体外 SUMO化检测法用于研究SUMO E3连接酶活性

摘要

与泛素连接酶不同，目前已鉴定的E3 SUMO连接酶数量较少。这种修饰 体外 SUMO化实验方案能够通过以下方法鉴定新的SUMO E3连接酶 体外 重建实验

摘要

小泛素样修饰（SUMO）是一种重要的翻译后修饰（PTM），主要通过调节蛋白质-蛋白质相互作用来介导信号转导。与泛素化修饰类似，SUMO化修饰由一系列级联酶反应催化完成，包括E1激活酶（SAE1/SAE2）、E2结合酶（Ubc9）和E3连接酶（即，PIAS家族、RanBP2和Pc2）。然而，与泛素化不同，SUMO修饰反应并不必需E3连接酶，但E3连接酶可提高修饰的精确性和效率。经SUMO修饰的蛋白质可通过以下方法鉴定 体内 通过使用底物特异性抗体进行免疫沉淀，再结合SUMO特异性抗体进行免疫印迹来检测。然而，证明蛋白质SUMO E3连接酶活性需要 体外 使用纯化的酶、底物和SUMO蛋白重建SUMO化反应体系。由于在 体外 反应通常仅需 SAE1/SAE2 和 Ubc9 即足以实现 SUMO 结合，但由假定的 E3 连接酶增强的 SUMO 化修饰并不总是易于检测。在此，我们描述了一种改良的 体外 使用该SUMO化实验方案可稳定鉴定SUMO修饰 体外 重建系统。本文还提供了一步一步纯化具有催化活性的K-bZIP（一种病毒性SUMO-2/3 E3连接酶）的实验方案。所纯化的K-bZIP对p53（SUMO的一个已知靶蛋白）的SUMO化活性得到了展示。该方案不仅可用于鉴定新的SUMO E3连接酶，还可用于揭示其对SUMO旁系同源蛋白的特异性。

引言

SUMO 修饰最初被确定为一种可逆的翻译后修饰（PTM），可调控蛋白质稳定性¹除了直接共价连接外，SUMO 还可通过 SUMO 相互作用基序（SIMs）以非共价相互作用的方式结合到蛋白质上。²与含有Src同源2（SH2）或磷酸酪氨酸结合（PTB）结构域的分子对酪氨酸磷酸化的结合类似^3,4SUMO修饰为含有SIM结构域的效应蛋白提供了额外的相互作用平台，从而实现选择性招募^5,6除了调控信号转导外，转录因子和染色质重塑分子的SUMO化修饰也参与调控基因表达^7,8. 全基因组范围的SUMO化模式研究表明，SUMO修饰与正向调控相关^9,10 或阴性^10,11,12 转录调控，部分原因是SUMO化修....

方案

1. 杆状病毒表达载体的制备

1. 通过将 K-bZIP 的 cDNA¹⁹ 克隆到带有 N 端表位标签的双表达杆状病毒载体中（参见材料表），纯化 SUMO E3 连接酶 K-bZIP。我们已成功使用八肽标签（在本方案中始终表示为载体-标签-K-bZIP）。
   注意：用于 K-bZIP 聚合酶链式反应（PCR）克隆的 DNA 模板，是经多西环素处理后从 TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 细胞中分离的 RNA 反转录得到的 cDNA²⁰。
   1. 将全长 K-bZIP cDNA¹⁹ 转入含有 CpoI 克隆位点的双表达载体中。用 CpoI 在 37 °C 条件下消化 PCR 产物和 1 µg 双表达载体，反应 3 h²¹。
   2. 在 0.8% 琼脂糖凝胶上电泳后分离并提取消化后的 DNA²²。按照制造商说明（参见材料表），使用 T4 DNA 连接酶在 16 °C 条件下连接插入片段（K-bZIP）与载体，反应 30 min。
   3. 将 5 µL 连接产物加入含 50 µL 感受态 E. coli

结果

根据制造商提供的信息，SUMO化反应中E1和E2酶的标准用量分别为50 nM和500 nM。首先通过实验确定能够对p53进行SUMO化的E2结合酶Ubc9的最低用量 体外 SUMO化检测。所用Ubc9的量可低至标准方法的五分之一 体外 SUMO化实验方案能够高效地对p53进行SUMO化修饰（图1A）。因此，采用标准方案中E1酶用量的一半，以及Ubc9用量的十分之一，进行另一组实验 体外 SUMO化检测。与标准方案相比，观察到SUMO化效率显著降低。图1B).

因此，利用这些修饰后的条件确定了SUMO E3连接酶K-bZIP增强p53 SUMO化的功能 体外 SUMO化反应条件。从Sf9细胞中纯化的.......

讨论

这 体外 此处描述的SUMO化实验方案通常用于确定已鉴定的Ubc9底物的SUMO化状态。使用标准方案研究SUMO E3连接酶的SUMO化功能时，主要局限在于SUMO E1活化酶和E2结合酶Ubc9的丰度较高，这会最大程度地促进SUMO的共价连接 体外 系统。鉴于这一挑战，我们认为将SUMO E1和E2酶的用量滴定至其SUMO化活性刚好可被检测的水平，是利用该方法测定SUMO E3连接酶催化活性的唯一可行途径 体外 SUMO化系统。基于该假设，我们成功阐明了K-bZIP的E3连接酶活性，并将其鉴定为一种对SUMO-2/3具有特异性的新型SUMO E3连接酶。

该方案中的关键步骤是使用较低量的 E1 和 E2 酶。如图2所示，通过降低 E1 和 E2 的用量，可能有助于鉴定出具有较低连接酶活性但对底物和 SUMO 旁系同源蛋白保持特异性的新型 SUMO E3 连接酶。该技术的主要局限性在于需要高质量的抗体来识别 SUMO 化底物，因为仅有极小部分的底物能够发生 SUMO 修.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pFastBac	Invitrogen	10359-016	双表达杆状病毒载体
pCR2.1-TOPO 载体	Invitrogen		PCR 产物克隆载体
感受态细胞  E. coli DH5α	Yeastern Biotech	FYE678-80VL	感受态 E. coli 细胞 A
E. coli DH10Bac	Invitrogen	10359-016	感受态 E. coli 细胞 B
FugeneHD	Roche	04709705001	转染试剂
Opti-MEM	Gibco	31985062	低血清培养基
T4 连接酶	NEW England BioLabs	M0202S
CpoI (RsrII)	Thermo Scientific	ER0741
Bluo-gal	Thermo Scientific	B1690	半乳糖苷酶底物
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Grace’s 昆虫培养基	Gibco	11605094
胎牛血清	Gibco	10082147
庆大霉素	Thermo Fisher	15750060
氨苄青霉素	Sigma-Aldrich	A9393-25G
卡那霉素	Sigma-Aldrich	K0254-20ML
庆大霉素	Gibco	15710-064
四环素	Sigma-Aldrich	87128-25G
LB 肉汤	Merk	1.10285.0500
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-5KG
KCl	Merk	1.04936.1000
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136-500G
KH2PO4	J.T.Baker	3246-01
十二烷基硫酸钠	Merk	1.13760.1000
β-巯基乙醇	Bio-Rad	161-0710
TRIS（碱）	J.T.Baker	4109-06
脱脂奶粉	Fonterra
甘油	J.T.Baker	2136-01
Triton X-100	Amresco	0694-1L	去垢剂 A
Tween 20	Amresco	0777-500ML	去垢剂 B
泊洛沙姆 188 溶液	Sigma-Aldrich	P5556-100ML	去垢剂 C
蛋白酶抑制剂混合片剂	Roche	04 693 132 001
3x Flag 肽	Sigma	F4799
抗 FLAG m2 磁珠	Sigma-Aldrich	M8823	抗体标记磁珠
SUMOlink SUMO-1 试剂盒	Active Motif	40120	标准 SUMO 化实验方案
SUMOlink SUMO-2/3 试剂盒	Active Motif	40220	标准 SUMO 化实验方案
QIAquick 凝胶回收试剂盒	QIAGEN	28704
QIAGEN 质粒小提试剂盒	QIAGEN	12123	质粒提取试剂盒
聚丙烯管	Falcon	352059
培养皿	Falcon	351029
细胞刮	Corning	CNG3008
加样尖	Sorenson BioScience	28480
PVDF 膜	PerkinElmer	NEF1002
印迹滤纸	Bio-Rad	1703932
小型垂直电泳装置（Bio-Rad Mini Protean II Cell）	Bio-Rad	1658001 EDU
Trans-Blot SD 半干式电泳转印槽	Bio-Rad	1703940
Pierce ECL 蛋白印迹试剂	Thermo	32106	ECL 试剂
悬浮混合器	Digisystem laboratory instruments  Inc.	SM-3000
旋转摇床	Kansin instruments Co.	OS701
ImageQuant LAS 4000 生物分子成像仪	GE Healthcare	28955810
Sf9 细胞	Thermo Scientific	B82501
抗 p53 抗体	Cell Signaling	#9282
抗兔抗体	GE Healthcare	NA934-1ML