 节）。每 48 小时更换一次耗尽的培养基，并加入 2 mL 100% 扩增培养基。
  4. 用于维持和/或实验条件接种的 NPC 的剥离、解离与离心收集
    1. 吸除培养基，用 1x PBS 洗涤细胞一次。吸除 PBS 后，向融合的 NPC 培养孔中加入 500 μL 1x 细胞解离溶液。在 37 °C 下孵育 10 分钟。
    2. 加入 500 μL 室温（RT）PBS，使用 P-1000 移液器冲洗孔内以确保细胞完全脱落。将细胞 + PBS 溶液收集至 15 mL 圆底离心管中。再用 1 mL PBS 洗涤一次培养板，并将液体加入同一离心管。
    3. 以 300 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
    4. 去除上清液，将细胞重悬于 1–5 mL 预热的 DMEM/F12 培养基中。将细胞稀释至每毫升培养基含 100 万至 400 万个细胞的密度。使用血细胞计数板对细胞进行定量。
    5. 根据需要接种相应数量的细胞，具体用于 NPC 维持（第 3.3 节）或特定实验检测（详见后续章节）。
    6. 用培养基调整细胞悬液体积，使每孔/培养皿接种体积为 15 至 100 μL。此较小接种体积可确保细胞均匀分布，并避免培养基中的生长因子、药物或底物被稀释。
    7. 将细胞在 37 °C 下孵育。用于 NPC 维持时每 48 小时更换一次培养基；若用于特定实验检测，请参照各检测的具体说明。
  5. 实验条件用培养基的制备（30% 扩增培养基）
    1. 通过向 100% 扩增培养基中加入等体积的 DMEM/F12 + NB 溶液，将其稀释 70%（称为 30% 扩增培养基），用于实验条件下的培养。
    2. 通过将 6 mL 100% 扩增培养基与 7 mL NB 和 7 mL DMEM/F12 培养基混合，配制 20 mL 的 30% 扩增培养基。加入终浓度为 5 µL/mL 的 P/S 溶液。
      注意：若 100% 培养基中已含有 P/S，则应按总体积（DMEM/F12 + NB = 14 mL）计算，加入 14 mL × 5 μL/mL = 70 μL 的 P/S，而非 100 μL。
    3. 向 30% 扩增培养基中加入所需浓度的包被底物和生长因子。

4. 评估NPCs的DNA合成、S期进入及细胞数量

  1. DNA合成准备、S期进入及细胞数量检测
    1. 配制1 mg/mL的聚-D-赖氨酸（PDL）储备液，溶于dH₂O中2O，并过滤除菌。用dH₂O按1:10稀释。2O，配制0.1 mg/mL的PDL溶液，向24孔板的每孔中加入300 μL，或向35 mm培养皿中加入1 mL。室温孵育20分钟。
    2. 用去离子水洗涤PDL孔板，每次5分钟，共洗3次2O. 吸除 dH₂O2O，并加入用1×PBS稀释的层粘连蛋白（5 μg/mL），每孔300 μL或每皿1 mL。用封口膜覆盖培养板，于室温（12至24 h）在无菌生物安全柜中孵育过夜。
    3. 在12至24小时后配制30%扩增培养基（见第3.5节）。将溶剂、生长因子或感兴趣的药物以不超过总体积10%的体积加入，使其终浓度达到所需浓度，以避免稀释30%扩增培养基中的NIS。
    4. 用 1× PBS 将 24 孔板的每孔洗涤两次（每次 5 分钟）。吸除 1× PBS，每孔加入 450 μL 培养基（不含或含药物/生长因子）。在接种细胞前，将培养板于 37 °C 孵育至少 15 分钟。
    5. 每次实验为每个条件设置 2 - 3 个孔或培养皿。
    6. 接种NPCs（参见第3.4节）：
    7. NPC DNA合成检测：24孔板中每孔接种100,000个细胞
    8. S期进入：500,000 个细胞/35 mm 培养皿
    9. 细胞数量检测：每孔50,000个细胞，置于24孔板中
  2. 神经前体细胞DNA合成检测
    1. 在24孔板中每孔接种100,000个细胞，每种条件设三个重复孔进行评估。
    2. 加入放射性氚标记的[3在培养46小时后，向每孔培养基中加入[H]-胸腺嘧啶脱氧核苷（1.5 μCi/mL），37 °C孵育2小时。
      注意：使用放射性物质时，须接受所在机构的培训，遵守放射性安全操作规程，并将放射性废物 disposed 于指定的专用废物容器中。
    3. 2小时后移除放射性培养基并妥善处理。每孔加入300 μL预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA（0.5 mM），于37 °C孵育20分钟。
    4. 打开细胞收集器（参见材料与设备部分）和泵，确保泵压低于200 PSI。将滤纸穿过细胞收集器的缝隙，并撕去右上角以标记滤纸的方向。
    5. 将细胞收集管放入空的 "空白" 将收集管放入样品孔中，放入托盘并按下预洗键以润湿滤纸，然后运行（启动）。
    6. 当细胞收集器完成样本采集后，抬起夹子并推进滤纸，以重复处理所有样本组。始终在空的 "空白" 平板
    7. 在光源下将滤纸晾干，并在托盘中准备好相应的样品瓶。将滤纸打孔取样至样品瓶中，每瓶加入 2 mL 液体闪烁液。盖紧瓶盖并标记样品瓶。
    8. 将小瓶在液体闪烁液中孵育至少1小时，然后在闪烁计数仪上读取每分钟计数（CPMs）。
  3. NPC S期进入检测
    1. 细胞的分离、解离、离心成团及重悬步骤详见第3.4节。
    2. 每皿接种500,000个细胞至第4.1节中准备好的35 mm培养皿中，此步骤每种条件仅需1个培养皿。
    3. 以各个方向来回振荡培养皿，确保细胞均匀分布。将细胞在37 °C下孵育46 h。
    4. 每种条件在24小时后准备三个涂有PDL/层粘连蛋白的35 mm培养板。例如，若存在一个35 mm培养皿含有30%扩增培养基，以及另一个35 mm培养皿含有30%扩增培养基加FGF（10 ng/mL），则需包被6个PDL/层粘连蛋白培养板以供次日使用。
    5. 在培养46小时后，向培养物中加入终浓度为2 μL/mL的5 mM EdU，孵育2小时。
    6. 消化并离心收集细胞（参见第3.4节）。将细胞沉淀重悬于3 mL 30%扩增培养基，或3 mL含所需生长因子/药物的30%扩增培养基中。
    7. 每皿加入1 mL，接种于预先包被PDL/层粘连蛋白的培养皿中。轻轻前后左右摇晃培养皿，确保细胞均匀分布。置于37 °C孵育2 h，使细胞充分贴壁。参见 图2 简化的时间线。
  4. S期进入分析
    1. 用预冷的4%多聚甲醛（PFA溶于1×PBS）固定样本20分钟，随后用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
    2. 加入1 mL含0.05%叠氮化钠的1×PBS，以抑制细菌和真菌生长。若将培养皿（用封口膜密封）置于含叠氮化钠的PBS溶液中，细胞可在4 °C保存长达6个月，但并非所有免疫学抗原在长时间延迟分析后均能良好保存。
    3. 使用商业化的EdU反应试剂盒（参见制造商说明书）对细胞进行检测。使用DAPI或其他细胞核标记物对细胞染色，并通过荧光显微镜成像。
    4. 在10个系统随机选取的视野（10倍物镜）中，盲法评估EdU阳性细胞占总活细胞（总细胞数）的比例。分析中不包括死细胞。
    5. 利用相差图像和荧光图像判断EdU染色阳性结果，并确定哪些细胞存活或死亡（图3).
    6. 在相差显微镜下，计数所有细胞膜光滑且均匀、经荧光DAPI核染色后显示大而完整无碎片细胞核的细胞，此类细胞为活细胞图3A-B).
    7. 排除所有在DAPI荧光成像下呈现相位明亮、细胞膜破裂且不规则、细胞核小而致密的细胞，因为这些细胞已死亡图3A- B）。通过观察细胞核内呈现明亮荧光的EdU染色（覆盖整个细胞核）或细胞核内出现斑点状荧光染色，来评估活细胞中EdU的表达情况（图3C).
  5. NPC细胞计数实验
    1. 培养2天后，标记并准备1.5 mL和0.5 mL微量离心管。在每个0.5 mL离心管中加入5 μL台盼蓝。
    2. 向24孔板的每孔中移除培养基，加入200 μL 1x细胞解离溶液，放入培养箱中孵育10至15分钟。
    3. 孵育时间结束后，待细胞脱落后，向每孔加入所需体积的1×PBS。
      注意：通常在第2天，向含有细胞的孔中加入300 μL 1×PBS和200 μL解离溶液，总体积为500 μL。随着培养孵育时间延长，细胞融合度增加，应根据需要增加稀释体积。例如，在第4天加入500 μL 1×PBS，在第6天加入800 μL 1×PBS，总体积分别为700 μL和1 mL。
    4. 使用 P-1000 移液器，在每个孔中上下吹打 4 至 5 次以收集细胞。在显微镜下观察培养板，确保所有细胞均已脱落。将细胞转移至 1.5 mL 离心管中。
    5. 将含有稀释细胞的1.5 mL离心管颠倒混匀2至3次。然后从管中段吸取50 μL细胞悬液，加入含有台盼蓝的0.5 mL离心管中（参见4.5.1）。
    6. 用移液器将细胞悬液上下吹打2至3次。将细胞加入血细胞计数板，并立即进行分析。等待时间超过10分钟可能会增加细胞死亡或细胞摄取台盼蓝的比例。
    7. 小心地将10 µL细胞与台盼蓝混合液分别加入血细胞计数板两侧，进行重复计数。使用相差显微镜计数细胞，不计已摄取台盼蓝而呈深蓝色的死细胞。
    8. 为获得总细胞数，取血细胞计数板四个角的平均细胞数，并应用以下公式：
      平均细胞数 x 培养基体积（mL）× 10,000 = 每孔总细胞数
    9. 吸出液体，并对剩余孔重复此操作。对不计数的细胞每48小时更换一次培养基。在第4天重复检测 & 6.

5. NPC 神经突检测

  1. 神经突检测用培养皿和培养基的制备
    1. 配制1 mg/mL的聚-D-赖氨酸（PDL）储存液于dH₂O中2O 并过滤除菌，用 dH₂O 按 1:10 比例稀释2O，配制0.1 mg/mL的PDL溶液，每35 mm培养皿中加入1 mL。室温孵育20分钟。
    2. 同时，准备30% 扩增培养基（见第3.5节），并向培养基中添加5 μg/mL（5 µL/mL）的纤维连接蛋白溶液（1 mg/mL 储存液）。
    3. 培养基制备完成后，按所需浓度加入载体、生长因子或目标药物。
      注意：最好以较小体积加入载体、生长因子或药物 <避免稀释30%扩张培养基中的纤连蛋白及其他成分，需将总体积的10%作为添加量。
    4. 孵育20分钟后，用去离子水将PDL培养皿洗涤3次，每次5分钟2O 以去除多余的 PDL。在添加培养基前确保培养皿干燥。
    5. 将1 mL培养基（含或不含药物/生长因子）与纤连蛋白溶液加入每个PDL包被的培养皿中。
    6. 将培养皿在37 °C孵育至少30分钟，以确保纤连蛋白（Fibronectin）与多聚赖氨酸（PDL）充分结合，然后再接种细胞。
    7. 每个实验条件下设置 2 - 3 个培养皿例如3个含载体的培养皿，3个含药物的培养皿
  2. 用于神经突检测的NPC铺板
    1. 细胞的分离、解离、离心和重悬步骤详见第3.4节。
    2. 每皿接种50,000个细胞至第5.1节中准备好的培养皿中。轻轻前后左右晃动培养皿，以确保细胞均匀分布。
    3. 在37 °C下孵育细胞48小时。
  3. 神经突分析
    1. 孵育细胞48小时后，吸除培养基，用预冷的4%多聚甲醛固定20分钟。
    2. 孵育20分钟后，用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。最后一次洗涤后，加入1 mL含0.05%叠氮化钠的1×PBS。
    3. 在32倍相位差显微镜下对培养皿进行盲法分析。在随机但可重复的位置选取3条长1 cm的区域，计数总细胞数以及具有神经突的细胞数。每皿至少计数150个细胞，以确保取样充分。
      注意：神经突是指从细胞体延伸出的突起（突起结构），其定义为 >长度为2个细胞体直径。对于具有多个突起的细胞，以最长的突起作为判断标准。若细胞的突起满足以下条件： <长度不足2个细胞体直径的不包括在内（图4).
    4. 将每皿中细胞总数与具有神经突的细胞总数相加，计算具有神经突的细胞百分比。对重复培养皿中具有神经突的细胞百分比取平均值。当每皿内各行数据相近，且各皿之间的平均值高度一致，且均值的标准误（SEM）较小时，可确认实验具有良好的可重复性。 <10%.
    5. 或者，通过针对β-III微管蛋白（TUJ1）或微管相关蛋白2（MAP2）等标志物进行免疫细胞化学染色来分析神经突。染色完成后，在荧光显微镜下以10倍物镜系统性随机采集10张图像，每组至少分析200个细胞。采集图像时应避免过于靠近培养皿边缘。随后分析表达TUJ1或MAP2阳性神经突的细胞百分比（参见 图10 （例如）。

6. NPC 神经球迁移实验

  1. 神经球形成
    1. 向未包被基质的35 mm培养皿中加入1 mL 100%扩增培养基。接种神经前体细胞前，将培养皿在37 °C孵育至少15 min。准备2–3个培养皿，以确保细胞迁移实验有足够数量的神经球。
      注意：不使用包被基质可确保神经前体细胞（NPCs）悬浮于培养基中，这是神经球形成所必需的。包被培养皿将抑制神经球的形成。
    2. 参见第3.4节中关于细胞 lifting、解离和离心成团的步骤。将细胞沉淀重悬于2-5 mL预热的100%扩增培养基中。将100万个NPC接种至第6.1.1节中准备好的每个35 mm培养皿中。
    3. 在37 °C下孵育NPCs 48至96小时，使其聚集并形成神经球。使用相差显微镜上的活体标尺评估神经球大小。待大多数神经球直径达到约100 µm（± 20 μm）时图5较小的球体在迁移实验过程中会完全分散并解体。
  2. 神经球迁移实验用培养板的制备
    1. 将ECM模拟凝胶等分试样（见第3.2节）溶解于6 mL 30%扩增培养基中。待ECM模拟凝胶/30%扩增培养基溶液配制完成后，按所需浓度加入载体、生长因子或目标药物。
      注意：由于第6.3节中加入了200 µL的神经球，需相应增加溶剂、药物和生长因子的浓度。
    2. 将1 mL ECM模拟凝胶/30%扩增培养基溶液（± 载体、生长因子或药物）加入6孔板的一个孔中。每个实验条件制备2–3个孔。也可使用35 mm培养皿。将培养板在37 °C下孵育至少30分钟。.
      注意：本实验中切勿抽吸ECM-模拟凝胶/30%扩增培养基溶液。将细胞球体接种至经过抽吸的ECM-模拟凝胶上会导致细胞快速且过度迁移。
  3. 神经球接种
    1. 收集第6.1节中形成的神经球，放入锥形管中。用1 mL 1×PBS冲洗35 mm培养皿，确保收集全部神经球。在100 × g下离心5分钟，沉淀收集的神经球。
    2. 将神经球重悬于 1 - 3 mL 预热的 30% 扩增培养基中。若收集自 1 个培养皿的神经球，则使用 1 mL 培养基重悬球体；若收集自 2 个培养皿，则加入 2 mL 培养基以重悬球体。 等等。 轻柔地使用移液器，并仅使用P-1000以确保球体不被破坏。
    3. 将重悬的神经球各200 μL接种至第6.2节制备的ECM模拟凝胶/30%扩增溶液中。轻柔摇动培养板，使神经球均匀分布。将培养板在37℃孵育48 h。°C
    4. 去除ECM-模拟凝胶/30%扩增培养基溶液，用4%多聚甲醛固定细胞，洗涤后将细胞保存在1×PBS + 0.05%叠氮化钠中。
  4. 神经球分析
    1. 使用10倍相位差设置获取整个神经球的图像，确保神经球之间互不接触。利用ImageJ软件测量平均迁移距离。
    2. 使用套索工具描记神经球的外轮廓。可通过右键单击来访问套索工具 "直的" 线条图标。使用鼠标手动描迹。
    3. 使用测量功能计算轨迹的面积。确保 "面积" 被选为读出指标 "设置测量参数" 在“分析”选项卡下找到的窗口。参见 图6 用于勾勒外轮廓的蓝色痕迹。
    4. 描记球体内的内细胞团并测量其面积。参见 图6 用红色描记内轮廓。通过从神经球总面积中减去内部细胞团的面积，量化平均迁移距离。
    5. 测量具有致密细胞团核心且细胞以连续铺展方式向外迁移的神经球图6).
    6. 不要将菌毯之外或脱离神经球的细胞纳入测量范围。参见 图6 例如，图中以白色圆圈标出的细胞被排除在外层地毯测量之外。每种条件下至少分析20个神经球。

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结果

这些研究的一个目标是确定神经前体细胞（NPCs）的增殖活性，即细胞数量的增加。这可通过评估整个细胞群体的DNA合成来实现，该方法是一种高通量技术，通过检测放射性示踪剂氚标记的胸苷掺入细胞提取物的情况，反映所有处于S期的细胞，无论其DNA合成持续5分钟或长达两小时。此外，这些检测还可用于确定进入S期的细胞比例及总细胞数量，这是一种更为耗时的单细胞分析方法。细胞在S期合成DNA，此阶段发生在有丝分裂和细胞分裂之前，而细胞分裂必须发生才能实现细胞数量的增加。由于这些过程需要一定时间，因此在48小时测得的DNA合成变化可能与此时间点的细胞数量变化无直接关联。尽管如此，研究发现，48小时时DNA合成的变化能够可靠地预测第4天和第6天细胞数量的增加。

在评估DNA合成时，将细胞以每孔100,000个细胞（约50%汇合度）的密度接种于24孔板中，并培养48小时后进行检测。采用该细胞密度可确保细胞保持其单层生长环境的特性，同时避免在48小时内因过度增殖导致培养基过酸。...

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讨论

本文介绍的实验方案展示了利用人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的神经前体细胞快速、简便地研究基本神经发育过程，并检测生长因子和药物作用的方法。hiPSC技术通过使我们前所未有地获得来自患病个体的活体人源神经元细胞，彻底改变了神经发育性疾病发病机制的研究。事实上，已有大量基于hiPSC的神经发育障碍疾病研究，包括雷特综合征（Rett Syndrome）、蒂莫西综合征（Timothy Syndrome）、脆性X染色体综合征（Fragile-X syndrome）和精神分裂症，这些研究揭示了疾病特异性的树突、突触及神经元功能异常4,33,34,35,36。这些研究大多集中于终末分化的、有丝分裂后神经元，尽管这些细胞在功能上仍相对不成熟，但此类研究忽略了对更早期神经发育过程（如细胞增殖和迁移）的探讨。而这些早期过程已被广泛...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由新泽西州州长医学研究与自闭症治疗委员会（CAUT13APS010；CAUT14APL031；CAUT15APL041）、南希·卢里·马克斯家族基金会、Mindworks慈善信托基金以及大都会西部新泽西犹太社区基金会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
多能干细胞神经诱导培养基：
实验方案链接：https://goo.gl/euub7a 		ThermoFischer ScientificA1647801该试剂盒包含神经基础培养基（NB）和50倍浓缩的神经诱导添加剂（NIS）。NIS用于配制1倍神经诱导培养基和100%扩增培养基
高级DMEM/F12培养基ThermoFischer Scientific12634-010100%扩增培养基的组分
神经基础培养基（Neurobasal Medium）ThermoFischer Scientific21103049神经诱导培养基（NIM）和100%扩增培养基的共同组分 
适用于人胚胎干细胞的MatrigelCorning354277适用于人胚胎干细胞的模拟细胞外基质凝胶（ECM-mimic gel） 
Y-27632（2HCl），1 mgStem Cell Technologies72302ROCK抑制剂
6孔板CorningCOR-3506聚苯乙烯板，用于神经前体细胞（NPC）的维持培养及神经球迁移实验 
24孔板ThermoFischer Scientific2021-05聚苯乙烯板：用于NPC DNA合成实验
35 mm培养皿ThermoFischer Scientific2021-01聚苯乙烯板：用于NPC S期进入和神经突实验
天然小鼠层粘连蛋白（Laminin）Invitrogen23017-015包被培养板的基质：用于NPC DNA合成、S期进入及细胞数量测定
纤连蛋白（Fibronectin）SigmaF1141包被培养板的基质：用于神经突实验 
多聚-D-赖氨酸（Poly-D-Lysine）SigmaP0899包被培养板的基质
青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin）ThermoFischer Scientific15140122抗生素，神经诱导培养基（NIM）、100%扩增培养基和30%扩增培养基的组分 
StemPro AccutaseGibcoA11105-011倍细胞解离溶液 
2.5%胰蛋白酶（10倍浓缩液）Gibco15090-04610倍酶解溶液
0.5 M EDTAThermoFischer ScientificAM9261用于配制胰蛋白酶溶液，以在DNA合成实验中消化并收集细胞
氚标记的[3H]-胸苷PerkinElmerNET027E001放射性氚标记的胸苷
Fisherbrand 7 mL HDPE闪烁瓶Fisherbrand03-337-1用于液体闪烁计数的样品瓶
EcoLite(+)MP Biomedicals0188247501 液体闪烁混合液
LS 6500多功能液体闪烁计数仪Beckman Coulter8043-30-1194液体闪烁计数仪
Skatron半自动细胞收集器，型号11019Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc.半自动细胞收集装置
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488成像试剂盒ThermoFisher ScientificC10337EdU及染色试剂盒，用于S期进入实验
台盼蓝溶液，0.4%ThermoFisher Scientific15250061用于评估细胞活力
GF/C级滤纸GE Healthcare Life Sciences, Whatman1822-849玻璃纤维滤纸
人碱性成纤维细胞生长因子-2（bFGF-2）Peprotech100-18B生长因子
垂体腺苷酸环化酶激活多肽（PACAP-38）BACHEMH-8430神经肽

参考文献

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