我们提出了一种有效且可重复的方法，用于从胚胎期和出生后脑组织中分离和培养神经前体细胞，以进行组蛋白3第79位赖氨酸二甲基化（H3K79me2）的染色质免疫沉淀（ChIP）——该组蛋白修饰位于组蛋白3的球状结构域内。
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本文内容
摘要
摘要
大脑发育是一个复杂的过程，由形态发生素梯度和不同的转录程序以时空方式调控。此外，表观遗传性染色质修饰（如组蛋白甲基化）在该过程中对建立和维持特定细胞命运具有重要作用。绝大多数组蛋白甲基化发生在具有灵活性的组蛋白尾部，该区域可被组蛋白修饰酶、去修饰酶以及组蛋白识别蛋白所接近。相比之下，H3K79甲基化位于组蛋白3的球状结构域，并参与多种发育功能。H3K79甲基化在进化上高度保守，可在从Homo sapiens到Saccharomyces cerevisiae的多种物种中发现。该修饰存在于生物体内的不同细胞群体中，包括神经前体细胞。由于H3K79甲基化位于组蛋白3的球状结构域，其检测较为困难。本文介绍了从胚胎期大脑皮层组织（E11.5–E14.5）中分离和培养皮层前体细胞（CPCs），或从出生后组织（P5–P7）中分离和培养小脑颗粒神经元前体细胞（CGNPs）的方法，并高效地对H3K79me2进行免疫沉淀，用于定量PCR（qPCR）和全基因组测序。
引言
大脑的感觉、运动和认知功能高度复杂，且易受物理和环境变化的影响。脑由后脑、中脑和前脑三个主要部分组成，这些部分之间存在密切连接。在前脑中，端脑可分为背侧端脑（DT）和腹侧端脑（VT）。小鼠的背侧端脑由六个皮层层构成，这些层在胚胎期11.5天至18.5天（E11.5–E18.5）以“由内向外”的方式逐步形成1。腹侧端脑在发育过程中包含神经节隆起，之后将发育为基底神经节2,3。哺乳动物中枢神经系统中可区分多种细胞类型，例如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞4，这些细胞以时空特异性的方式发育5。首先，神经前体细胞（NPCs）产生多种类型的神经元，包括腹侧端脑中的中间神经元和背侧端脑中的投射神经元，随后生成胶质细胞（例如，星形胶质细胞6）。在皮层发育过程中，最表层（I层），即包含 Cajal-Retzius 细胞的层，最先形成。随后，在E12.5至E14.5期间，神经前体细胞生成较深的神经元层（VI层和V层）；而在E14.5至E16.5期间，前体细胞则产生上层（IV–II层）神经元7,8。神经元身份的....
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方案
下述方案中提及的所有动物实验均已获得弗莱堡大学动物福利委员会及当地主管部门的批准（G12/13，G16/11）。
1. 准备工作
- CPCs 分离的准备工作
- 设置定时交配，以获得不同皮层发育阶段的胚胎（E11.5 至 E14.5 之间）。使用至少 8 周龄的 NMRI（Naval Medical Research Institute）品系小鼠。交配后，将发现阴栓的当天记为 E0.5。
- 为获得足够材料，每份来自 E12.5 或 E14.5 胚胎皮层的 H3K79me2 ChIP 实验需使用一窝 NMRI 小鼠。对于较晚的胚胎阶段，一窝小鼠可用于多次 ChIP 分析（NMRI 品系平均每窝产仔数：10 只胚胎）。
- 将 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）和磷酸盐缓冲液（PBS）预冷至 4 °C（长期储存于室温）。
- 将储存于 4 °C 的胰蛋白酶-EDTA（0.05 % w/v）平衡至 37 °C。
- 配制皮层细胞培养基（CCM）：在神经元培养基（见材料表）中添加以下成分，使其终浓度分别为：2%（v/v）B-27 添加剂、5 µg/mL 脱铁转铁蛋白（Apo-Transferrin）、1 µg/mL 谷胱甘肽、0.5 mM L-谷氨酰胺、0.8 µg/....
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结果
神经前体细胞分离、培养、H3K79me2 染色质免疫沉淀（ChIP）及 ChIP 分析方法的总体方案： 图1 展示了在胚胎脑发育不同时期的皮层前体细胞或出生后阶段的小脑颗粒神经元前体细胞中进行 H3K79me2 ChIP 的流程图。第一步是分离脑组织，并获取端脑（E11.5 至 E14.5）或小脑（P5-P7）。可通过将端脑分为背侧端脑（DT）和腹侧端脑（VT）来分别分析其不同区域。随后对组织进行匀浆处理，并分离神经前体细胞。此时可选择将前体细胞进行培养并用 DOT1L 抑制剂处理；另一种选择是直接固定前体细胞并进行 ChIP 操作。在 ChIP 过程中，染色质将被剪切为 200–500 bp 的片段，并与磁珠偶联的抗 H3K79me2 抗体孵育。洗涤磁珠并回收 DNA 后，可对沉淀的 DNA 进行测序或定量 PCR（qPCR）分析（图1A）。染色质剪切后应获得良好的片段大小分布，因此建议通过 DNA 琼脂糖凝胶电泳或其.......
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讨论
检测组蛋白修饰、转录因子、组蛋白密码阅读蛋白、书写蛋白或擦除蛋白在基因组上的占据情况，主要有两种染色质免疫沉淀方法。一种是使用核酸酶消化的天然染色质进行免疫沉淀的天然ChIP方法，另一种则是本研究所采用的方法，即使用PFA固定的、经超声破碎的染色质，其中核小体及其他DNA结合蛋白通过共价键与DNA交联39。由于染色质和组蛋白甲基化在ChIP过程中相对稳定，且天然ChIP具有较高的抗体检测效率，因此适用于组蛋白甲基化的检测。然而，该方法需要大量起始材料，故不适用于皮层或小脑发育的研究，因为在这些研究中从小鼠脑组织获得的细胞数量通常有限。尽管抗体通常是针对非固定材料制备的，但我们已证实该抗体可特异性识别H3K79me2，因为特异性抑制DOT1L会导致ChIP-qPCR分析和免疫印迹中H3K79me2信号的减弱（图2A 和 图3A）。使用交联材料进行ChIP可能效率较低，但本方案所提供的流程能够确保获得足量且特异性富集的材料，用于qPCR和测序分析。
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益
致谢
感谢Henriette Bertemes协助在实验室中建立CGN培养方案。本方法论文由德国研究基金会（DFG）资助的CRC992医学表观遗传学项目对TV的资助支持。作者感谢德国弗莱堡大学生物信息学系的弗莱堡Galaxy团队（Pavankumar Videm、Björn Grüning和Prof. Rolf Backofen）提供的支持，该支持由合作研究中心992医学表观遗传学（DFG资助号SFB 992/1 2012）和德国联邦教育与研究部（BMBF资助号031 A538A RBC（de.NBI））提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗-GAPDH | Abcam | ab8245 | 类别： 抗体 缩写/备注： 免疫印迹稀释比例 1:5000 |
| 抗-H3 | Abcam | ab1791 | 类别： 抗体 缩写/备注： 免疫印迹稀释比例 1:3000 |
| 抗-H3K79me2 | Diagenode | pAb-051-050 | 类别： 抗体 缩写/备注： 染色质免疫沉淀抗体 |
| 抗-H3K79me2 | Abcam | ab-051-050 | 类别： 抗体 缩写/备注： 免疫印迹稀释比例 1:1000 |
| 抗兔IgG | Diagenode | C15410206 | 类别： 抗体 缩写/备注： 染色质免疫沉淀对照抗体 |
| 抗微管蛋白α | Abcam | ab108629 | 类别： 抗体 缩写/备注： 免疫印迹稀释比例 1:3000 |
| 转铁蛋白（1 mg/ml） | Sigma-Aldrich | T1147 | 类别： 细胞培养 缩写/备注： 用于皮质细胞培养基（CCM） |
| B27添加剂（50倍浓缩） | Life Technologies | 17504044 | 类别： 细胞培养 缩写/备注： 用于皮质细胞培养基（CCM） |
| Bioanalyzer | Agilent technologies | G2940CA | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： 用于剪切染色质的分析 |
| Bioruptor NextGen | Diagenode | B01020001 | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： 超声破碎仪 |
| 硼酸 pH 8.4 | Sigma Aldrich | B6768 | 类别： 细胞培养 缩写/备注： 用于皮质前体细胞（CPC）培养 |
| CFX Connect RT PCR 检测系统 | Bio-Rad | 1855201 | 类别： 染色质免疫沉淀分析 缩写/备注： qPCR检测系统 |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 11320-033 | 类别： 细胞培养 缩写/备注： 用于小脑颗粒神经元前体细胞培养基（CGM） |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10001D | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： 磁珠，用于染色质免疫沉淀 |
| EPZ-5676 | Selleckchem | S7062 | 类别： DOT1L抑制 缩写/备注： 用于细胞培养中DOT1L的抑制 |
| 乙二胺四乙酸 | SERVA | 39760.01 | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： EDTA |
| 胎牛血清 10% (v/v) | Gibco | 10082147 | 类别： 细胞培养 缩写/备注： 用于皮质前体细胞分离和小脑颗粒神经元前体细胞培养基（CGM） |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G5767 | 类别： 细胞培养 缩写/备注： 用于小脑颗粒神经元前体细胞（CGNP）分离 |
| 谷胱甘肽（1.25 mg/ml） | Sigma-Aldrich | G4251 | 类别： 细胞培养 缩写/备注： 用于皮质细胞培养基（CCM） |
| 甘氨酸 | Carl Roth | 3187 | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： 用于细胞固定 |
| GoTaq预混液 | Promega | A6002 | 类别： 染色质免疫沉淀分析 缩写/备注： qPCR用DNA聚合酶预混液 |
| Hank’s平衡盐溶液 | Life Technologies | 14025-100 | 类别： 细胞培养 缩写/备注： HBSS |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Life Technologies | 25030081 | 类别： 细胞培养 缩写/备注： 用于皮质细胞培养基（CCM） |
| 层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L2020 | 类别： 细胞培养 缩写/备注： 用于皮质前体细胞（CPC）培养 |
| 氯化锂 | Sigma-Aldrich | L4408 | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： LiCl |
| N2添加剂 | Life Technologies | 17502048 | 类别： 细胞培养 缩写/备注： 用于小脑颗粒神经元前体细胞培养基（CGM） |
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher | 3300 | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： 用于DNA定量的荧光分光光度计 |
| NEB Next Ultra DNA文库制备试剂盒（适用于Illumina） | NEB | E7645S | 类别： 染色质免疫沉淀分析 缩写/备注： 文库制备试剂盒 |
| NEBNext多重寡核苷酸（适用于Illumina） | NEB | E7335 | 类别： 染色质免疫沉淀分析 缩写/备注： 文库制备用寡核苷酸 |
| Neurobasal培养基 | Gibco | 21103049 | 类别： 细胞培养 缩写/备注： 用于皮质细胞培养基（CCM） |
| NP-40替代物 | Calbiochem | 492016 | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： 用于染色质免疫沉淀缓冲液 |
| 多聚甲醛 | Carl Roth | 335 | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： PFA，用于细胞固定 |
| 青霉素-链霉素-新霉素 1% (v/v) | Life Technologies | 15640055 | 类别： 细胞培养 缩写/备注： PSN，用于皮质细胞培养基（CCM）和小脑颗粒神经元前体细胞培养基（CGM） |
| 磷酸盐缓冲液 | Life Technologies | 10010023 | 类别： 细胞培养 缩写/备注： PBS，用于皮质前体细胞（CPC）分离 |
| PicoGreen试剂盒 | Thermo Fisher | P11496 | 类别： 染色质免疫沉淀分析 缩写/备注： 用于DNA定量的荧光染料 |
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P6407 | 类别： 细胞培养 缩写/备注： 用于小脑颗粒神经元前体细胞（CGNP）分离 |
| 聚-L-鸟氨酸盐酸盐 | Sigma Aldrich | P3655 | 类别： 细胞培养 缩写/备注： 用于皮质前体细胞（CPC）培养 |
| 氯化钾 | Thermo Fisher | AM9640G | 类别： 细胞培养 缩写/备注： KCl，用于小脑颗粒神经元前体细胞培养基（CGM） |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | 4693159001 | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： 用于染色质免疫沉淀 |
| 蛋白酶K | Sigma-Aldrich | 3115879001 | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： 用于染色质免疫沉淀 |
| Qiagen MinElute | Qiagen | 28004 | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： DNA纯化试剂盒 |
| RNA酶 | Sigma-Aldrich | R6513 | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： 用于染色质免疫沉淀 |
| SGC0946 | Selleckchem | S7079 | 类别： DOT1L抑制 缩写/备注： 用于细胞培养中DOT1L的抑制 |
| 碳酸氢钠 | Carl Roth | 8551.1 | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： 用于洗脱缓冲液 |
| 氯化钠 | Carl Roth | 9265 | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： NaCl，用于染色质免疫沉淀缓冲液 |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | 30970 | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： 用于染色质免疫沉淀 |
| 十二烷基硫酸钠 | Carl Roth | 183 | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： SDS，用于染色质免疫沉淀 |
| 音猬因子（SHH） | Sigma-Aldrich | SRP6004 | 类别： 细胞培养 缩写/备注： 用于小脑颗粒神经元前体细胞（CGNP）分离 |
| 超氧化物歧化酶（1mg/ml） | Sigma-Aldrich | S7571 | 类别： 细胞培养 缩写/备注： 用于皮质细胞培养基（CCM） |
| 三羟甲基氨基甲烷 | Carl Roth | 9090 | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： TRIS，用于染色质免疫沉淀缓冲液 |
| 吐温X-100 | Carl Roth | X100 | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： 用于染色质免疫沉淀缓冲液 |
| 胰蛋白酶-EDTA 0.05% (w/v) | Sigma Aldrich | 59417C | 类别： 细胞培养 缩写/备注： 用于皮质前体细胞（CPC）分离 |
| 吐温20 | Carl Roth | 28320 | 类别： 染色质免疫沉淀 缩写/备注： 用于磁珠制备 |
| 其他实验室设备：血球计数板、培养箱、旋转仪、摇床、解剖工具组、水浴锅 | |||
| CCM：皮质细胞培养基 | |||
| CGM：小脑颗粒神经元前体细胞培养基 |
参考文献
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
- Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science....
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