体外 SUMO化检测法用于研究SUMO E3连接酶活性

摘要

与泛素连接酶不同，目前已鉴定的E3 SUMO连接酶数量较少。这种修饰 体外 SUMO化实验方案能够通过以下方法鉴定新的SUMO E3连接酶 体外 重建实验

摘要

小泛素样修饰（SUMO）是一种重要的翻译后修饰（PTM），主要通过调节蛋白质-蛋白质相互作用来介导信号转导。与泛素化修饰类似，SUMO化修饰由一系列级联酶反应催化完成，包括E1激活酶（SAE1/SAE2）、E2结合酶（Ubc9）和E3连接酶（即，PIAS家族、RanBP2和Pc2）。然而，与泛素化不同，SUMO修饰反应并不必需E3连接酶，但E3连接酶可提高修饰的精确性和效率。经SUMO修饰的蛋白质可通过以下方法鉴定 体内 通过使用底物特异性抗体进行免疫沉淀，再结合SUMO特异性抗体进行免疫印迹来检测。然而，证明蛋白质SUMO E3连接酶活性需要 体外 使用纯化的酶、底物和SUMO蛋白重建SUMO化反应体系。由于在 体外 反应通常仅需 SAE1/SAE2 和 Ubc9 即足以实现 SUMO 结合，但由假定的 E3 连接酶增强的 SUMO 化修饰并不总是易于检测。在此，我们描述了一种改良的 体外 使用该SUMO化实验方案可稳定鉴定SUMO修饰 体外 重建系统。本文还提供了一步一步纯化具有催化活性的K-bZIP（一种病毒性SUMO-2/3 E3连接酶）的实验方案。所纯化的K-bZIP对p53（SUMO的一个已知靶蛋白）的SUMO化活性得到了展示。该方案不仅可用于鉴定新的SUMO E3连接酶，还可用于揭示其对SUMO旁系同源蛋白的特异性。

引言

SUMO 修饰最初被确定为一种可逆的翻译后修饰（PTM），可调控蛋白质稳定性¹除了直接共价连接外，SUMO 还可通过 SUMO 相互作用基序（SIMs）以非共价相互作用的方式结合到蛋白质上。²与含有Src同源2（SH2）或磷酸酪氨酸结合（PTB）结构域的分子对酪氨酸磷酸化的结合类似^3,4SUMO修饰为含有SIM结构域的效应蛋白提供了额外的相互作用平台，从而实现选择性招募^5,6除了调控信号转导外，转录因子和染色质重塑分子的SUMO化修饰也参与调控基因表达^7,8. 全基因组范围的SUMO化模式研究表明，SUMO修饰与正向调控相关^9,10 或阴性^10,11,12 转录调控，部分原因是SUMO化修饰具有旁系同源特异性。

哺乳动物细胞中存在三种主要的SUMO蛋白偶联异构体，分别为SUMO-1以及高度同源的SUMO-2和SUMO-3（统称为SUMO-2/3）¹³。SUMO通常共价连接至靶蛋白中保守序列基序ψKxD/E内的赖氨酸（K）残基上。SUMO E3连接酶中的SIM结构域负责介导其对SUMO旁系同源物的特异性识别¹⁴。与含有数百种E3连接酶的泛素化通路不同，目前仅发现少数几种SUMO E3连接酶¹⁵。SUMO E3连接酶的定义特征包括其具备以下能力：(i) 结合Ubc9，(ii) 通过SIM结构域结合SUMO基团，以及(iii) 促进SUMO从Ubc9向底物蛋白的转移。尽管SUMO偶联反应并非绝对依赖E3连接酶¹⁶，但E3连接酶可提供底物特异性和SUMO旁系同源物的选择性。由于通常仅有少量靶蛋白发生SUMO修饰，因此在活体（in vivo）条件下检测SUMO化蛋白始终是一项挑战。因此，需要准确且可重复的实验方法，以阐明SUMO修饰的确切功能。

该 体外 SUMO化检测，即评估纯化的Ubc9催化底物蛋白SUMO化能力的实验，是研究SUMO修饰的公认方法¹⁷然而，由于存在大量Ubc9，大多数情况下无法检测到SUMO E3连接酶活性，或仅能通过标准方案检测到具有高SUMO E3连接酶活性和低底物特异性的突变型SUMO连接酶的活性¹⁸该实验的整体成功在很大程度上取决于对纯化Ubc9的精确滴定。 体外 此处描述的SUMO化检测方法是在标准SUMO化实验方案基础上改进而来的（参见 材料表Kaposi肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）再激活过程中观察到全局SUMO化修饰增强，促使我们鉴定可能介导SUMO化上调的病毒SUMO E3连接酶。通过对病毒SUMO E3连接酶K-bZIP相互作用蛋白的小规模筛选，发现p53是一种新的底物。在本实验方案中，我们详细展示了在昆虫细胞中表达和纯化具有SUMO-2/3特异性的野生型K-bZIP（一种病毒SUMO E3连接酶）的步骤。通过在E1和E2酶用量减少的条件下，评估纯化的K-bZIP增强已知SUMO底物p53的SUMO化能力。利用这种改良的SUMO化检测方法，研究人员可可靠地确定SUMO E3连接酶对新或已知底物进行SUMO化的功能，这是蛋白质SUMO化研究中的首要步骤。此外，该方法有助于鉴定具有低连接酶活性但高底物特异性的新型SUMO E3连接酶。

方案

1. 杆状病毒表达载体的制备

1. 通过将 K-bZIP 的 cDNA¹⁹ 克隆到带有 N 端表位标签的双表达杆状病毒载体中（参见材料表），纯化 SUMO E3 连接酶 K-bZIP。我们已成功使用八肽标签（在本方案中始终表示为载体-标签-K-bZIP）。
   注意：用于 K-bZIP 聚合酶链式反应（PCR）克隆的 DNA 模板，是经多西环素处理后从 TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 细胞中分离的 RNA 反转录得到的 cDNA²⁰。
   1. 将全长 K-bZIP cDNA¹⁹ 转入含有 CpoI 克隆位点的双表达载体中。用 CpoI 在 37 °C 条件下消化 PCR 产物和 1 µg 双表达载体，反应 3 h²¹。
   2. 在 0.8% 琼脂糖凝胶上电泳后分离并提取消化后的 DNA²²。按照制造商说明（参见材料表），使用 T4 DNA 连接酶在 16 °C 条件下连接插入片段（K-bZIP）与载体，反应 30 min。
   3. 将 5 µL 连接产物加入含 50 µL 感受态 E. coli 细胞 "A" 的 1.5 mL 离心管中（参见材料表），冰浴 30 min。随后将离心管置于 42 °C 水浴中孵育 45 s，立即放回冰上冷却 3 min。
   4. 向管中加入 600 µL S.O.C. 培养基（含 0.5% (w/v) 酵母提取物、2% (w/v) 胰蛋白胨、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、20 mM MgSO₄ 和 4% (w/v) 葡萄糖），于 37 °C 培养 1 h。然后在室温下以 600 x g 离心 3 min。
   5. 弃去上清液，将沉淀用 60 µL LB 培养基（1% (w/v) 胰蛋白胨、0.5% (w/v) 酵母提取物和 85 mM NaCl）重悬，并涂布于含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上。将平板在 37 °C 培养 16 h^23,24。
   6. 挑取单个菌落接种至含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 5 mL LB 培养基中，于 37 °C、250 rpm 振荡培养 16 h。随后根据制造商说明（参见材料表），使用质粒提取试剂盒提取质粒（载体-标签-K-bZIP）。
2. 通过将载体-标签-K-bZIP 转化至感受态 E. coli 细胞 "B"（参见材料表），构建携带标签-K-bZIP 的重组杆粒。
   1. 在 1.5 mL 离心管中混合 0.2 µg 载体-标签-K-bZIP 质粒和 100 µL 感受态 E. coli 细胞 "B"，冰浴 30 min。将离心管置于 42 °C 水浴中孵育 45 s，立即放回冰上冷却 3 min。
   2. 向管中加入 900 µL S.O.C. 培养基，于 37 °C、50 rpm 振荡培养 4 h。随后取 10 µL 培养物，加入额外 50 µL S.O.C. 培养基，涂布于含 50 µg/mL 卡那霉素、7 µg/mL 庆大霉素、10 µg/mL 四环素、100 µg/mL 半乳糖苷底物和 40 µg/mL 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的 LB 琼脂平板上，于 37 °C 培养 48 h。
   3. 挑取一个白色菌落接种至含 50 µg/mL 卡那霉素、7 µg/mL 庆大霉素和 10 µg/mL 四环素的 5 mL LB 培养基中，于 37 °C、250 rpm 振荡培养 16 h。
   4. 提取携带标签-K-bZIP 的重组杆粒 DNA，定量后重悬至浓度为 1 µg/µL²⁵。
3. 通过将 1 µg 含标签-K-bZIP 的重组杆粒 DNA 转染至 6 孔板中的一孔 Sf9 细胞，生成表达标签-K-bZIP 的重组杆状病毒。
   1. 在 6 孔板每孔中接种 2 x 10⁶ 个 Sf9 细胞（参见材料表），加入含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 庆大霉素的 2 mL Grace 昆虫培养基，于 27 °C 培养 1 h。
   2. 将 Sf9 细胞维持在含 10% FBS、1% 庆大霉素和 1% 洗涤剂 C（参见材料表）的 Grace 昆虫培养基中，于 27 °C、140 rpm 振荡培养至对数生长期。使用血细胞计数板和台盼蓝染色计数细胞，细胞活力应高于 95%。每 2–3 天按 1:3 传代一次（最低密度约为 0.5 x 10⁶ 个细胞/mL）。
   3. 在 2 mL 离心管中加入 2 µL 杆粒 DNA（1 µg/µL）和 98 µL 低血清培养基（参见材料表）。然后加入 4 µL 转染试剂（参见材料表），充分混匀。室温孵育 15 min。
   4. 将该转染混合物（共 104 µL）加入每孔中，于 27 °C 培养 12–16 h。
   5. 轻柔吸除耗尽的培养基，更换为含 10% FBS 和 1% 庆大霉素的新鲜 Grace 昆虫培养基 2 mL。Sf9 细胞与培养板表面结合较松散，轻柔吸液不会对其造成扰动。
4. 转染后收集重组杆状病毒，并扩增以获得高滴度病毒储备液（P1），用于后续实验。
   1. 换液后 72 h，使用无菌细胞刮刀刮下 Sf9 细胞，将每孔的上清液收集至 1.5 mL 离心管中，涡旋振荡 10 s。
   2. 在 4 °C、150 x g 离心 3 min。收集上清液作为 P0 代杆状病毒，分装至 1.5 mL 离心管中（每管 1 mL），于 -80 °C 保存。
   3. 在 10 cm 培养皿中接种 1 x 10⁷ 个 Sf9 细胞，加入含 10% FBS 和 1% 庆大霉素的 10 mL Grace 昆虫培养基，于 27 °C 培养 1 h。
   4. 为扩增表达标签-K-bZIP 的重组杆状病毒，向已接种的 Sf9 细胞中加入 0.5 mL P0 代杆状病毒，于 27 °C 培养 48 h。
   5. 将上清液收集至 15 mL 离心管中作为 P1 代杆状病毒，于 4 °C 保存，可稳定存放长达 1 个月。

2. K-bZIP 的纯化

1. 在27 °C、140 rpm的振荡悬浮条件下，使用添加了10% FBS、1%庆大霉素和1%去垢剂C的Grace昆虫培养基培养Sf9细胞，保持其处于对数生长期，具体操作如步骤1.3.2所述。
2. 转导当天，将1 mL含有杆状病毒的上清液（P1）加入250 mL密度为2 × 10⁶个/mL的Sf9细胞中⁶ cells/mL
3. 将Sf9细胞在27 °C、140 rpm振荡条件下于摇床中孵育72 h，随后在4 °C下以2,740 × g离心15 min收集细胞。
4. 去除上清液，将细胞沉淀在 10 mL 裂解缓冲液（20 mM HEPES pH 7.9，0.5 M NaCl，1% 去垢剂 A（见 材料表），2% 甘油，蛋白酶抑制剂混合物），在 4 °C 下使用悬浮混合器以 50 rpm 转速旋转孵育 30 分钟。
5. 以15,000 × g离心细胞裂解液15分钟，收集上清液。
6. 为纯化tag-K-bZIP，将细胞裂解液（10 mL）与50 µL抗体偶联磁珠在14 mL聚丙烯管中混合，于4 °C以50 rpm在悬浮混合器上旋转孵育3小时。蛋白捕获完成后，在4 °C下以800 × g离心30秒收集磁珠。吸除大部分上清液，用残留的约1 mL液体重悬磁珠，转移至1.5 mL离心管中进行洗涤。
7. 将含有磁珠的离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附至管壁后，吸除上清液。
8. 用裂解缓冲液洗涤珠子四次。
   1. 向1.5 mL离心管中加入1 mL裂解缓冲液，颠倒混匀10次。将1.5 mL离心管置于磁力架上，按2.7步骤所述去除上清液。
   2. 重复上一步骤另外3次。
9. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤磁珠一次。
   1. 向1.5 mL离心管中加入1 mL PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，8 mM Na2HPO4，1.5 mM KH2PO4），倒置混匀10次。
   2. 将1.5 mL离心管置于磁力架上，然后移除上清液。
10. 通过向1.5 mL离心管中加入100 µL用PBS稀释的150 µg/mL八肽，从抗体标记的磁珠中洗脱tag-K-bZIP蛋白。室温下将离心管置于悬浮混合器上以50 rpm旋转10分钟。随后将离心管放回磁力架，收集含有K-bZIP的上清液至洁净的1.5 mL离心管中。
11. 通过 SDS-PAGE 分析 1–5 µL 纯化的 tag-K-bZIP 蛋白，随后进行考马斯亮蓝染色²⁶在同块凝胶上分别上样 2 µg、1 µg 和 0.5 µg 的牛血清白蛋白（BSA）样品，并使用图像处理软件（如 ImageJ）进行定量分析。通过与 BSA 标准品比较，估算 K-bZIP 的浓度。
12. 纯化的K-bZIP现已可用于各SUMO化实验。用PBS将K-bZIP稀释至终浓度为100 ng/µL，并分装保存于-80 °C。

3. SUMO化检测实验

1. 向每份主混合物中加入 3 µL 浓度为 100 ng/µL 的纯化 tag-K-bZIP 体外 SUMO化反应。主混合液的组分包含1 µL蛋白缓冲液、1x SUMO化缓冲液、0.5 µL p53蛋白（0.5 mg/mL）、25 nM E1激活酶（储备浓度：1 µM）、50 nM E2结合酶（储备浓度：10 µM），以及每种SUMO肽（SUMO-1、SUMO-2或SUMO-3；储备浓度：5 µM）各250 nM，最终体积为17 µL。
2. 轻轻混匀内容物，在30 °C下孵育反应3小时。加入20 µL 2× SDS-PAGE上样缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 6.8，4% 十二烷基硫酸钠，0.2% (w/v) 溴酚蓝，20% (v/v) 甘油，200 mM β-巯基乙醇）终止反应，并在95 °C下变性样品5分钟。
3. 在SDS-PAGE上分离样品，使用半干式电泳转膜仪将分离的蛋白质转移至PVDF膜，然后用抗p53抗体进行Western blot分析。
   1. 按照步骤2.11安装凝胶装置，并将20 µL样品加入凝胶孔中。
   2. 以恒定电流80 V运行10%凝胶约120分钟（直至染料条带迁移至凝胶底部）。电泳完成后，关闭电源。
   3. 断开电泳装置和胶板夹，取出凝胶，并将凝胶漂浮于半干转印缓冲液（48 mM Tris-HCl, 39 mM 甘氨酸, 20% 甲醇）中，孵育5分钟。
   4. 取另一个容器，将PVDF膜浸入甲醇中1分钟。随后将PVDF膜从甲醇中取出，放入半干转印缓冲液中，轻轻振荡5分钟。
   5. 取下半干电泳仪的安全盖。
   6. 预先润湿滤纸，并在底部铂金阳极上制备凝胶三明治结构，顺序如下：滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸。
   7. 固定阴极板和安全盖，然后以15 V恒定电流运行电转90分钟。关闭电源，断开半干式转膜仪，取出PVDF膜。
   8. 用封闭缓冲液（TBST 缓冲液中的 5% 脱脂奶粉）封闭 PVDF 膜₂，20 mM Tris-HCl，0.1% 去垢剂 B（见 材料表），室温下以 30 rpm 摇速在旋转摇床中孵育 1 小时。
   9. 将PVDF膜与用封闭缓冲液按1:1,000稀释的抗p53抗体在4 °C、30 rpm振荡条件下孵育12–16 h，使用悬臂式混合器。
   10. 将PVDF膜取出放入容器中，并加入TBST。用TBST再冲洗PVDF膜两次。
   11. 将PVDF膜浸泡在TBST中，使用旋转摇床以45 rpm振荡30分钟。
   12. 将PVDF膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔抗体按1:4,000比例用封闭缓冲液稀释后，在室温下以30 rpm振荡孵育1小时，使用悬浮混合器进行杂交。
   13. 按照步骤 3.4.10 所述，用 TBST 洗涤 PVDF 膜 3 次。
   14. 将PVDF膜置于TBST中，在悬浮混合器上以45 rpm振荡浸泡30分钟。弃去TBST，加入PBS，于4 °C保存PVDF膜，最长可保存12小时。
   15. 将增强型化学发光底物（ECL底物）试剂1和试剂2按1:1比例混合（见 材料表). 将PVDF膜从PBS中取出，用纸巾或轻质擦拭布轻轻吸去多余水分，立即在每张膜表面加入400 µL ECL试剂，孵育3-5分钟。用纸巾轻轻吸去多余ECL试剂，但切勿使膜完全干燥。
   16. 使用化学发光成像系统或放射自显影胶片曝光印迹²⁷.

结果

根据制造商提供的信息，SUMO化反应中E1和E2酶的标准用量分别为50 nM和500 nM。首先通过以下实验确定能够对p53进行SUMO化的E2结合酶Ubc9的最低用量： 体外 SUMO化检测实验。所用Ubc9的量可低至标准方法的五分之一 体外 SUMO化实验方案能够有效实现p53的SUMO化图1A）。因此，采用标准方案中E1酶用量的一半，以及Ubc9用量的十分之一，进行另一组实验 体外 SUMO化检测。与标准方案相比，观察到SUMO化效率显著降低。图1B).

因此，利用这些修饰后的条件确定了SUMO E3连接酶K-bZIP增强p53 SUMO化的功能 体外 SUMO化反应条件。从Sf9细胞中纯化...

讨论

这 体外 此处描述的SUMO化实验方案通常用于确定已鉴定的Ubc9底物的SUMO化状态。使用标准方案研究SUMO E3连接酶的SUMO化功能时，主要局限在于SUMO E1活化酶和E2结合酶Ubc9的丰度较高，这会最大程度地促进SUMO的共价连接 体外 系统。鉴于这一挑战，我们认为将SUMO E1和E2酶的用量滴定至其SUMO化活性刚好可被检测的水平，是利用该方法测定SUMO E3连接酶催化活性的唯一可行途径 体外 SUMO化系统。基于该假设，我们成功阐明了K-bZIP的E3连接酶活性，并将其鉴定为一种对SUMO-2/3具有特异性的新型SUMO E3连接酶。

该方案中的关键步骤是使用较低量的 E1 和 E2 酶。如图2所示，通过降低 E1 和 E2 的用量，可能有助于鉴定出具有较低连接酶活性但对底物和 SUMO 旁系同源蛋白保持特异性的新型 SUMO E3 连接酶。该技术的主要局限性在于需要高质量的抗体来识别 SUMO 化底物，因为仅有极小部分的底物能够发生 SUMO 修...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pFastBac	Invitrogen	10359-016	双表达杆状病毒载体
pCR2.1-TOPO 载体	Invitrogen		PCR 产物克隆载体
感受态细胞  E. coli DH5α	Yeastern Biotech	FYE678-80VL	感受态 E. coli 细胞 A
E. coli DH10Bac	Invitrogen	10359-016	感受态 E. coli 细胞 B
FugeneHD	Roche	04709705001	转染试剂
Opti-MEM	Gibco	31985062	低血清培养基
T4 连接酶	NEW England BioLabs	M0202S
CpoI (RsrII)	Thermo Scientific	ER0741
Bluo-gal	Thermo Scientific	B1690	半乳糖苷酶底物
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Grace’s 昆虫培养基	Gibco	11605094
胎牛血清	Gibco	10082147
庆大霉素	Thermo Fisher	15750060
氨苄青霉素	Sigma-Aldrich	A9393-25G
卡那霉素	Sigma-Aldrich	K0254-20ML
庆大霉素	Gibco	15710-064
四环素	Sigma-Aldrich	87128-25G
LB 肉汤	Merk	1.10285.0500
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-5KG
KCl	Merk	1.04936.1000
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136-500G
KH2PO4	J.T.Baker	3246-01
十二烷基硫酸钠	Merk	1.13760.1000
β-巯基乙醇	Bio-Rad	161-0710
TRIS（碱）	J.T.Baker	4109-06
脱脂奶粉	Fonterra
甘油	J.T.Baker	2136-01
Triton X-100	Amresco	0694-1L	去垢剂 A
Tween 20	Amresco	0777-500ML	去垢剂 B
泊洛沙姆 188 溶液	Sigma-Aldrich	P5556-100ML	去垢剂 C
蛋白酶抑制剂混合片剂	Roche	04 693 132 001
3x Flag 肽	Sigma	F4799
抗 FLAG m2 磁珠	Sigma-Aldrich	M8823	抗体标记磁珠
SUMOlink SUMO-1 试剂盒	Active Motif	40120	标准 SUMO 化实验方案
SUMOlink SUMO-2/3 试剂盒	Active Motif	40220	标准 SUMO 化实验方案
QIAquick 凝胶回收试剂盒	QIAGEN	28704
QIAGEN 质粒小提试剂盒	QIAGEN	12123	质粒提取试剂盒
聚丙烯管	Falcon	352059
培养皿	Falcon	351029
细胞刮	Corning	CNG3008
加样尖	Sorenson BioScience	28480
PVDF 膜	PerkinElmer	NEF1002
印迹滤纸	Bio-Rad	1703932
小型垂直电泳装置（Bio-Rad Mini Protean II Cell）	Bio-Rad	1658001 EDU
Trans-Blot SD 半干式电泳转印槽	Bio-Rad	1703940
Pierce ECL 蛋白印迹试剂	Thermo	32106	ECL 试剂
悬浮混合器	Digisystem laboratory instruments  Inc.	SM-3000
旋转摇床	Kansin instruments Co.	OS701
ImageQuant LAS 4000 生物分子成像仪	GE Healthcare	28955810
Sf9 细胞	Thermo Scientific	B82501
抗 p53 抗体	Cell Signaling	#9282
抗兔抗体	GE Healthcare	NA934-1ML