方法文章

人脑神经前体细胞神经发育表型的快速检测 (npc)

DOI：

10.3791/56628

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2018年3月2日

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1Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics, Rutgers University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神经发育过程, 如增殖, 迁移和突起的生长, 往往是不安的精神疾病。因此, 我们提出的协议, 快速和重现性评估这些神经发育过程中的人类 iPSC 派生的 npc。这些协议还允许评估相关生长因子和疗法对 NPC 发展的影响。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人类大脑发育通过一系列精确编排的过程进行, 早期的阶段以增殖、迁移和突起为特色;后阶段的特征是轴突/枝晶生长和突触形成。在神经发育紊乱中, 通常有一个或多个过程被打乱, 导致大脑形成和功能异常。随着人类诱导的多潜能干细胞 (hiPSC) 技术的出现, 研究人员现在有大量的人类细胞供应, 可以被区分成几乎任何细胞类型, 包括神经元。这些细胞可以用来研究正常的大脑发育和疾病发病机制。一些使用 hiPSCs 模型神经精神疾病的协议使用晚期分化的神经元或使用3D 的文化系统称为 organoids。这些方法在研究人类疾病发病机制方面已证明是宝贵的, 但也存在一些弊端。hiPSCs 分化为神经元和 organoids 的产生是冗长而昂贵的过程, 可能会影响可以评估的实验和变量的数量。此外, 在有丝分裂后的神经元和 organoids 允许研究与疾病有关的过程, 包括枝晶生长和 synaptogenesis, 它们排除了对早期的过程, 如扩散和迁移的研究。在神经发育紊乱, 如自闭症, 丰富的遗传和验尸证据表明早期发育过程中的缺陷。神经前体细胞 (npc), 一个高度增生的细胞群体, 可能是一个合适的模型, 其中提出问题的发育过程和疾病的启动。我们现在扩展了从研究老鼠和大鼠皮质文化的发展到人类 npc 的方法学。使用 npc 可以让我们调查与疾病有关的表型, 并定义不同的变量 (例如, 生长因子, 药物) 如何影响发展过程, 包括增殖, 迁移, 并在短短几天的分化。最终, 此工具集可用于重现性和高通量的方式, 以确定神经发育紊乱疾病的特定机制和表型。

引言

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使用简单的有机体和老鼠模型阐明了基本的大脑发展和疾病发病机制。尽管有这些进展, 许多精神疾病的病因仍然难以捉摸, 因为并非所有的研究结果都与人类疾病的复杂方面直接相关。此外, 人脑的更大复杂性往往使人的发育和动物疾病的建模变得困难。随着人类诱导多潜能干细胞 (hiPSCs) 技术的发展和发展, 体细胞可以重新编程成干细胞, 然后分化为神经细胞来研究人类疾病。hiPSCs 和 "涨价可能" 技术的进步 (基因组学、转录组学、蛋白质组学、新陈代谢) 有望彻底改变人类大脑发育的认识。这些技术现在可以在个案的基础上对神经精神疾病的特征进行 "精确医学" 处理。

目前在 hiPSC 疾病建模领域的主要内容是将细胞分化成单层的特定神经元亚型, 或者使用一个叫做 organoid 的3D 培养系统来重述大脑发育的各个方面1,2, 3。这些系统在研究和揭露人类发展和疾病的独特方面非常有价值4,5,6,7。然而, 在他们准备学习之前, 神经元文化和 organoids 通常需要从几周到几个月的文化。这些协议的耗时性和维护这些文化系统所需的资源量常常限制可以进行的实验数量和可测试的变量 (如生长因子或药物) 的数量。此外, 许多利用有丝分裂后神经元和 organoids 的研究都集中在后来的发展过程, 如枝晶突起或突触形成。虽然这些过程牵涉到发育紊乱的病理学, 如自闭症和精神分裂症, 早期的发展事件发生之前, 明确的神经元分化也重要的疾病发病机制8 ,9,10,11,12,13。事实上, 最近的基因组研究表明, 由增殖、过程和迁移组成的中胎儿期在自闭症发病机制中尤为重要11,14。因此, 研究神经干细胞和祖细胞群, 以更好地了解这些早期的过程是很重要的。Organoid 系统由于其3D 性质和组织结构而被认为可以更好地概括人脑发育, 但它包含了一个前体池, 用于研究这些早期事件。然而, organoids 的祖群往往稀疏, 更像是径向胶质细胞, 而不是神经干细胞或祖细胞5,15。因此, 有一个高吞吐量的方法来研究神经发育在积极增殖细胞的早期阶段是有益的。

在实验室中, 我们创建了一个使用 hiPSC 神经前体细胞 (npc) 的协议, 一个神经干细胞和祖细胞的混合种群, 高度增生, 以研究神经发育过程, 如增殖、细胞迁移和初始过程 (突起) 扩展。这些化验是从我们实验室使用的技术中开发的, 数十年来成功地研究了老鼠和老鼠皮层培养的神经发育 16, 17, 18, 19, 20, 21,22,23。重要的是, 它还表明, 在鼠和小鼠培养系统中定义的表型和调控信号是高度预测的机制, 是活跃的在体内, 表明这些技术的价值16, 17,18,19,24。在 hiPSCs 与 npc 的初步分化之后, 这些方法使我们能够在几天内研究重要的发育过程。这些方法有许多优点: (1) 它们需要很少的复杂设备, 易于实现, (2) 可以在短时间内进行大量的实验复制, 从而快速确认结果的重现性, (3)培养变量, 如涂层基质, 生长因子的影响, 药物的活性, 可以快速和经济高效地测试。此外, 我们利用细胞外生长因子作为不同发育过程的关键调控者的良好作用。npc 被暴露在选择发展信号, 直接刺激诸如扩散, 突起和细胞迁移等事件, 并发现它们增强了识别在控制条件下不明显的缺陷的能力19,25,26,27,28. 同样, 评估药物的容易性为采用精确的医学技术来测试各种治疗干预措施的功效提供了有力的途径。因此, 本议定书促进了高通量、重现性和直截了当的方法, 研究早期大脑发育、疾病发病机制以及生长因子和药物对神经发育表型的潜在有益影响。

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方案

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1. 安全程序和生物安全柜维护

  1. 生物安全 Level-2 (BSL-2) 安全程序
    1. 遵循该机构的指导方针, 使用 BSL-2 材料。根据机构的做法处理 BSL-2 材料。标明用于 BSL-2 材料的房间和设备。佩戴所有个人防护用品 (PPE), 包括实验室外套和手套。
  2. 安全柜维护
    1. 使用 BSL-2 级材料认证的生物安全柜。
    2. 在生物安全柜中打开 UV 光, 至少15分钟, 然后用10% 漂白剂溶液喷洒表面。允许漂白液坐15分钟, 擦拭橱柜, 在使用前打开气流。
  3. 放射性氚 [3H]-胸苷 (氚) 安全规程
    注: 氚是5类放射源, "最不可能是危险的" 类别。遵循该机构的指导方针, 以处理放射性物质。一些机构可能需要认证或许可证来处理氚。
    1. 接受机构关于如何正确处理和处理氚的培训。根据该机构的政策, 在适当的贮器中处理放射性废料。使用氚时要佩戴 PPE。

2. iPSCs 神经诱导

注意: 要制作 npc, 遵循了一个商业上可用的神经感应套件的协议的略微修改版本。该套件由 Neurobasal (NB) 介质和50x 神经感应补充 (NIS) 组成, 用于制造1x 的神经感应介质 (尼姆)。NIS 还用于制作100% 扩展介质 (参见第3.1 节)。在 "材料和设备和参考" 部分43中找到了指向该协议的链接。

  1. 通过 iPSCs, 当他们成为 70-80% 汇合。
  2. 板 30万 iPSCs 成1井的人类胚胎干细胞合格的胞外基质模拟凝胶 (ECM 模拟凝胶) 涂覆6井板含2毫升无馈线 iPSC 介质与5微米的岩石抑制剂。请参阅第3.2 节, 以了解与 ECM 模拟凝胶涂层井的说明。
  3. 一天后, 删除 iPSC 中 + 岩石抑制剂和洗涤 iPSCs 一次与 1x PBS。在 iPSCs 中加入2毫升的尼姆。
    注:50 毫升的尼姆是通过增加1毫升的 50x NIS 和250µL (50 单位/毫升, 5 ul/毫升) 青霉素/链霉素 (P/秒) 到49毫升的 NB 介质。
  4. 每2天通过吸花培养基和2毫升的尼姆替换神经感应介质, 直到细胞汇合 (约 4-5 天)。每天改变媒体, 一旦细胞汇合。
  5. 通过细胞后7天在尼姆和板成一个 ECM 模拟凝胶涂层6井板包含2毫升100% 膨胀介质和5微米岩石抑制剂。这些细胞被认为是通过 0 (P0) npc 在这一点上。有关制作100% 个扩展媒体的说明, 请参见下面3.1 节。
  6. 通道细胞使用3.4 节中描述的方法。等待, 直到细胞达到 P2, 并在游离前汇合, 以染色的 NPC 标志和电镀的实验 (图 1)。

3. 文化媒体、涂层和 npc 的维护

  1. 媒体准备维护 npc (100% 扩展媒体):
    1. 将24.5 毫升的 DMEM/F12 与24.5 毫升的 NB 组合, 使50毫升100% 的膨胀介质。
    2. 将1毫升 50x NIS 添加到 DMEM/F12 + NB 溶液中。将 P/S 解决方案的 250 ul 添加到介质中。
      注: 介质可以冷藏 (4 °c), 使用时间可达2周。通过使用与50毫升体积相同的比率调整 DMEM/F12+ NB + NIS 的容量, 可以进行较小数量的介质。
  2. NPC 维护用 ECM 模拟胶膜培养板的研制
    1. 整除 ECM-模拟凝胶的体积需要, 使6毫升的工作解决方案。通过查看分析表的证书来计算整除体积, 因为 ECM 模拟凝胶稀释因子从批次到批次和批号不等。
    2. 在冰上解冻一个 ECM 模拟的凝胶整除, 溶解成6毫升的冷 DMEM/F12 介质。
    3. 在6井板的每一个井中加入1毫升的 ECM 模拟 gel/DMEM/F12 溶液。用 ECM 模拟凝胶溶液在37摄氏度孵育6井板, 30 分钟。
    4. 吸入 ecm-模拟凝胶溶液后30分钟孵化和更换100% 膨胀介质或冷藏板 (4 °c, 1 周) 没有吸入 ECM 模拟凝胶溶液。
  3. 维护 npc
    1. 将150万个细胞密度的平板 npc 变成一个 ECM-模拟凝胶涂层井, 其中含有2毫升100% 的膨胀介质。
    2. 在湿润环境中孵化37摄氏度的 npc, 5% CO2。
    3. 将5微米的岩石抑制剂添加到培养基中, 用于 P3 或下部的 npc, 或用于解冻的 npc, 以防止过多的细胞死亡。更换介质24小时后, 去除岩石抑制剂。
    4. 通道细胞每 4-9 天, 取决于当他们成为汇合。细胞被认为是汇合的, 当他们成为一个密被包装的单层覆盖整个底部的盘子表面。
    5. 板 npc 在密度为1到150万个细胞每一个井6井板 (参见部分 3.4)。每48小时移除所用介质, 并用2毫升100% 扩展介质替换。
  4. 试验条件下的维护和/或电镀的升力、离解和颗粒 npc
    1. 吸入培养基, 用 1x PBS 冲洗细胞一次。吸入 PBS, 并将 500 ul 1x 细胞脱离溶液加入1井汇合的 npc 中. 在37摄氏度孵育10分钟。
    2. 添加 500 ul 室温 (RT) PBS 和洗井使用 P-1000 吸管, 以确保清除细胞。收集细胞 + PBS 溶液成15毫升圆锥管。再用1毫升的 PBS 冲洗盘子, 然后将液体添加到管子里。
    3. 在 300 x g 处旋转细胞以5分钟为颗粒。
    4. 从细胞颗粒中取出上清, 并在预热的 DMEM/F12 培养基中重新悬浮细胞1-5 毫升。稀释细胞密度为1到400万细胞/毫升的培养基。使用 hemocytometer 量化细胞。
    5. 板所需的细胞数, 具体为 NPC 维护 (3.3 节) 或进行的个别化验 (见下文各节以了解更多细节)。
    6. 调整细胞悬浮容量与媒介, 因此在15到 100 ul 之间细胞为每个井或盘使用。这种小的电镀量可以确保细胞分布均匀, 培养基中的生长因子、药物或基质不会被稀释。
    7. 孵育细胞在37摄氏度。每48小时更改媒体以进行 NPC 维护或查看个别化验的具体细节。
  5. 实验条件介质准备 (30% 扩展介质)
    1. 将100% 扩展介质稀释 70% (称为30% 扩展), 添加 1:1 DMEM/F12 + NB 溶液, 使介质成为实验条件。
    2. 通过增加6毫升100% 膨胀介质, 并稀释7毫升的 NB 和7毫升的 DMEM/F12 介质, 使20毫升30% 的膨胀介质。添加5µL/毫升溶液。
      注: 如果100% 介质已经包含 p/秒, 则添加 5 ul/毫升为组合 DMEM/F12+ NB = (14 毫升) x (5 ul/毫升) = 70 ul 的 P/s 而不是100µL。
    3. 添加涂层基质和生长因子在所需浓度的30% 膨胀介质。

4. 评估 DNA 合成、s-相位输入和 npc 细胞数

  1. DNA 合成、s-相输入和细胞数测定的制备
    1. 在 dH2O 上制作1毫克/毫升的聚 d-赖氨酸 (PDL) 溶液, 过滤杀菌。在 dH2O 中稀释1:10 以制作0.1 毫克/毫升的 PDL 解决方案, 并将 300 ul 添加到24个井板或1毫升的每个井中, 到 35 mm 的盘子中。在 RT 孵化20分钟。
    2. 用 dh2o 吸出 dh2O, 并在 1x PBS 中添加 300 ul/阱或1毫升/层粘连蛋白 (5 微克/毫升), 以5分钟洗净 PDL 井3次。用 parafilm 盖住盘子, 并将其保存在无菌的生物安全柜中过夜 (12 至24小时)。
    3. 准备30% 扩展介质 (参见第3.5 节), 12 到24小时后, 在总溶液的不到10% 的容量中添加车辆、生长因子或感兴趣的药物, 以避免在30% 扩展介质中稀释 NIS。
    4. 用 1x PBS 清洗24井板的每一个井 (每两个5分钟)。吸 1x PBS 和添加 450 ul 的媒体 (没有或与药物/生长因子)。在电镀细胞前至少15分钟孵育37摄氏度的板材。
    5. 每个实验, 设置 2-3 水井或菜肴的每一个条件。
    6. 板块 npc (见3.4 节):
    7. 鼻咽癌 DNA 综合检测:24 井板中10万细胞/井
    8. s-相输入: 50万 cells/35 mm 菜
    9. 细胞数测定:24 井板中5万细胞/井
  2. 神经前体细胞 DNA 合成法
    1. 板10万细胞/井在24井板和评估三个/条件。
    2. 增加放射性, 氚 [3H]-胸苷到培养基 (1.5 μCi/毫升) 在每个井在 46 H 以后在文化中。孵育细胞在37°c 2 小时。
      注: 使用放射性材料时, 接受机构的培训, 遵守放射性安全规程, 并在适当指定的废物贮器中处理放射性物质。
    3. 2小时后, 清除并妥善处置放射性介质, 将 300 ul 预热0.25% 胰蛋白酶-EDTA (0.5 毫米), 并在20摄氏度孵育37分钟。
    4. 打开电池收割机 (见材料和设备部分) 和泵, 确保泵的压力低于 200 PSI。将滤纸穿过细胞收割机的空间, 撕下右角以标记纸张方向。
    5. 将细胞收割机的采集管放入空的 "空白" 托盘中, 按 prewash 润滤纸。将收集管放入样品井并运行 (启动)。
    6. 当细胞收割机完成收集样品, 升降机钳和提前过滤纸重复所有样品集。总是 prewash 在空的 "空白" 盘子里。
    7. 在光源下干滤纸, 并在托盘中设置相应的瓶子。把纸绯闻成小瓶, 在每个瓶子里加2毫升液体闪烁鸡尾酒。瓶盖和标签瓶。
    8. 在闪烁机上每分钟计数 (CPMs) 之前, 至少1小时在液体闪烁鸡尾酒中孵化小瓶。
  3. NPC S 相进入试验
    1. 有关解除、分离、颗粒和重新挂起单元格的步骤, 请参见3.4 节。
    2. 每道盘子50万个细胞进入 35 mm 的菜肴中, 4.1 节, 只有1道菜/条件为这一步。
    3. 在各个方向来回搅拌菜肴, 以确保细胞的均匀分布。孵育细胞在37°c 46 小时。
    4. 在24小时后, 每一个条件下, 准备三35毫米覆盖的 PDL/层粘连板。例如, 如果有一个35毫米碟30% 扩展媒体和一个35毫米盘30% 扩展媒体 + (10 ng/毫升), 然后大衣 6 PDL/层粘连蛋白板, 供第二天使用。
    5. 添加 2 ul/毫升5毫米的培养到文化46小时后孵化为2小时。
    6. 分离和颗粒细胞 (见3.4 节)。在3毫升的30% 膨胀介质或3毫升30% 膨胀培养基 + 所需生长因子/药物中重新悬浮细胞颗粒。
    7. 每盘1毫升的预涂的 PDL/层粘连蛋白菜肴。在各个方向来回搅拌菜肴, 以确保细胞的均匀分布。孵育在37°c 2 小时, 让细胞坚持到菜。有关简化的时间线, 请参见图 2 。
  4. s-相位输入分析
    1. 用冰冷4% 多聚甲醛 (1x PBS 中的粉煤灰) 固定菜肴20分钟。然后, 用 1x PBS 洗盘子3次, 5 分钟。
    2. 添加1毫升的 1x PBS 与0.05% 叠氮化钠, 以防止细菌和真菌的生长。如果在 PBS + 叠氮化钠溶液中保存有盘子 (parafilm), 即使不是所有的免疫抗原都保存完好, 但在长时间的延迟分析后, 细胞可以储存在4摄氏度, 长达6月。
    3. 使用商业专业反应试剂盒检测细胞 (见制造商的协议)。染色细胞使用 DAPI 或其他核标记, 和图像使用荧光显微镜。
    4. 在10系统随机场 (10x) 中, 评估在总活细胞 (总细胞数) 失明的教育局阳性细胞比例。不要在分析中包括死细胞。
    5. 利用相位对比图像和荧光图像确定阳性的免疫染色, 确定哪些细胞死亡或活着 (图 3)。
    6. 通过荧光 DAPI 核染色, 计数所有具有平滑和均匀细胞膜的细胞, 以及一个大的不分段核, 这些细胞是活的 (图3A-b).
    7. 排除所有相明亮的细胞, 有一个破碎的不均匀细胞膜, 并有一个小的, 凝聚核可视化的 DAPI 荧光成像, 因为这些细胞是死的 (图 3A-B)。通过识别具有明亮荧光的细胞, 覆盖整个细胞核或斑点荧光染色的细胞核 (图 3C), 评估活细胞的表达。
  5. 鼻咽癌细胞数测定
    1. 经过2天的文化, 标签和准备1.5 毫升离心管和0.5 毫升离心管。在每0.5 毫升管, 添加 5 ul 的台盼蓝。
    2. 对24井板的每一个井, 去除媒介和增加 200 ul 1x 细胞分离解决方案并且安置在孵化器里为10到15分钟。
    3. 在分配的时间后, 一旦细胞解除, 增加所需数量的 1x PBS 的每一个井。
      注: 一般情况下, 在2天, 添加 300 ul 1x PBS 到包含的井单元加上 200 ul 的支队解决方案, 总容积 500 ul。随着培养时间的增加, 细胞变得更加汇合, 必要时增加稀释量。例如, 在4天, 添加 500 ul 1x pbs, 并在6天, 添加 800 ul 1x pbs。总容量将分别为 700 ul 和1毫升。
    4. 使用 P-1000 吸管, 在每个井中向上和向下的吸管4到5次, 以去除细胞。检查显微镜下的板, 以确保所有细胞分离。将细胞转移到1.5 毫升管。
    5. 反转1.5 毫升管与稀释细胞2到3倍。然后采取 50 ul 整除细胞从管内和增加到0.5 毫升管与台盼蓝 (见 4.5.1)。
    6. 吸管细胞溶液上下2到3倍。将单元格添加到 hemocytometer 并立即进行分析。等待长于10分钟可能会增加细胞死亡或细胞的存在, 占去了盼蓝。
    7. 小心地将10µL 的细胞 + 台盼蓝混合物添加到 hemocytometer 的每一侧, 以执行复制计数。使用相衬显微镜对细胞计数。不要计算死细胞或深蓝色细胞占去了盼蓝。
    8. 要获取总单元格数, 请使用从 hemocytometer 的4个角计数的平均单元格数, 并应用以下公式:
      平均细胞数 x 介质体积 (mL) x 1万 = 总细胞数/井
    9. 在剩余的水井上抽吸并重复这个过程。更改未计数的单元格上的介质, 每48小时重复检测 4 & 6 天。

5. 全国人大突起化验

  1. 突起试验用碟和培养基的制备
    1. 在 dH2O 上制作1毫克/毫升的聚 d-赖氨酸 (PDL) 溶液, 过滤杀菌。在 dH2O 中稀释1:10 以制作0.1 毫克/毫升的 PDL 解决方案, 并在每 35 mm 盘中添加1毫升。在 RT 孵化20分钟。
    2. 同时, 准备30% 扩展介质 (见3.5 节), 并在介质中添加5微克/毫升 (5 µL/毫升) 纤维连接蛋白溶液 (1 毫克/毫升)。
    3. 一旦媒体准备就绪, 添加车辆, 生长因子, 或药物的兴趣, 在预期的浓度。
      注: 最好是添加车辆, 生长因子, 或药物, 在总量 < 10% 的总解决方案, 以避免稀释纤维连接蛋白和其他组件的30% 膨胀介质。
    4. 20分钟后, 用 dH2O 洗净 pdl 菜肴3次, 以去除多余的 pdl。在添加介质前, 确保菜肴干燥。
    5. 放置1毫升的介质 (有或没有药物/生长因子) + 纤维连接蛋白溶液到每一个 PDL 涂装皿。
    6. 在电镀细胞前至少30分钟孵化37摄氏度的菜肴, 以确保纤维连接件正确附着在 PDL 上。
    7. 每项试验, 每种条件设置 2-3 个菜肴 (例如, 3 辆含车菜肴, 3 个含药菜肴)。
  2. 突起检测用电镀 npc
    1. 有关提升、离解、颗粒和并用重悬细胞的步骤, 请参见3.4 节。
    2. 每盘5万片, 放入5.1 节中的菜肴中。在各个方向来回搅拌菜肴, 确保细胞均匀分布。
    3. 孵育细胞在37°c 48 小时。
  3. 突起分析
    1. 孵化后的细胞为48小时, 吸入培养基, 并固定的菜肴与冰冷4% 粉煤灰20分钟。
    2. 20分钟后, 用 1x PBS 洗盘子3次5分钟。最后清洗后, 添加1毫升 1x PBS 与0.05% 叠氮化钠。
    3. 在32X 的相位对比显微镜上盲目地分析盘子。计算总细胞和细胞与突起在 3, 1 厘米行, 随机选择, 但可重复的位置。每道菜最少要计算150个细胞, 以确保足够的取样。
      注意: 突起被定义为一个扩展 (过程) 从细胞体, 是 > 2 细胞体直径长度。对于具有多个进程的单元格, 为该条件考虑最长的过程。不包括具有 < 2 个单元直径长度的进程的单元格 (图 4)。
    4. 将每道菜中的细胞总数和细胞总数加在一起突起。用突起计算单元格的百分比。在复制菜肴中平均突起细胞的百分比。当每道菜中的所有行都相似时, 对实验重现性的信心就会建立, 而菜肴中的平均值是非常相似的, 标准误差为平均值 (SEM) < 10%。
    5. 或者, 通过对诸如β III-蛋白 (TUJ1) 或 MAP2 等标记进行免疫细胞化学分析突起。染色后的兴趣标记, 采取10系统随机图像在荧光显微镜10X。图像至少有200个细胞。在这种情况下, 获取图像不太接近菜的边缘。分析具有 TUJ1 或 MAP2+ 突起的单元格的百分比 (请参见图 10中的示例)。

6. NPC 干细胞迁移试验

  1. 干细胞形成
    1. 将1毫升100% 膨胀介质添加到35毫米的盘中, 无涂层衬底。在电镀 npc 之前, 在37摄氏度前孵化至少15分钟的菜肴. 准备 2-3 菜, 以确保有足够的 neurospheres 细胞迁移化验。
      注意: 如果没有涂层衬底, 就可以确保 npc 在介质中保持悬浮状态, 这对于干细胞的形成是必不可少的。涂装皿可防止干细胞的形成。
    2. 有关提升、离解和颗粒细胞的步骤, 请参见3.4 节。并用重悬细胞颗粒在2-5 毫升预热的100% 膨胀介质中。板材100万个 npc 入每个35毫米菜准备在部分6.1.1。
    3. 孵育 npc 在37°c 为48到 96 h 允许 npc 聚合和形成 neurospheres。使用相衬显微镜上的带电标尺评估球体尺寸。等待大多数球体达到大约直径100µm (20 微米) (图 5)。在迁移试验中, 较小的球体会完全分散和分离。
  2. 干细胞迁移试验用板材的制备
    1. 溶解 ECM 模拟凝胶整除数 (见3.2 节) 成6毫升的30% 膨胀介质。一旦 ECM 模拟 gel/30%expansion 介质解决方案准备就绪, 添加车辆, 生长因子, 或药物的利益, 在预期的浓度。
      注: 需要增加车辆、药物和生长因子浓度, 以便在6.3 节中添加200µL neurospheres。
    2. 1毫升的 ECM-模拟凝胶/30% 膨胀介质溶液 (* 车辆, 生长因子, 或药物) 成一个井的6井板。每实验条件下要制造 2-3 井。或者, 可以使用 35 mm 的菜肴。孵育板至少30分钟在37°c.
      注意: 不要吸入 ECM 模拟 gel/30%expansion 介质解决方案进行此检测。电镀球体上的吸气 ECM 模拟凝胶将导致快速和过剩的迁移。
  3. 电镀 Neurospheres
    1. 收集在6.1 节形成的 neurospheres, 并将它们放入锥形管中。用1毫升 1x PBS 清洗35毫米菜肴, 以确保收集所有 neurospheres。将收集的 neurospheres 在 100 x g 处旋转5分钟。
    2. 在预热的30% 扩展介质中重新悬浮 neurospheres 1-3 毫升。如果收集了1碟 neurospheres, 1 毫升的介质被用来并用重悬球体。如果收集2个菜肴, 2 毫升的介质添加到并用重悬球体,等吸管轻轻地, 只使用一个 P-1000, 以确保球体没有打破。
    3. 板 200 ul 的悬浮 neurospheres 进入 ECM 模拟 gel/30%expansion 解决方案6.2 节。所有方向的岩石板块均匀分布 neurospheres。在37°c 上孵化48小时的板材.
    4. 删除 ECM 模拟 gel/30%expansion 介质解决方案, 并修复4% 粉煤灰中的细胞, 洗涤, 并保持细胞在 1x PBS + 0.05% 叠氮化钠。
  4. Neurospheres 分析
    1. 使用10X 的相位对比度设置获取整个 neurospheres 的图像。确保球体不会相互接触。使用 ImageJ 软件测量平均迁移。
    2. 使用手绘线工具跟踪干细胞的外部轮廓。可以通过右键单击 "直线" 图标来访问手绘线。使用鼠标手动跟踪。
    3. 使用度量函数计算跟踪的区域。确保在 "分析" 选项卡下的 "设置测量" 窗口中选择 "区域" 作为读出。有关蓝色外部轮廓的跟踪, 请参见图 6 。
    4. 跟踪球体的内部细胞质量和测量区域。有关红色内轮廓的跟踪, 请参见图 6 。通过从总干细胞面积中减去内部细胞质量来量化平均迁移。
    5. 测量 neurospheres, 它以连续的地毯 (图 6) 的方式显示一个密被包装的内部单元格体。
    6. 请勿在地毯外包括单元格或从干细胞中分离出来进行测量。有关从外部地毯测量中排除的单元格 (白色圆圈) 的示例, 请参见图 6 。分析每种情况下的最小 20 neurospheres。

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结果

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这些研究的目的之一是确定 npc 的增殖活动, 即细胞数量的增加。这是通过评估 DNA 合成的总细胞总数, 一个高通量的方法, 测量将放射性示踪剂氚胸苷纳入细胞提取物, 并反映所有从事 s-阶段的细胞, 无论是合成5分钟或整整两个小时。此外, 这些化验可以确定进入 S 相和总细胞数的细胞比例, 一种更劳动密集型的单细胞检测。细胞在 s-阶段合成 DNA, 这是有丝分裂和细胞分裂之前的一步, 必须发生以增加细胞数。由于这些过程需要一段时间, DNA 合成的变化估计在48小时可能不会与细胞数量的变化在这个时间点。尽管如此, 发现 DNA 合成在48小时内的变化可靠地预测4和6天内细胞数量的增加。

在评估 DNA 合成时, 细胞的密度为10万细胞 (~ 50% 汇合) 在24井板, 并允许生长48小时前进行测量。使用这种密度可以确保细胞类似于它们的单层环境, 但也不会在48小时内迅速生长, 以至于培养基变得太酸性。酸性太强的培养基会显著影响细胞的新陈代谢, ...

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讨论

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这里提出的协议说明了快速和简单的方法来研究基本神经发育过程和测试生长因子和药物使用 hiPSC 衍生神经前体细胞。hiPSC 技术已经革命性的研究神经发育疾病的发病机制, 为我们提供了前所未有的机会, 从受影响的人的活体神经细胞细胞。事实上, 已经有许多 hiPSC 研究的神经发育紊乱, 包括 Rett 综合征, 蒂莫西综合征, 脆性 x 综合征, 精神分裂症, 发现了疾病特异的畸变在树突, 突触和神经元函数4,33,34,35,36。大多数这些研究主要集中在晚期分化的后有丝分裂神经元, 虽然认为相对功能不成熟, 排除了研究早期神经发育过程, 如增殖和迁移。这些后处理已严重牵连神经发育紊乱的发病机制, 并保证进一步研究8,

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明他们没有竞争的财政利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了新泽西州州长自闭症医学研究和治疗委员会 (CAUT13APS010) 的支持;CAUT14APL031;CAUT15APL041), 南茜. Mindworks 标志着家庭基金会, 慈善领导信任, 以及更大 MetroWest 新泽西州的犹太社区基金会。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PSC 神经诱导培养基：
实验方案链接： https://goo.gl/euub7a 		ThermoFischer ScientificA1647801这是一个由 Neurobasal （NB） 培养基和 50x 神经诱导添加剂 （NIS） 组成的试剂盒。NIS 用于制备 1X 神经诱导培养基和 100% 扩增培养基
Advanced DMEM/F12 培养基ThermoFischer Scientific12634-010100% 扩增培养基的成分
Neurobasal 培养基ThermoFischer Scientific21103049NIM 和 100% 扩增培养基的成分 
经 hESC 验证的 MatrigelCorning354277经 hESC 验证的细胞外基质模拟凝胶（ECM 模拟凝胶） 
Y-27632 （2HCl），1 mgStem Cell Technologies72302ROCK 抑制剂
6 孔板康宁COR-3506聚苯乙烯板，用于 NPC 维持和神经球迁移测定 
24 孔板ThermoFischer Scientific2021-05聚苯乙烯板：用于 NPC DNA 合成测定
35 mm 培养皿ThermoFischer Scientific2021-01聚苯乙烯板：用于 NPC S 期进入和神经突测定
天然小鼠层粘连Invitrogen23017-015包被板底物：用于 NPC DNA 合成、S 期进入和细胞计数测定
SigmaF1141底物：用于神经突测定 
聚-D-赖氨酸SigmaP0899用于包被板的底
青霉素/链霉素ThermoFischer Scientific15140122抗生素，NIM 的成分，100% 膨胀和 30% 膨胀培养基 
StemPro AccutaseGibcoA11105-011X 细胞分离溶液 
2.5% 胰蛋白酶 （10X）Gibco15090-04610X 酶溶液
0.5 M EDTAThermoFischer ScientificAM9261用于胰蛋白酶溶液中，用于提升细胞进行 DNA 合成测定
氚化 [3H]-胸苷PerkinElmerNET027E001放射性氚、胸苷
Fisherbrand 7 mL HDPE 闪烁样品瓶Fisherbrand03-337-1液体闪烁计数样品瓶
EcoLite（+）MP Biomedicals0188247501 液体闪烁鸡尾酒
LS 6500 多用途液体闪烁计数器Beckman Coulter8043-30-1194液体闪烁计数器
Skatron 半自动细胞收集器 11019 型器件 &Skatron Instruments， Inc. 公司半自动细胞采集仪
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 成像试剂盒ThermoFisher ScientificC10337EdU 和用于 S 期进入测定的染色试剂盒
台盼蓝溶液，0.4%ThermoFisher Scientific15250061评估细胞活力
等级 GF/C 滤纸GE Healthcare Life Sciences，Whatman1822-849玻璃纤维滤纸
人碱性 FGF-2Peprotech100-18B生长因子
垂体腺苷酸环化酶激活多肽 （PACAP-38）BACHEMH-8430神经肽
蛋白 用于涂层板的纤连蛋白 物 分子

参考文献

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