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方法文章

神经前体细胞的分离与培养及组蛋白3赖氨酸79二甲基化标记的染色质免疫沉淀

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DOI：

10.3791/56631

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2018年1月26日

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

本文内容

摘要

我们提出了一种有效且可重复的方法，用于从胚胎期和出生后脑组织中分离和培养神经前体细胞，以进行组蛋白3第79位赖氨酸二甲基化（H3K79me2）的染色质免疫沉淀（ChIP）——该组蛋白修饰位于组蛋白3的球状结构域内。

摘要

大脑发育是一个复杂的过程，由形态发生素梯度和不同的转录程序以时空方式调控。此外，表观遗传性染色质修饰（如组蛋白甲基化）在该过程中对建立和维持特定细胞命运具有重要作用。绝大多数组蛋白甲基化发生在具有灵活性的组蛋白尾部，该区域可被组蛋白修饰酶、去修饰酶以及组蛋白识别蛋白所接近。相比之下，H3K79甲基化位于组蛋白3的球状结构域，并参与多种发育功能。H3K79甲基化在进化上高度保守，可在从Homo sapiens到Saccharomyces cerevisiae的多种物种中发现。该修饰存在于生物体内的不同细胞群体中，包括神经前体细胞。由于H3K79甲基化位于组蛋白3的球状结构域，其检测较为困难。本文介绍了从胚胎期大脑皮层组织（E11.5–E14.5）中分离和培养皮层前体细胞（CPCs），或从出生后组织（P5–P7）中分离和培养小脑颗粒神经元前体细胞（CGNPs）的方法，并高效地对H3K79me2进行免疫沉淀，用于定量PCR（qPCR）和全基因组测序。

引言

大脑的感觉、运动和认知功能高度复杂，且易受物理和环境变化的影响。脑由后脑、中脑和前脑三个主要部分组成，这些部分之间存在密切连接。在前脑中，端脑可分为背侧端脑（DT）和腹侧端脑（VT）。小鼠的背侧端脑由六个皮层层构成，这些层在胚胎期11.5天至18.5天（E11.5–E18.5）以“由内向外”的方式逐步形成1。腹侧端脑在发育过程中包含神经节隆起，之后将发育为基底神经节2,3。哺乳动物中枢神经系统中可区分多种细胞类型，例如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞4，这些细胞以时空特异性的方式发育5。首先，神经前体细胞（NPCs）产生多种类型的神经元，包括腹侧端脑中的中间神经元和背侧端脑中的投射神经元，随后生成胶质细胞（例如，星形胶质细胞6）。在皮层发育过程中，最表层（I层），即包含 Cajal-Retzius 细胞的层，最先形成。随后，在E12.5至E14.5期间，神经前体细胞生成较深的神经元层（VI层和V层）；而在E14.5至E16.5期间，前体细胞则产生上层（IV–II层）神经元7,8。神经元身份的确定依赖于不同形态发生素诱导的时空特异性转录程序，以及表观遗传程序2。

小脑参与运动协调，位于后脑，在小鼠中其发育时间约为胚胎期第10天（E10）至出生后第20天（P20）9。小脑包含小脑皮层和小脑核团10。成年小脑皮层由三层结构组成：最外层的分子层、中间的浦肯野细胞层以及最内层含有颗粒神经元的颗粒层10。小脑颗粒细胞是最小的神经元，约占脊椎动物脑内所有神经元的80%11。它们由位于外颗粒生发区的前体细胞发育而来，并迁移穿过浦肯野细胞层到达最终位置12。与端脑类似，小脑的发育受到多种重要形态发生素的调控，这些形态发生素具有特定的时间和空间依赖性功能，并启动特定的转录程序10。

大脑皮层和小脑层的发育受到特定形态发生素的转录表达以及DNA染色质状态的调控。简而言之，染色质状态可分为两类：具有转录活性的常染色质和转录沉默的异染色质区域。作为染色质基本单位的核小体包含两份每种核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4，周围缠绕着147个碱基对的DNA。13组蛋白在翻译后会发生多种修饰，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、SUMO化、ADP-核糖基化、脱氨基以及脯氨酸异构化14,15组蛋白赖氨酸甲基化被认为是最稳定的组蛋白修饰，可调控转录、复制和重组16DNA损伤应答17，以及基因组印记18赖氨酸可发生单甲基化、二甲基化或三甲基化19 不仅出现在可及的组蛋白尾部，还出现在组蛋白的球状结构域内20H3K4 和 H3K36 的特异性甲基化主要与常染色质相关，而 H3K9、H3K27 或 H4K20 的特异性甲基化则主要存在于异染色质区域，尽管所有这些修饰位点均位于组蛋白尾部14,19,21H3K79 甲基化位于组蛋白球状结构域内，既与转录活性相关，也与转录失活的基因组区域相关22该修饰在进化上具有保守性，已在酵母、小牛胸腺、鸡和人类中被观察到23H3K79 单、二和三甲基化（H3K79me1、me2、me3）由组蛋白甲基转移酶 DOT1L 催化24,25 以及含核SET结构域蛋白2（Nsd2）26DOT1L 参与细胞增殖、DNA 修复和细胞重编程27. 缺失 Dot1l 在小鼠中会导致约发育阶段 E10.5 时的产前死亡28,29在心脏发育及心肌细胞分化过程中，DOT1L 对基因表达调控至关重要30在中枢神经系统中，DOT1L 的功能可能与神经管发育有关31，它参与抑制 Tbr1前脑发育过程中的表达32，并可能在内质网应激反应基因的调控中发挥作用33H3K79me 的作用具有情境依赖性，可表现为激活或抑制，尤其在 在体内 中枢神经系统发育等情形至今仅被部分阐明32由于H3K79甲基化位于组蛋白3的球状结构域，与位于柔性组蛋白尾部的修饰相比，其空间位阻更大，可及性较低23为了理解 H3K79 甲基化的功能，需要可靠且可重复的分析方法来确定其定位及基因组环境。在本方法学论文中，我们介绍了不同神经前体细胞（用于大脑皮层的皮层前体细胞 CPCs 和用于小脑的颗粒神经元前体细胞 CGNPs）的分离方法、有效的 DOT1L 抑制剂处理方案，以及一种染色质免疫沉淀（ChIP）方法，可用于在皮层和小脑发育的不同时间点通过定量 PCR（qPCR）或测序分析 H3K79 甲基化水平。有关该实验方案及其应用的概览，请参见 图1.

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方案

下述方案中提及的所有动物实验均已获得弗莱堡大学动物福利委员会及当地主管部门的批准（G12/13，G16/11）。

1. 准备工作

  1. CPCs 分离的准备工作
    1. 设置定时交配，以获得不同皮层发育阶段的胚胎（E11.5 至 E14.5 之间）。使用至少 8 周龄的 NMRI（Naval Medical Research Institute）品系小鼠。交配后，将发现阴栓的当天记为 E0.5。
    2. 为获得足够材料，每份来自 E12.5 或 E14.5 胚胎皮层的 H3K79me2 ChIP 实验需使用一窝 NMRI 小鼠。对于较晚的胚胎阶段，一窝小鼠可用于多次 ChIP 分析（NMRI 品系平均每窝产仔数：10 只胚胎）。
    3. 将 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）和磷酸盐缓冲液（PBS）预冷至 4 °C（长期储存于室温）。
    4. 将储存于 4 °C 的胰蛋白酶-EDTA（0.05 % w/v）平衡至 37 °C。
    5. 配制皮层细胞培养基（CCM）：在神经元培养基（见材料表）中添加以下成分，使其终浓度分别为：2%（v/v）B-27 添加剂、5 µg/mL 脱铁转铁蛋白（Apo-Transferrin）、1 µg/mL 谷胱甘肽、0.5 mM L-谷氨酰胺、0.8 µg/mL 超氧化物歧化酶和 1%（v/v）青霉素-链霉素-新霉素抗生素混合液。4 °C 保存。实验前将培养基平衡至 37 °C。
    6. 解冻胎牛血清（FCS），分装（每份 50 mL），并将其中一份平衡至 37 °C（长期储存于 -20 °C）。
    7. 用 H2O 配制 DNA 酶 1 储存液（10 mg/mL），用于细胞培养。分装后储存于 -20 °C。
    8. 如需使用，将特异性 DOT1L 抑制剂 EPZ-5676 或 SGC0946 溶于 DMSO，配制成 100 mM 储存液。在第 0 天以终浓度 1–5 µM 加入细胞，并每隔两天重新添加一次抑制剂。
    9. 用于 CPC 培养时，用多聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐（1 mg/mL 溶于 150 mM 硼酸，pH 8.4）在室温下包被细胞培养板（6 孔或 12 孔板）至少 1 小时，随后在 37 °C 下用层粘连蛋白（1 mg/mL）在 CCM 培养基中过夜包被。
  2. CGNP 分离的准备工作
    1. 安排适当的小鼠交配，以获得用于小脑分离的 P5–P7 阶段动物（每个 ChIP 实验及条件需 3–5 只动物）。
    2. 通过向 HBSS 缓冲液中加入 6 mg/mL 葡萄糖，配制 HBSS/葡萄糖溶液。
    3. 通过向 DMEM-F12 培养基中添加 1%（v/v）N2 添加剂、1%（v/v）青霉素-链霉素-新霉素、25 mM KCl 和 10% FCS，配制 CGNP 细胞培养基（CGM）。用于 CGNP 培养时，配制不含 FCS 但含 0.6 µg/mL 声波刺猬因子（SHH）的 CGM 培养基（CGM-SHH），并在需要时将其平衡至 37 °C。
    4. 用 100 µg/mL 多聚-D-赖氨酸在室温下包被 6 孔细胞培养板 1–2 小时，以去除胶质细胞。随后用无菌 ddH2O 洗涤两次，并让培养板自然干燥。4 °C 下最多可储存一周。
    5. 用于 CGNP 培养时，在 4 °C 下用多聚-L-鸟氨酸（0.1 mg/mL）过夜包被 6 孔细胞培养板。随后用细胞培养级 H2O 洗涤两次，并让培养板自然干燥。
      注：培养板可在 4 °C 下最多储存一周。
    6. 根据需要，用 HBSS/葡萄糖溶液配制 0.025%（w/v）胰蛋白酶，并将其平衡至 37 °C。
  3. H3K79me2 ChIP 实验的准备工作
    1. 在染色质交联前新鲜配制 PFA（1% 溶于 PBS，pH 8）。配制方法：将 50 mL PBS 在微波炉中加热至不超过 65 °C，持续搅拌下向 PBS 中加入 0.5 mg PFA。然后加入 50 µL 10 M NaOH，待 PFA 完全溶解后，再加入 42.5 µL HCl（37% v/v）调节 pH 至 8。再次确认 pH 值后，使 1% PFA 溶液恢复至室温。
    2. 分别用无菌 ddH2O 配制 RNase（1 mg/mL）和蛋白酶 K（20 µg/µL）储存液。分装后储存于 -20 °C。
    3. 配制以下缓冲液和试剂：含 0.02% Tween 的 PBS、裂解缓冲液、甘氨酸、稀释缓冲液、ChIP 缓冲液 1、ChIP 缓冲液 2、ChIP 缓冲液 3 和 TE 缓冲液，并储存于 4 °C。每次实验均需新鲜配制洗脱缓冲液。
      1. 配制含 0.02% Tween 的 PBS。4 °C 下最多储存一周。
      2. 使用 50 mM Tris（pH 8.0）、10 mM EDTA、1%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）和 1× 蛋白酶抑制剂配制裂解缓冲液。
      3. 配制 2.5 M 甘氨酸溶液。
      4. 使用 20 mM Tris（pH 8.0）、150 mM NaCl、2 mM EDTA、1%（v/v）Triton X-100、0.25%（w/v）SDS 和 1× 蛋白酶抑制剂配制稀释缓冲液。
      5. 使用 20 mM Tris（pH 8.0）、150 mM NaCl、2 mM EDTA、1%（v/v）Triton X-100 和 0.2%（w/v）SDS 配制 ChIP 缓冲液 1。
      6. 使用 20 mM Tris（pH 8.0）、500 mM NaCl、2 mM EDTA、1%（v/v）Triton X-100 和 0.2%（w/v）SDS 配制 ChIP 缓冲液 2。
      7. 使用 20 mM Tris（pH 8.0）、250 mM LiCl、2 mM EDTA、1%（v/v）NP-40 和 1%（w/v）SDS 配制 ChIP 缓冲液 3。
      8. 使用 20 mM Tris（pH 8.0）和 2 mM EDTA 配制 TE 缓冲液。
      9. 新鲜配制含 1%（w/v）SDS 和 100 mM NaHCO3 的洗脱缓冲液。

2. 脑组织神经前体细胞的分离

  1. 皮质前体细胞的分离与可选培养
    1. 通过颈椎脱位法处死怀孕动物，并将胚胎转移至冰浴的HBSS中。
    2. 用剪刀去除颅骨并分离脑组织，然后使用小镊子去除脑膜（如适用），在体视显微镜下用小镊子（必要时配合小剪刀）去除两侧半球的其他脑组织，分离出皮层（全皮层、背侧皮层或腹侧皮层）。将分离得到的皮层组织置于5 mL HBSS缓冲液中，4℃保存。 °在15 mL离心管中。
    3. 将分离的脑组织在 1,000 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟 °C.
    4. 用5 mL冰冻的HBSS洗涤皮质组织，并使用1 mL移液枪头通过反复吹打进行匀浆。如有必要，可剪去移液枪头的尖端。
    5. 将匀浆后的样品在 4 °C 条件下以 1,000 x g 离心 5 分钟 °C. 移除HBSS。
    6. 加入3 mL胰蛋白酶，37℃孵育5分钟 °C.
    7. 加入 1 mL FCS、5 mL CCM 和 30 µ加入1 L DNase 1至样品中，使用5 mL玻璃移液管轻轻吹打混匀样品。
    8. 将分离的细胞在 4 °C 下以 1000 × g 离心 5 分钟 °C. 弃去上清液，加入5 mL CCM，再次匀浆样品。
    9. 稀释样品的一部分，使用血细胞计数板进行计数。平均数量为 4.5 x 106 每个胚胎预计可获得的细胞数量。如需培养分离的皮质前体细胞（CPCs），请继续进行步骤 2.1.10；如需进行染色质免疫沉淀（ChIP），请立即进行步骤 3。
    10. 用于培养时，将CPCs以8 x 10⁴至1 x 10⁵个细胞/cm²的密度接种于经多聚-L-鸟氨酸（0.1 mg/mL）和层粘连蛋白（1 mg/mL）包被的培养皿中4 和 2.5 × 105 细胞/平方厘米2 在CCM培养基中培养，并于37℃孵育 °C，5% CO2，以及100%相对湿度。
    11. 由于皮质前体细胞（CPCs）在体外培养中约4天后开始分化为神经元，应将解剖日期视为第0天 体外 0（第0天）。若需长期培养，每隔四天用新鲜的CCM培养基更换一半的培养液。
    12. 应用 1-5 µ在第0天（细胞分离后4-5小时）加入溶于DMSO的SGC0946或EPZ5676，并每隔两天更换一次。以DMSO作为对照处理。如需验证抑制剂处理效率，可通过标准免疫印迹方法进行检测。
  2. 小脑颗粒神经元前体细胞的分离与可选培养
    1. 使用剪刀对P5-7日龄动物进行断头处死。剪除头皮，打开颅骨，用小剪刀和镊子取出脑组织。分离小脑，并转移至预冷的HBSS/葡萄糖溶液中。去除所有脑膜和血管，将小脑转移至装有冷HBSS/葡萄糖溶液的15 mL离心管中。
    2. 用 10 mL 冰冷的 HBSS/葡萄糖洗涤小脑三次（每次以 650 × g 离心 5 分钟，4 °C 条件下收集组织） °C）随后使用1 mL移液器轻轻吹打2-3次（最多2-3次），使小脑组织匀浆化，获得0.5-1 mm大小的组织碎片3 片段
    3. 加入5 mL含葡萄糖的HBSS中配制的0.025%胰蛋白酶，将组织置于37℃下持续搅拌孵育 °在37°C水浴中孵育15分钟。加入5 mL CGM终止消化，于4°C、650 × g离心5分钟收集组织 °C.
    4. 吸除上清液，用1 mL移液器枪头在1 mL CGM中吹打重悬组织，转移至新的15 mL离心管中。
      注意：必须避免产生气泡。
      1. 加入5 mL CGM，冰上孵育混合物2分钟以沉淀组织残余物。将上清液转移至新的15 mL离心管中。向残留组织中加入2 mL CGM，重复吹打操作。
    5. 将上清液（不含组织残渣，总体积约10 mL）合并，在4℃下以650 × g离心5分钟 °C 收集小脑细胞。将沉淀重悬于 10 mL CGM 中。
    6. 由于星形胶质细胞在聚-D-赖氨酸上的黏附速度和强度均高于CGNPs，因此将细胞接种于100 µg/mL 多聚-D-赖氨酸包被的6孔板（每孔最多4 mL），于37℃孵育20分钟 °C 以去除星形胶质细胞。
    7. 轻轻振荡培养板并收集上清液，随后在4℃下以650 × g离心5分钟 °在15 mL离心管中。用10 mL CGM重悬细胞沉淀，并使用Neubauer计数板进行细胞计数。
      注意：使用相差显微镜观察时，CGNPs 呈圆形、体积较小，并显示晕轮状结构。
    8. 如需要，将细胞接种于37 °将预热的 CGM 加入经多聚-L-鸟氨酸包被的培养板中（3 x 106 每6孔细胞数）并在37℃培养 °C，5% CO₂2 和100%相对湿度。
      注意：如果未进行接种，则继续执行步骤 3.1。
      1. 6–12 小时后，更换为 CGM-SHH 培养基。在分离后 6 小时（或更换为 CGM-SHH 时）用 DOT1L 抑制剂和 DMSO 对照处理分离的 CGNPs，并每隔两天更换一次（参见 2.1.12）。如需验证抑制剂处理效率，可通过标准免疫印迹方法进行检测。如进行 ChIP 实验，请继续执行步骤 3.3。
        注意：将CGM保留在培养板上（以及其中的FBS）将导致CGNPs分化为小脑颗粒神经元（CGNs）。

3. 细胞固定与染色质剪切

注意：如果细胞尚未培养，则执行步骤 3.1 和 3.2；如果已完成培养，则直接进入步骤 3.3。

  1. 以 1,000 × g 离心 4 分钟收集细胞，并加入 1.3 mL PBS。将样品转移至 1.5 mL 离心管中，在 4°C 下以 1,000 × g 离心 4 分钟。用 1.3 mL PBS 洗涤样品两次。
  2. 关键步骤：向样品中加入 350 µL 1% 多聚甲醛（PFA），在 22 °C 下孵育 5 分钟。为终止反应，加入 18.4 µL 甘氨酸和 1 mL PBS。在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟。
    1. 用预冷的 PBS 洗涤样品两次。在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟收集固定后的细胞。此后所有操作均需将样品置于冰上。
      注意：固定时间必须精确为 5 分钟，以获得最佳结果。不同数量的细胞可能需要调整时间。
  3. 关键步骤：对于培养的 CGNP（或 CPC）细胞，直接向细胞培养板孔中加入最多 1 mL 的 1% PFA。在 22 °C 下孵育 5 分钟后，加入适量的甘氨酸和 PBS，并用细胞刮刀收集细胞。
    1. 将细胞转移至 1.5 mL 离心管中，在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟。用预冷的 PBS 洗涤样品两次。在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟收集固定后的细胞。此后所有操作均需将样品置于冰上。
  4. 关键步骤：加入 700 µL 裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），在 4 °C 下孵育 15 分钟。每 5 分钟涡旋震荡一次。在超声破碎仪中以最大功率对裂解细胞的染色质进行超声处理，共 3 次，每次 10 分钟（脉冲 30 秒，间歇 30 秒）。
    1. 确保每管体积不超过 350 µL。每 10 分钟涡旋震荡一次样品。使用相差显微镜检查裂解液中是否残留细胞核。
      注意：为后续分析获得最佳剪切效果至关重要（可与图 1B比较）。若采用其他方法剪切染色质，应优化条件，使染色质片段大小控制在 200–500 bp 范围内。
  5. 在 4 °C 下以 13,000 × g 离心 10 分钟，沉淀细胞残渣。上清液用于步骤 5.2 的预清除。如需后续使用，可将样品在 -20 °C 冻存。

4. 磁珠的准备与预清除

  1. 使用磁力架，将 45 µL 蛋白 A 磁珠/ChIP 和 20 µL 磁珠/样本用含 0.02% Tween 的 1 mL 冰冷 PBS 洗涤三次。然后向磁珠中加入 1 mL 冰冷 PBS。
  2. 向 1 mL 冰冷 PBS 和 45 µL 磁珠/ChIP 中加入 3 µg 抗体/ChIP（H3K79me2 或兔 IgG）。在 4 °C 下于旋转仪上孵育 2 小时，使抗体与磁珠结合。根据所用抗体的不同，使用约 3 µg 抗体/ChIP。
  3. 用含 0.02% Tween 的 1 mL 冰冷 PBS 将结合抗体的磁珠洗涤三次。向洗涤后的抗体偶联磁珠中加入适量体积的冰冷 PBS（即最初使用的磁珠起始体积）。
  4. 向样本中加入 600 µL 稀释缓冲液和 20 µL 洗涤后的磁珠进行预清除（总体积为 1,320 µL），在 4 °C 下于旋转仪上孵育 2 小时。使用磁力架去除磁珠。取 5%（33 µL）裂解液作为输入样本，并于 -20 °C 冻存。

5. 染色质免疫沉淀

  1. 将预清除的提取物分装至两个离心管中（每管约 643.5 µL），加入等体积的稀释缓冲液以及抗体结合磁珠（每样本 45 µL；H3K79me2 或兔 IgG）。在 4 °C 下于旋转仪上孵育过夜。
  2. 在 4 °C 下，于旋转仪上依次用冰浴的 ChIP 缓冲液 1、ChIP 缓冲液 2 和 ChIP 缓冲液 3 各洗涤磁珠 10 分钟。随后，在 4 °C 下于旋转仪上用 TE 缓冲液洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 在室温下，以 1,400 rpm 的转速在振荡器中用洗脱缓冲液洗脱磁珠 1 小时。
  4. 每份 ChIP 样本加入 10 µg RNase（1 mg/mL），每份输入样本加入 5 µg，于 37 °C 孵育 30 分钟（1,400 rpm）。
  5. 每份 ChIP 样本加入 100 µg 蛋白酶 K（20 µg/µL），每份输入样本加入 50 µg，于 65 °C 孵育过夜（1,400 rpm）。

6. ChIP 样品的纯化

  1. 使用DNA纯化试剂盒（参见材料表）按照说明书纯化ChIP和input样品。当预期DNA量超过5 µg时，使用更多的纯化柱。用试剂盒提供的DNA洗脱缓冲液分两次、每次15 µL洗脱样品。
  2. 使用可视化荧光染料和荧光分光光度计（参见材料表）对样品进行定量（使用1 µL）。

7. 通过qPCR分析ChIP样品

  1. 进行 qPCR 分析的引物设计时，从 Integrative Genomics Viewer (IGV) 浏览器34中获取感兴趣的基因组序列。由于 H3K79me2 通常位于转录起始位点（TSS）附近，因此应在基因的 TSS 周围设计引物。作为对照，可选择非编码基因组区域，或 TSS 上游约 10 Kb 或转录终止位点（TES）下游 10 Kb 的区域。
    1. 使用 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 设计引物，扩增产物大小设定为 70–200 bp，退火温度优化设定为 60 °C。为测试目的，可使用 表1 中列出的针对基因组区域 Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, 和 Npm1 的引物。
  2. 使用以下 qPCR 程序、主混合液以及 58 °C 至 63 °C 的退火温度梯度对新设计的引物进行测试，并选择扩增产物数量最多、质量最高的退火温度。
    1. 通过 DNA 琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物的预期大小。进行 qPCR 分析时，使用实时荧光定量 PCR 检测系统（见 材料表）。
    2. 配制主混合液：10 µL DNA 聚合酶主混合液，0.5 µL 正向引物（10 µM），0.5 µL 反向引物（10 µM），4 µL 无核酸酶水，以及 5 µL DNA（1 ng/µL）。
    3. 采用两步法 qPCR 程序：95 °C 预变性 5 分钟；50 个循环（95 °C 变性 30 秒，58 °C–63 °C 退火/延伸 30 秒）；最后在 4 °C 持续降温。
  3. 制备基因组 DNA 样品（经剪切并纯化）的稀释系列（2 ng/µL、1 ng/µL、0.5 ng/µL、0.25 ng/µL 和 0.125 ng/µL），每份取 5 µL 进行 qPCR 效率检测。根据标准曲线计算斜率，并使用以下公式计算引物扩增效率：
    扩增效率 (%) = (10^(-1/斜率) - 1) × 100。
    1. 理想情况下应选用扩增效率在 90%–105% 之间的引物，最低不应低于 85%–115%。
  4. 分析 ChIP 和 input 样品时，每个 qPCR 反应体系中加入 0.1–1 ng ChIP DNA，相应量的正向与反向引物、无核酸酶水及 DNA 聚合酶主混合液，最终反应体积为 20 µL。
  5. 测定 ChIP 和 input 样品的阈值循环（Ct）值，将 ChIP 样品的 Ct 值相对于 input 样品的 Ct 值进行归一化，使用以下公式计算富集程度（占 input 的百分比）。使用 IgG 对照组获得的 Ct 值确定背景水平。
         % input = 100 - 2^(归一化 input − 归一化 ChIP)
         归一化 input = Ct (input) − log2(稀释倍数)
         归一化 ChIP = Ct (ChIP) − log2(稀释倍数)
    注：归一化 = normalized

8. 通过测序分析ChIP样品

  1. 将ChIP样品（input和免疫沉淀的DNA样品）转移至测序机构。
  2. 为预先制备文库，使用合适的文库制备试剂盒（见材料表），将2 ng input DNA以及全部免疫沉淀DNA转化为带有索引的文库，用于指定平台的下一代多重测序（见材料表）。
  3. 关键步骤：根据试剂盒说明书，将测序接头（工作浓度为15 µM）连接至末端修复并加dA尾的DNA片段。测序接头和PCR引物使用适当的寡核苷酸（见材料表）。针对此量的input DNA，使用6–9个PCR循环以富集接头连接的DNA片段。
    注意：通常无需对连接接头后的DNA进行片段大小选择。应尽可能使用最少的PCR循环数，因为过多的PCR扩增循环会导致PCR重复序列增多以及GC偏好性升高。
  4. 为最终文库检测，取总反应体系中的0.5 µL进行分析，使用适当设备观察片段大小分布（见材料表）。定量时，使用荧光染料结合荧光分光光度计或其他方法（见材料表）。
  5. 由于H3K79me2是一种在较大基因组区域内广泛分布的组蛋白修饰，建议对样品进行双端测序，读长为50 bp，测序深度为7500万条reads。
  6. 使用Galaxy/弗莱堡大学服务器（galaxy.uni-freiburg.de）分析ChIP-seq数据。
  7. 使用FastQC对获得的ChIP-seq数据进行质量控制，并根据需要直接使用Bowtie2版本2.2.035进行比对（可选择是否进行修剪）。参考基因组组装使用mm9或最新版本mm10；参考注释使用Ensembl FTP release 79。
  8. 可选：在峰识别前使用Picard MarkDuplicates（http://broadinstitute.github.io/picard）去除读段重复序列。
  9. 使用MACS2版本2.1.036，选择“broad”选项进行H3K79me2的峰识别。
  10. 为获得ChIP样品与input样品之间的log2比值，使用BamCoverage和BamCompare计算两样品读段数比值的log2值。
  11. 对于所有其他深入的ChIP-seq特异性分析，应用deepTools2版本2.3.5或2.4.137，例如生成覆盖度轨迹文件（仅ChIP使用bamCoverage，ChIP与input比较使用bamCompare），使用plotFingerprint评估ChIP实验效果，使用computeMatrix和plotHeatmap生成总体概览。在computeMatrix过程中选择K均值聚类，以根据H3K79me2分布对基因组区域进行聚类。
  12. 可使用NCBI数据库中已发表的E14.5 DT阶段H3K79me2 ChIP-seq数据作为测试用途（登录号：SRP057733）。

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结果

神经前体细胞分离、培养、H3K79me2 染色质免疫沉淀（ChIP）及 ChIP 分析方法的总体方案： 图1 展示了在胚胎脑发育不同时期的皮层前体细胞或出生后阶段的小脑颗粒神经元前体细胞中进行 H3K79me2 ChIP 的流程图。第一步是分离脑组织，并获取端脑（E11.5 至 E14.5）或小脑（P5-P7）。可通过将端脑分为背侧端脑（DT）和腹侧端脑（VT）来分别分析其不同区域。随后对组织进行匀浆处理，并分离神经前体细胞。此时可选择将前体细胞进行培养并用 DOT1L 抑制剂处理；另一种选择是直接固定前体细胞并进行 ChIP 操作。在 ChIP 过程中，染色质将被剪切为 200–500 bp 的片段，并与磁珠偶联的抗 H3K79me2 抗体孵育。洗涤磁珠并回收 DNA 后，可对沉淀的 DNA 进行测序或定量 PCR（qPCR）分析（图1A）。染色质剪切后应获得良好的片段大小分布，因此建议通过 DNA 琼脂糖凝胶电泳或其...

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讨论

检测组蛋白修饰、转录因子、组蛋白密码阅读蛋白、书写蛋白或擦除蛋白在基因组上的占据情况，主要有两种染色质免疫沉淀方法。一种是使用核酸酶消化的天然染色质进行免疫沉淀的天然ChIP方法，另一种则是本研究所采用的方法，即使用PFA固定的、经超声破碎的染色质，其中核小体及其他DNA结合蛋白通过共价键与DNA交联39。由于染色质和组蛋白甲基化在ChIP过程中相对稳定，且天然ChIP具有较高的抗体检测效率，因此适用于组蛋白甲基化的检测。然而，该方法需要大量起始材料，故不适用于皮层或小脑发育的研究，因为在这些研究中从小鼠脑组织获得的细胞数量通常有限。尽管抗体通常是针对非固定材料制备的，但我们已证实该抗体可特异性识别H3K79me2，因为特异性抑制DOT1L会导致ChIP-qPCR分析和免疫印迹中H3K79me2信号的减弱（图2A 和 图3A）。使用交联材料进行ChIP可能效率较低，但本方案所提供的流程能够确保获得足量且特异性富集的材料，用于qPCR和测序分析。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益

致谢

感谢Henriette Bertemes协助在实验室中建立CGN培养方案。本方法论文由德国研究基金会（DFG）资助的CRC992医学表观遗传学项目对TV的资助支持。作者感谢德国弗莱堡大学生物信息学系的弗莱堡Galaxy团队（Pavankumar Videm、Björn Grüning和Prof. Rolf Backofen）提供的支持，该支持由合作研究中心992医学表观遗传学（DFG资助号SFB 992/1 2012）和德国联邦教育与研究部（BMBF资助号031 A538A RBC（de.NBI））提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗-GAPDHAbcamab8245类别： 抗体
缩写/备注： 免疫印迹稀释比例 1:5000
抗-H3Abcamab1791类别： 抗体
缩写/备注： 免疫印迹稀释比例 1:3000
抗-H3K79me2DiagenodepAb-051-050类别： 抗体
缩写/备注： 染色质免疫沉淀抗体
抗-H3K79me2Abcamab-051-050类别： 抗体
缩写/备注： 免疫印迹稀释比例 1:1000
抗兔IgGDiagenodeC15410206类别： 抗体
缩写/备注： 染色质免疫沉淀对照抗体
抗微管蛋白αAbcamab108629类别： 抗体
缩写/备注： 免疫印迹稀释比例 1:3000
转铁蛋白（1 mg/ml）Sigma-AldrichT1147类别： 细胞培养
缩写/备注： 用于皮质细胞培养基（CCM）
B27添加剂（50倍浓缩）Life Technologies17504044类别： 细胞培养
缩写/备注： 用于皮质细胞培养基（CCM）
BioanalyzerAgilent technologiesG2940CA类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： 用于剪切染色质的分析
Bioruptor NextGenDiagenodeB01020001类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： 超声破碎仪
硼酸 pH 8.4Sigma AldrichB6768类别： 细胞培养
缩写/备注： 用于皮质前体细胞（CPC）培养
CFX Connect RT PCR 检测系统Bio-Rad1855201类别： 染色质免疫沉淀分析
缩写/备注： qPCR检测系统
DMEM-F12Life Technologies11320-033类别： 细胞培养
缩写/备注： 用于小脑颗粒神经元前体细胞培养基（CGM）
Dynabeads Protein AInvitrogen10001D类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： 磁珠，用于染色质免疫沉淀
EPZ-5676SelleckchemS7062类别： DOT1L抑制
缩写/备注： 用于细胞培养中DOT1L的抑制
乙二胺四乙酸SERVA39760.01类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： EDTA
胎牛血清 10% (v/v)Gibco10082147类别： 细胞培养
缩写/备注： 用于皮质前体细胞分离和小脑颗粒神经元前体细胞培养基（CGM）
葡萄糖Sigma-AldrichG5767类别： 细胞培养
缩写/备注： 用于小脑颗粒神经元前体细胞（CGNP）分离
谷胱甘肽（1.25 mg/ml）Sigma-AldrichG4251类别： 细胞培养
缩写/备注： 用于皮质细胞培养基（CCM）
甘氨酸Carl Roth3187类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： 用于细胞固定
GoTaq预混液PromegaA6002类别： 染色质免疫沉淀分析
缩写/备注： qPCR用DNA聚合酶预混液
Hank’s平衡盐溶液Life Technologies14025-100类别： 细胞培养
缩写/备注： HBSS
L-谷氨酰胺（200 mM）Life Technologies25030081类别： 细胞培养
缩写/备注： 用于皮质细胞培养基（CCM）
层粘连蛋白Sigma-AldrichL2020类别： 细胞培养
缩写/备注： 用于皮质前体细胞（CPC）培养
氯化锂Sigma-AldrichL4408类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： LiCl
N2添加剂Life Technologies17502048类别： 细胞培养
缩写/备注： 用于小脑颗粒神经元前体细胞培养基（CGM）
NanoDrop 3300Thermo Fisher3300类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： 用于DNA定量的荧光分光光度计
NEB Next Ultra DNA文库制备试剂盒（适用于Illumina）NEBE7645S类别： 染色质免疫沉淀分析
缩写/备注： 文库制备试剂盒
NEBNext多重寡核苷酸（适用于Illumina）NEBE7335类别： 染色质免疫沉淀分析
缩写/备注： 文库制备用寡核苷酸
Neurobasal培养基Gibco21103049类别： 细胞培养
缩写/备注： 用于皮质细胞培养基（CCM）
NP-40替代物Calbiochem492016类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： 用于染色质免疫沉淀缓冲液
多聚甲醛Carl Roth335类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： PFA，用于细胞固定
青霉素-链霉素-新霉素 1% (v/v)Life Technologies15640055类别： 细胞培养
缩写/备注： PSN，用于皮质细胞培养基（CCM）和小脑颗粒神经元前体细胞培养基（CGM）
磷酸盐缓冲液Life Technologies10010023类别： 细胞培养
缩写/备注： PBS，用于皮质前体细胞（CPC）分离
PicoGreen试剂盒Thermo FisherP11496类别： 染色质免疫沉淀分析
缩写/备注： 用于DNA定量的荧光染料
聚-D-赖氨酸Sigma-AldrichP6407类别： 细胞培养
缩写/备注： 用于小脑颗粒神经元前体细胞（CGNP）分离
聚-L-鸟氨酸盐酸盐Sigma AldrichP3655类别： 细胞培养
缩写/备注： 用于皮质前体细胞（CPC）培养
氯化钾Thermo FisherAM9640G类别： 细胞培养
缩写/备注： KCl，用于小脑颗粒神经元前体细胞培养基（CGM）
蛋白酶抑制剂Roche4693159001类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： 用于染色质免疫沉淀
蛋白酶KSigma-Aldrich3115879001类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： 用于染色质免疫沉淀
Qiagen MinEluteQiagen28004类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： DNA纯化试剂盒
RNA酶Sigma-AldrichR6513类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： 用于染色质免疫沉淀
SGC0946SelleckchemS7079类别： DOT1L抑制
缩写/备注： 用于细胞培养中DOT1L的抑制
碳酸氢钠Carl Roth8551.1类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： 用于洗脱缓冲液
氯化钠Carl Roth9265类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： NaCl，用于染色质免疫沉淀缓冲液
脱氧胆酸钠Sigma-Aldrich30970类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： 用于染色质免疫沉淀
十二烷基硫酸钠Carl Roth183类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： SDS，用于染色质免疫沉淀
音猬因子（SHH）Sigma-AldrichSRP6004类别： 细胞培养
缩写/备注： 用于小脑颗粒神经元前体细胞（CGNP）分离
超氧化物歧化酶（1mg/ml）Sigma-AldrichS7571类别： 细胞培养
缩写/备注： 用于皮质细胞培养基（CCM）
三羟甲基氨基甲烷Carl Roth9090类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： TRIS，用于染色质免疫沉淀缓冲液
吐温X-100Carl RothX100类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： 用于染色质免疫沉淀缓冲液
胰蛋白酶-EDTA 0.05% (w/v)Sigma Aldrich59417C类别： 细胞培养
缩写/备注： 用于皮质前体细胞（CPC）分离
吐温20Carl Roth28320类别： 染色质免疫沉淀
缩写/备注： 用于磁珠制备
其他实验室设备：血球计数板、培养箱、旋转仪、摇床、解剖工具组、水浴锅
CCM：皮质细胞培养基
CGM：小脑颗粒神经元前体细胞培养基

参考文献

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