增殖、迁移和神经突生长等神经发育过程在神经精神疾病中常受到干扰。因此，我们提供了快速且可重复地评估人诱导多能干细胞来源的神经前体细胞（NPCs）中这些神经发育过程的实验方案。这些方案还可用于评估相关生长因子和治疗药物对NPC发育的影响。
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方法文章
快速检测人类神经前体细胞（NPCs）中的神经发育表型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
人类大脑发育经历一系列精确协调的过程，早期阶段以细胞增殖、迁移和神经突生长为特征；后期阶段则以轴突/树突生长和突触形成为特征。在神经发育障碍中，这些过程中的一个或多个常常受到干扰，导致大脑结构和功能异常。随着人类诱导多能干细胞（hiPSC）技术的出现，研究人员现在可以获得丰富的人类细胞资源，这些细胞可被分化为几乎任何类型的细胞，包括神经元。这些细胞可用于研究正常的大脑发育以及疾病发病机制。目前已有多种利用hiPSC建模神经精神疾病的研究方案，通常使用终末分化的神经元或称为类器官的三维培养系统。尽管这些方法在研究人类疾病发病机制方面已被证明具有重要价值，但仍存在一些局限性。将hiPSC分化为神经元以及生成类器官的过程耗时较长且成本较高，可能限制可评估的实验数量和变量范围。此外，虽然终末分裂后的神经元和类器官可用于研究包括树突发育和突触形成在内的疾病相关过程，但无法用于研究细胞增殖和迁移等早期发育过程。在自闭症等神经发育障碍中，大量遗传学和尸检证据表明早期发育过程存在缺陷。神经前体细胞（NPCs）是一类高度增殖的细胞群体，可能是研究个体发育过程及疾病起始机制的合适模型。我们现在将从小鼠和大鼠皮层培养研究中获得的方法拓展应用于人类NPCs。使用NPCs使我们能够在短短数天内探究疾病相关的表型，并明确不同变量（例如，生长因子、药物）对增殖、迁移和分化等发育过程的影响。最终，这一工具集可被以可重复且高通量的方式用于识别神经发育障碍中的疾病特异性机制和表型。
引言
利用较为简单的生物体和小鼠模型，已阐明了大脑基本发育机制以及疾病发病过程。尽管取得了这些进展，许多神经精神疾病的确切病因仍不明确，因为简单生物体中的研究发现并非都直接适用于人类疾病的复杂方面。此外，人脑更高的复杂性常常使得在动物中模拟人类发育过程和疾病状态变得困难。随着人类诱导多能干细胞（hiPSCs）技术的发展与进步，体细胞可被重编程为干细胞，随后分化为神经元细胞，从而用于研究人类疾病。hiPSCs技术与"组学"技术（基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学）的进步有望彻底改变人们对人类大脑发育的理解。这些技术如今使得以逐例分析为基础，对神经精神疾病进行"精准医学"方式的表征成为可能。
目前，hiPSC疾病建模领域的主流方法是将细胞在单层培养中分化为特定的神经元亚型，或使用一种称为类器官的三维培养系统来模拟大脑发育的某些方面1,2,3。这些系统在研究和揭示人类发育及疾病独特特征方面已显示出极高的价值4,5,6,7
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方案
1. 安全操作规程与生物安全柜的维护
- 生物安全等级2级（BSL-2）安全操作规程
- 遵循所在机构关于操作BSL-2级材料的指导方针。根据机构规定处置BSL-2级材料。明确标识用于BSL-2级材料的房间和设备。穿戴所有个人防护装备（PPE），包括实验服和手套。
- 生物安全柜维护
- 使用经认证可用于BSL-2级材料的生物安全柜。
- 开启生物安全柜内的紫外灯至少15分钟，随后用10%次氯酸钠溶液喷洒表面。让溶液静置15分钟，擦拭柜内表面，并在使用前开启气流。
- 放射性氚标记[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷（氚）安全操作规程
注意：氚属于第5类放射源，即“最不可能造成危险”的类别。操作放射性物质时应遵循所在机构的指导方针。部分机构可能要求具备操作氚的资质认证或许可。- 接受所在机构提供的关于如何正确操作和处置氚的培训。根据机构政策，将放射性废物放入指定的专用容器中进行处置。操作氚时穿戴个人防护装备（PPE）。
2. 从iPSCs进行神经诱导
注意：为制备神经前体细....
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结果
这些研究的一个目标是确定神经前体细胞（NPCs）的增殖活性，即细胞数量的增加。这可通过评估整个细胞群体的DNA合成来实现，该方法是一种高通量技术，通过检测放射性示踪剂氚标记的胸苷掺入细胞提取物的情况，反映所有处于S期的细胞，无论其DNA合成持续5分钟或长达两小时。此外，这些检测还可用于确定进入S期的细胞比例及总细胞数量，这是一种更为耗时的单细胞分析方法。细胞在S期合成DNA，此阶段发生在有丝分裂和细胞分裂之前，而细胞分裂必须发生才能实现细胞数量的增加。由于这些过程需要一定时间，因此在48小时测得的DNA合成变化可能与此时间点的细胞数量变化无直接关联。尽管如此，研究发现，48小时时DNA合成的变化能够可靠地预测第4天和第6天细胞数量的增加。
在评估DNA合成时，将细胞以每孔100,000个细胞（约50%汇合度）的密度接种于24孔板中，并培养48小时后进行检测。采用该细胞密度可确保细胞保持其单层生长环境的特性，同时避免在48小时内因过度增殖导致培养基过酸。.......
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讨论
本文介绍的实验方案展示了利用人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的神经前体细胞快速、简便地研究基本神经发育过程，并检测生长因子和药物作用的方法。hiPSC技术通过使我们前所未有地获得来自患病个体的活体人源神经元细胞，彻底改变了神经发育性疾病发病机制的研究。事实上，已有大量基于hiPSC的神经发育障碍疾病研究，包括雷特综合征（Rett Syndrome）、蒂莫西综合征（Timothy Syndrome）、脆性X染色体综合征（Fragile-X syndrome）和精神分裂症，这些研究揭示了疾病特异性的树突、突触及神经元功能异常4,33,34,35,36。这些研究大多集中于终末分化的、有丝分裂后神经元，尽管这些细胞在功能上仍相对不成熟，但此类研究忽略了对更早期神经发育过程（如细胞增殖和迁移）的探讨。而这些早期过程已被广泛.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由新泽西州州长医学研究与自闭症治疗委员会（CAUT13APS010；CAUT14APL031；CAUT15APL041）、南希·卢里·马克斯家族基金会、Mindworks慈善信托基金以及大都会西部新泽西犹太社区基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 多能干细胞神经诱导培养基： 实验方案链接：https://goo.gl/euub7a | ThermoFischer Scientific | A1647801 | 该试剂盒包含神经基础培养基（NB）和50倍浓缩的神经诱导添加剂（NIS）。NIS用于配制1倍神经诱导培养基和100%扩增培养基 |
| 高级DMEM/F12培养基 | ThermoFischer Scientific | 12634-010 | 100%扩增培养基的组分 |
| 神经基础培养基（Neurobasal Medium） | ThermoFischer Scientific | 21103049 | 神经诱导培养基（NIM）和100%扩增培养基的共同组分 |
| 适用于人胚胎干细胞的Matrigel | Corning | 354277 | 适用于人胚胎干细胞的模拟细胞外基质凝胶（ECM-mimic gel） |
| Y-27632（2HCl），1 mg | Stem Cell Technologies | 72302 | ROCK抑制剂 |
| 6孔板 | Corning | COR-3506 | 聚苯乙烯板，用于神经前体细胞（NPC）的维持培养及神经球迁移实验 |
| 24孔板 | ThermoFischer Scientific | 2021-05 | 聚苯乙烯板：用于NPC DNA合成实验 |
| 35 mm培养皿 | ThermoFischer Scientific | 2021-01 | 聚苯乙烯板：用于NPC S期进入和神经突实验 |
| 天然小鼠层粘连蛋白（Laminin） | Invitrogen | 23017-015 | 包被培养板的基质：用于NPC DNA合成、S期进入及细胞数量测定 |
| 纤连蛋白（Fibronectin） | Sigma | F1141 | 包被培养板的基质：用于神经突实验 |
| 多聚-D-赖氨酸（Poly-D-Lysine） | Sigma | P0899 | 包被培养板的基质 |
| 青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin） | ThermoFischer Scientific | 15140122 | 抗生素，神经诱导培养基（NIM）、100%扩增培养基和30%扩增培养基的组分 |
| StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | 1倍细胞解离溶液 |
| 2.5%胰蛋白酶（10倍浓缩液） | Gibco | 15090-046 | 10倍酶解溶液 |
| 0.5 M EDTA | ThermoFischer Scientific | AM9261 | 用于配制胰蛋白酶溶液，以在DNA合成实验中消化并收集细胞 |
| 氚标记的[3H]-胸苷 | PerkinElmer | NET027E001 | 放射性氚标记的胸苷 |
| Fisherbrand 7 mL HDPE闪烁瓶 | Fisherbrand | 03-337-1 | 用于液体闪烁计数的样品瓶 |
| EcoLite(+) | MP Biomedicals | 0188247501 | 液体闪烁混合液 |
| LS 6500多功能液体闪烁计数仪 | Beckman Coulter | 8043-30-1194 | 液体闪烁计数仪 |
| Skatron半自动细胞收集器，型号11019 | Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. | 半自动细胞收集装置 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor® 488成像试剂盒 | ThermoFisher Scientific | C10337 | EdU及染色试剂盒，用于S期进入实验 |
| 台盼蓝溶液，0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | 用于评估细胞活力 |
| GF/C级滤纸 | GE Healthcare Life Sciences, Whatman | 1822-849 | 玻璃纤维滤纸 |
| 人碱性成纤维细胞生长因子-2（bFGF-2） | Peprotech | 100-18B | 生长因子 |
| 垂体腺苷酸环化酶激活多肽（PACAP-38） | BACHEM | H-8430 | 神经肽 |
参考文献
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).<....
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