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方法文章

一种新型方法 体外 利用pH指示剂标记的突触体进行星形胶质细胞介导的吞噬作用活体成像分析

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DOI：

10.3791/56647

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2018年2月5日

 , 
1Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology

本文内容

摘要

本方案介绍了一种 体外 活体成像吞噬作用检测法用于测量星形胶质细胞的吞噬能力。该方法采用纯化的大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞，结合pH指示剂标记的突触体。此技术可实时检测吞噬和降解动力学，为筛选调控星形胶质细胞吞噬作用的因素提供了一个合适的平台。

摘要

星形胶质细胞是大脑中的主要细胞类型，直接与突触和血管接触。尽管小胶质细胞一直被认为是大脑中主要的免疫细胞及唯一的吞噬细胞，但近期研究表明，星形胶质细胞也参与多种吞噬过程，例如发育过程中的突触消除以及阿尔茨海默病（AD）中淀粉样蛋白β斑块的清除。尽管已有这些发现，与小胶质细胞相比，星形胶质细胞对其靶标的吞噬和降解效率仍不明确。这一信息的缺乏主要归因于尚无一种可便捷比较星形胶质细胞与小胶质细胞介导的吞噬作用动力学的检测系统。为实现这一目标，我们建立了一种长期活体成像 体外 吞噬作用检测法用于评估纯化星形胶质细胞和小胶质细胞的吞噬能力。该实验中，通过使用pH指示剂偶联的突触体，可实时检测吞噬与降解过程，这些突触体在溶酶体等酸性细胞器中会发出明亮的红色荧光。我们建立的新型检测方法通过活细胞成像实现了对吞噬作用的简便且高效检测。此外，该方法 体外 吞噬作用检测可作为筛选平台，用于鉴定能够增强或抑制星形胶质细胞吞噬能力的化学物质和化合物。由于突触修剪功能障碍和致病蛋白的积累已被证实可导致精神障碍或神经退行性疾病，因此能够调节胶质细胞吞噬能力的化学物质和化合物在治疗多种神经系统疾病方面应具有潜在应用价值。

引言

胶质细胞是指大脑中的非兴奋性细胞，是中枢神经系统（CNS）中的主要细胞类型。过去，胶质细胞被认为仅仅是支持性细胞，主要在维持神经元存活和基础突触特性方面发挥被动作用。然而，越来越多的证据表明，胶质细胞在神经生物学的多个方面发挥着更为主动的作用，例如维持脑内环境稳态、介导突触形成1,2,3 和突触消除4,5，以及调节突触可塑性6,7。中枢神经系统中的胶质细胞包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞。其中，已有研究表明星形胶质细胞和小胶质细胞可通过吞噬突触4,5、凋亡细胞8、神经碎片9 以及致病蛋白（如β-淀粉样蛋白斑块）10,11 发挥吞噬功能。在发育中的大脑中，星形胶质细胞通过依赖MERTK和MEGF10的吞噬作用消除背外侧膝状体核（dLGN）中的突触4。类似地，小胶质细胞在发育阶段也通过经典补体级联反应清除被C1q标记的突触5。有趣的是，有研究提示突触修剪缺陷可能是多种神经系统疾病发生的起始因素之一。例如，已有研究表明补体成分4（C4）的突变会增强小胶质细胞介导的补体依赖性突触修剪，且该突变与人类精神分裂症的高发显著相关12。最近的一项研究还表明，在阿尔茨海默病（AD）发病初期，经典补体通路被过度激活，并导致该疾病早期的突触丢失13。

与小胶质细胞介导的吞噬作用相比，星形胶质细胞介导的吞噬作用是否参与多种神经系统疾病的起始和进展尚不明确。然而，最近一项研究表明，能够改变星形胶质细胞正常突触修剪速率的因素可能会破坏脑内稳态，并增加阿尔茨海默病（AD）的易感性和病理变化14。星形胶质细胞的突触修剪速率受到ApoE同工型的强烈调控，其中对AD具有保护作用的等位基因（ApoE2）显著增强修剪速率，而增加AD风险的等位基因（ApoE4）则显著降低该速率。此外，表达ApoE4的转基因小鼠比对照组或表达ApoE2的小鼠积累了更多的突触C1q14。这些数据提示，在AD早期脑组织中，星形胶质细胞介导的吞噬功能受损可能导致衰老的C1q包被突触/突触碎片的积聚，从而激活补体介导的小胶质细胞吞噬作用，驱动突触退变。ApoE4携带者星形胶质细胞吞噬能力的下降也可能导致AD病变脑中β-淀粉样蛋白斑块的失控性积聚。

此外，已有研究表明，衰老的黑腹果蝇（Drosophila）大脑中的胶质细胞由于Draper（一种同源蛋白）翻译水平下降，导致其吞噬能力丧失。 Megf10 星形胶质细胞利用 Draper 进行突触的吞噬。恢复 Draper 水平可挽救胶质细胞的吞噬能力，使其在老年大脑中高效清除受损的轴突碎片，清除程度与年轻大脑相当，表明衰老引起的星形胶质细胞吞噬功能改变可能参与了脑内稳态的破坏。15.

基于这些新发现，调节星形胶质细胞的吞噬能力可能是一种预防和治疗多种神经系统疾病的有吸引力的治疗策略。在这方面，已有若干尝试旨在增强星形胶质细胞的吞噬能力，例如通过酸性纳米颗粒诱导溶酶体酸化16，或过表达可促进溶酶体生成的转录因子EB（TFEB）17。尽管如此，目前仍不清楚星形胶质细胞与小胶质细胞在吞噬动力学方面有何差异，以及在不同疾病中我们是否应增强或抑制它们的吞噬能力。

在本文中，我们介绍了一种新型的 体外 实时检测星形胶质细胞吞噬能力的实验。数据显示，星形胶质细胞与小胶质细胞在吞噬和降解过程中表现出不同的动力学特征。含有星形胶质细胞分泌因子的星形胶质细胞条件培养基（ACM）对于星形胶质细胞和小胶质细胞的有效吞噬作用至关重要。此外， Megf10，星形胶质细胞中的一种吞噬受体及其同源物 Ced-1 和 Draper在星形胶质细胞介导的吞噬作用中发挥关键作用8,18.

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方案

本研究所述所有方法均已获得韩国科学技术院机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准，批准编号为KA2016-08。

1. 突触体纯化

注意：这些步骤改编自先前发表的一篇论文19，并进行了若干修改，以提高纯化突触体的得率（图1）。

  1. 制备不连续密度梯度介质。
    1. 将以下物品置于冰上：3%、10% 和 23% 的密度梯度溶液（用 250 mL 水配制，含 109.54 g 蔗糖、606 mg Tris 和 5 mL 0.2 M EDTA，pH 7.4）；匀浆缓冲液（将 25 mL 4×梯度缓冲液和 500 µL 50 mM DTT 加入 74.5 mL 水中）；匀浆器研钵和研杵。
      注意：密度梯度溶液及其制备方法见下文 表1. 为制备3%、10%和23%的密度梯度溶液，使用原始密度梯度溶液。
    2. 每三只成年小鼠准备六支超透明离心管。
    3. 在每个离心管底部，用1 mL移液器加入3 mL 23%密度梯度溶液。然后，用巴斯德移液管和1 mL移液器，缓慢地在23%密度梯度溶液上方叠加3 mL 10%密度梯度溶液。最后，在上层加入3 mL 3%密度梯度溶液。此步骤中需小心操作，避免产生气泡。
    4. 用塑料薄膜封住离心管，并将管子置于冰上。
  2. 将高速离心机和超速离心机预冷至 4 °C。
  3. 用70%乙醇对手术器械（手术剪、Castroviejo弹簧剪和弯头镊）进行消毒。准备一个装有25 mL匀浆缓冲液的小玻璃烧杯置于冰上，并称量烧杯重量。
  4. 从三只成年（约12周龄）雄性小鼠中取出脑组织。
    1. 脱位颈椎，使用手术剪剪开颈部。用手术剪和弯头镊沿中线剥离头部和颅骨的皮肤。使用Castroviejo弹簧剪切除嗅球和小脑。
  5. 用弯头镊子将剩余脑组织放入烧杯中并称重。用预冷的匀浆缓冲液多次冲洗脑组织，以去除脑表面的血液。
    注意：此前建议每1克脑组织使用9 mL匀浆缓冲液。
  6. 将4 mL匀浆缓冲液和1 g脑组织加入匀浆器研钵中。在匀浆过程中，继续加入匀浆缓冲液至总体积达8 mL。
  7. 将匀浆液分装至两个50 mL高速离心管中。用1 mL新鲜匀浆缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液加入离心管中。
    注意：请尽快完成步骤 1.3–1.7，建议用时少于 20 分钟。
  8. 在4 °C条件下，使用高速离心管以1,000 x g离心10分钟，刹车速度调至较慢。
    注意：当最大减速速率为9时，将减速率（制动）设置为2或3。
  9. 小心地将上清液加入一个新的50 mL离心管中，并加入最多12 mL的匀浆缓冲液。
  10. 用1 mL移液器将2 mL稀释后的上清液小心缓慢地加至3%密度梯度溶液上方，并将试管置于冰上。
  11. 在 4 °C 条件下以 31,000 × g 离心 5 分钟，不使用刹车。
    注意：将减速速率设置为一（零）或惯性停止模式。
  12. 将试管置于冰上，用2 mL移液器收集23%密度梯度溶液与10%密度梯度溶液之间的突触体组分至50 mL离心管中。加入预冷的蔗糖/EDTA缓冲液至终体积80 mL，并分装至四个50 mL高速离心管中。
    注意：参见 图3 用于标记梯度的分级突触体。
  13. 在 4 ˚C 条件下，以 20,000 x g 离心 30 分钟，尽量减少停顿。
    注意：当最大减速速率为9时，将减速率设置为2或3。
  14. 用1 mL移液器小心吸除上清液，用1 mL等渗生理缓冲液（140 mM NaCl，3 mM KCl，1.2 mM MgCl₂，1.2 mM NaH₂PO₄，10 mM HEPES，pH 7.4）重悬突触体沉淀2，1.2 mM NaH2PO4，10 mM HEPES 和 10 mM 葡萄糖，pH 7.4）20加入1 mL含10% DMSO的等渗生理缓冲液（DMSO终浓度为5%），并将突触体收集至一个50 mL高速离心管中。
  15. 将1 mL分装至1.5 mL离心管中。使用Bradford法测定突触体的蛋白浓度。
  16. 迅速将试管冷冻，并置于-80 °C超低温冰箱中保存，直至进行pH指示剂偶联。

2. pH 指示剂偶联

  1. 将含有突触体的1.5 mL离心管在4 °C下以21,092 × g离心3–4分钟。
  2. 弃去上清液，加入200 µL的0.1 M Na2CO3，并通过移液充分混匀。
    注意：添加Na2CO3以提高pH值，因为琥珀酰亚胺酯在弱碱性pH条件下与伯胺反应效率最高。
  3. 向离心管中加入2 µL pH指示剂，并轻轻涡旋混匀。
    注意：每0.3 mg突触体溶液使用1 µL pH指示剂。
  4. 用铝箔包裹离心管以尽量减少光照，并在室温（RT）下于摇床中以30–40 rpm的温和振荡条件孵育1–2小时。
  5. 停止振荡，加入1 mL DPBS。
  6. 将离心管以21,092 × g离心1–2分钟。
  7. 弃去上清液，加入1 mL DPBS，通过轻柔移液重悬沉淀。
  8. 重复步骤2.6–2.7至少七次，以去除未结合的pH指示剂。
  9. 弃去上清液，用含5% DMSO的200 µL DPBS重悬沉淀。
    注意：此时所有突触体均已失去功能。我们已证实磷脂酰丝氨酸（PS）已暴露于突触体的外膜，其作为"吃我"信号发挥作用（图4）。

3. 星形胶质细胞和小胶质细胞的纯化

注意：本星形胶质细胞纯化方案改编自先前发表的论文21。本方案描述了大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞的纯化过程。有关小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞纯化的具体步骤也在注释中进行了说明。

  1. 纯化前一天
    1. 准备预包被的细胞培养皿和溶液。
    2. 准备五个直径为145 mm、高20 mm的培养皿，每皿中加入25 mL 50 mM Tris-HCl（pH 9.5）。分别将一抗或二抗处理液置于培养皿中，具体操作如下所述。将培养皿于冰箱中孵育过夜。
      BSL-1培养皿：20 µL 的5 mg/mL BSL-1（香猪母草凝集素）
      仅二抗对照组：60 µL 的 2.4 mg/mL 山羊抗小鼠 IgG+IgM（H+L）
      CD45 培养皿：60 µL 2.4 mg/mL 羊抗小鼠 IgG+IgM（H+L）
      O4 培养皿：60 µL 2.4 mg/mL 羊抗小鼠 IgM（针对 µ 链）
      Itgb5（整合素β5）大鼠星形胶质细胞培养皿：60 µL 2.4 mg/mL 羊抗小鼠 IgG+IgM（H+L）
      注意：为将二抗结合到培养皿的疏水表面，建议在低温下进行缓慢孵育。然而，也可在37 °C下孵育2小时完成培养皿的二抗包被。星形胶质细胞筛选所用抗体因动物物种而异；例如，用于小鼠星形胶质细胞的HepaCAM培养皿：加入60 µL浓度为2.4 mg/mL的 goat anti-mouse IgG+IgM (H+L)
  2. 净化日
    1. 准备进行免疫筛选。
    2. 准备50 mL离心管，并向管中加入储备液。储备液的详细配制方法见下文 表1.
      1. 制备试管1（酶液）：22 mL 酶储备液（酶储备液：1×Earle's 平衡盐溶液（EBSS）+ 0.46% D(+)-葡萄糖 + 26 mM NaHCO₃）3 和0.5 mM EDTA
      2. 制备2号管（低卵清蛋白）：42 mL 抑制剂储备液（抑制剂储备液：1×EBSS + 0.46% D(+)-葡萄糖 + 26 mM NaHCO₃）3).
      3. 准备3号管（高Ovo）：10 mL抑制剂储备液。
    3. 将0.22 µm注射器滤器连接至与CO相连的2 mL移液器尖端2 (95% O₂)2 和5% CO2）储罐。气泡 CO2 加入试管1-3中。当溶液变为橙色时，停止通气。
    4. 完成溶液的配制。
      注意：在用于酶活化前，需将1号管中的溶液彻底混匀，并在34 °C下孵育15分钟。
      1. 制备1号管（酶溶液）：22 mL 酶母液 + 180 U 木瓜蛋白酶 + 0.004 g L-半胱氨酸。
      2. 准备2号管（低Ovo）：42 mL 抑制剂储备液 + 3 mL 低Ovo + 200 µL DNase。
      3. 准备3号管（高Ovo）：10 mL抑制剂储备液 + 2 mL高Ovo + 20 µL DNase。
      4. 准备第4管（0.2% BSA）：19 mL 1X DPBS + 1 mL 4% BSA + 8 µL DNase。
      5. 准备第5管（0.02% BSA）：45 mL 1X DPBS + 5 mL 第4管溶液 + 50 µL DNase。
    5. 将水浴锅和加热块预热至 34 °C。
  3. 提取大鼠皮层。
    1. 用70%乙醇对手术器械进行灭菌，并准备含有DPBS的100毫米培养皿。
    2. 准备一个丙烯酸盒子。在盒子底部放入两到三层纸巾，并向盒内加入1 mL异氟烷。
    3. 将幼鼠在麻醉盒中麻醉20–40秒，并用镊子夹捏足部确认麻醉效果。暴露心脏22 使用10 mL注射器以DPBS灌注幼崽。
      注意：灌注用于在小胶质细胞铺板步骤中避免血细胞污染。
    4. 用手术剪刀剪断幼鼠颈部上颈椎处的横切线，并沿中线切开头部皮肤。沿中线在颅骨上做切口，用弯头镊子打开颅骨。
    5. 用Castroviejo弹簧剪切除小脑。取出剩余脑组织，置于盛有DPBS的100 mm培养皿中。
    6. 在显微镜下使用Castroviejo弹簧剪从大脑皮层中去除中脑和海马等其他区域。用精细镊子去除脑膜。
    7. 将皮层转移至新的60 mm培养皿中，并移除皿中残留的DPBS。使用10号刀片切碎组织。
  4. 将皮层解离为单细胞悬液
    1. 将过滤后的1号管溶液倒入60 mm培养皿中，加入50 µL DNase1，轻轻摇动培养皿使溶液混匀。
      注意：DNase 用于抑制破裂细胞释放的 DNA 发生聚集。
    2. 将培养皿放入34 °C的加热块中，并用中间带孔的盖子盖住。使用电烙铁在60-mm培养皿的盖子上打孔。
    3. 连接22-µm注射器滤器至CO2 将滤芯尖端插入罐体管的孔中。
    4. 在34 °C下孵育培养皿45分钟，每隔10至15分钟轻轻摇动培养皿中的溶液。
  5. 完成包被平板的制备。
    1. 提前一天将已包被二抗的平皿从冷冻箱中取出。将仅含BSL-1的平皿和仅含二抗的平皿置于室温。
    2. 用 20 mL DPBS 将其他器皿清洗三次。
    3. 加入适量的 0.02% BSA 溶液至培养皿中。将特异性一抗分别加入对应的培养皿中：
      CD45 培养皿：12 mL 0.02% BSA + 20 µL 0.5 mg/mL 大鼠抗小鼠 CD45
      Itgb5 培养皿：12 mL 0.02% BSA + 20 µL 0.5 mg/mL Itgb5
      O4 培养皿：8 mL 0.02% BSA 和 4 mL O4 抗体
      注意：小鼠免疫筛选时，使用小鼠抗大鼠 CD45 抗体（0.5 mg/mL）用于小胶质细胞，HepaCAM 抗体（0.5 mg/mL）用于星形胶质细胞。
    4. 配制30 mL含30% FBS的Neurobasal培养基和10 mL 1× EBSS。将两种溶液在34 °C水浴中预热。
  6. 抑制木瓜蛋白酶反应。
    1. 将经木瓜蛋白酶处理的组织转移至新的50 mL离心管中。静置使组织沉淀。用抽吸法吸除上清液。
    2. 向离心管中加入4 mL低卵溶液，轻轻涡旋溶液以洗涤细胞。
    3. 重复步骤 3.6.1–3.6.2 三次，以终止酶反应。
  7. 吹打皮层组织。
    1. 向管中加入6 mL低卵（Low Ovo）。用5 mL移液器快速吹吸组织。
      注意：避免引入气泡。
    2. 准备一个新的50 mL离心管，加入5 mL Low Ovo培养基。将单细胞收集至新管中。
    3. 重复步骤 3.6.1–3.6.2 两次，并将 5-mL 移液管更换为 1-mL 移液管。
    4. 反复吹打重悬，直至超过95%的组织不可见。
    5. 用10 mL移液管将3号管中的高浓度Ovo溶液在含低浓度Ovo的离解细胞下方铺一层。
    6. 以190 × g离心6分钟，刹车要轻。
      注意：当最大减速速率为9时，将减速率设置为1或2。
  8. 过滤单细胞。
    1. 小心吸去上清液，然后用1 mL移液器加入3 mL 0.02% BSA溶液重悬沉淀。
    2. 加入0.02% BSA溶液至9 mL。
    3. 准备一个新的50 mL离心管，并将20 µm细胞筛置于管口上方。用1 mL 0.02% BSA溶液润湿细胞筛。
    4. 将单细胞悬液转移至细胞筛中，每次过滤1 mL。
    5. 用3 mL 0.02% BSA溶液冲洗细胞滤筛。过滤后的单细胞悬液总量不得超过15 mL。
    6. 将试管置于34 °C水浴中孵育45–60分钟，以进行细胞恢复。细胞恢复步骤有助于细胞表面蛋白重新定位至细胞膜。
  9. 进行细胞淘选。
    1. 用 20 mL DPBS 清洗 CD45 潘氏培养皿三次。每次使用前立即用 20 mL DPBS 对每块培养皿清洗三次。
    2. 将单细胞悬液倒入CD45铺板培养皿中。静置28分钟，随后轻轻摇晃培养皿14分钟。为去除未结合的细胞，小心振荡培养皿底部。
    3. 将细胞悬液转移至仅含继代培养皿中。静置20分钟，然后轻轻振荡培养皿10分钟。如需从CD45培养皿中获取小胶质细胞，请进入步骤3.9.2。
    4. 将细胞悬液转移至BSL-1培养皿中，静置10至12分钟。
    5. 转移至O4培养皿中，静置20分钟，随后振荡10分钟。
    6. 转移到Itgb5培养皿中。静置40分钟，每隔10分钟轻轻摇动一次。
      注意：进行小鼠细胞传代时，将细胞悬液转移至HepaCAM培养皿中。
  10. 从培养皿中分离细胞。
    1. 将400 µL胰蛋白酶（30,000 U/mL，溶于EBSS）与预先孵育的8 mL 1× EBSS混合。
    2. 将培养皿中已脱落的细胞悬液倒入废液桶中。
    3. 用DPBS洗涤培养皿八次。
    4. 将8 mL含胰蛋白酶的EBSS加入培养皿中。
    5. 将培养皿置于37 °C培养箱中孵育5至10分钟。CD45培养皿孵育10分钟，Itgb5和HepaCAM培养皿孵育5分钟。
    6. 轻敲培养皿，然后在显微镜下观察。
      注意：如果大多数星形胶质细胞尚未脱落，请将培养皿放回培养箱中继续孵育5分钟。
    7. 加入10 mL 30% FBS至培养皿中以中和胰蛋白酶。
    8. 用移液器在整个培养皿中上下吹打，以解离星形胶质细胞或小胶质细胞。
    9. 将溶液转移至50 mL离心管中。
    10. 加入10 mL 30% FBS和200 µL DNase至培养皿中。再次解离细胞。DNase用于抑制破裂细胞释放的DNA发生聚集。
    11. 将溶液转移至离心管中。若培养皿中仍有细胞残留，加入另外10 mL含30% FBS的培养基，再次消化细胞。
  11. 接种细胞。
    1. 以 213 × g 离心 10 分钟。
    2. 吸除上清液，并用培养基重新悬浮细胞沉淀。
      注意：星形胶质细胞使用免疫筛选星形胶质细胞基础培养基（IP-ABM），小胶质细胞使用视网膜小胶质细胞基础培养基（MBM）并添加免疫筛选星形胶质细胞条件培养基（IP-ACM）。IP-ABM 和 MBM 的成分如下所示 材料表.
    3. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
    4. 将星形胶质细胞和小胶质细胞分别接种于PDL包被的培养板中。
      注意：使用前需预先制备多聚-D-赖氨酸（PDL）包被的培养板。制备PDL包被板时，将50 µL浓度为1 mg/mL的多聚-D-赖氨酸加入5 mL蒸馏水中，混匀后取适量溶液加入培养板/培养皿中，室温孵育30分钟。随后用蒸馏水洗涤培养板/培养皿三次。
    5. 孵育培养板。星形胶质细胞每7天更换一半培养基，小胶质细胞每3天更换一半培养基。

4. 收集免疫沉淀-ACM

  1. 当星形胶质细胞过度汇合时，准备一个100毫米培养皿。
  2. 弃去培养基，用 10 mL DPBS 洗涤培养皿三次。
  3. 将15 mL低蛋白培养基倒入培养皿中。
    注意：低蛋白培养基的成分如下所示 材料表.
  4. 在37 °C培养箱中将培养皿孵育7至10天。
  5. 使用10k（或30k）离心滤管收集并浓缩培养上清。
  6. 在 4 °C 条件下以 851 x g 离心试管。
    注意：离心试管，直至残留的培养基少于 1 mL。
  7. 将浓缩的培养基（IP-ACM）收集至新的1.5 mL离心管中。
  8. 使用定量分析法测定IP-ACM的浓度

5. 吞噬作用活体成像实验（图2）

  1. 准备一个24孔板（或任何适用于活细胞成像的孔板/培养皿），其中星形胶质细胞已达到汇合状态（通常在纯化后培养7至10天为最佳，有利于细胞状态稳定）。
  2. 吸除每孔中的培养基，并用1 mL DPBS洗涤每孔三次。为尽量减少空气暴露，应快速完成洗涤操作。
  3. 向每孔中加入300 µL IP-ABM，其中包含5 µL pH指示剂标记的突触体，以及如IP-ACM等可调节胶质细胞吞噬作用的其他因子。
  4. 将孔板置于CO2培养箱中孵育40分钟。此步骤使pH指示剂标记的突触体沉降至孔板底部。
  5. 移除含有未结合pH指示剂标记突触体的培养基，并用1 mL DPBS每孔洗涤三次。
    注意：避免剧烈洗涤。为尽量减少空气暴露，应快速完成洗涤操作。
  6. 向每孔中加入500 µL IP-ABM，并加入待检测的其他因子。
  7. 将孔板转移至活细胞成像仪器，选择成像位置，并调节焦距、曝光时间、亮度和LED功率。
    注：曝光时间、亮度和LED功率的设置根据荧光强度和实验目的而有所不同。在使用pH指示剂标记突触体的活细胞成像实验中，通常将这些参数设置如下：曝光时间：约150–200 ms，亮度：15，LED功率：4–6。
  8. 设置活细胞成像的图像格式、时间间隔和总循环次数。根据所选位置的数量，将时间间隔设为1或2小时；当选择超过150个成像位置时，建议采用2小时的时间间隔。
  9. 开始活细胞成像实验。
  10. 分析数据。
    1. 打开Fiji程序。
    2. 导入图像序列，将图像转换为8位灰度图像。
    3. 使用50像素滚动条半径进行背景扣除。
    4. 启动时间序列分析插件V3。
      注：时间序列分析插件V3的地址见材料表。
    5. 在图像中划定感兴趣区域（ROI），并在ROI管理器中点击“添加”。
    6. 在Time series V3_0中点击 "Get total intensity"。
    7. 保存结果并整合数据。

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结果

在此 体外 长期活体成像吞噬作用检测实验中，我们采用了成年小鼠脑组织匀浆中的突触体，通过超速离心在23%梯度溶液与10%梯度溶液之间的界面分离获得图3）。制备完成后，突触体在其外膜暴露磷脂酰丝氨酸（PS）图 4），表明它们已失去功能，并可被星形胶质细胞和小胶质细胞中的PS受体识别。如图所示 图5，与pH指示剂偶联的突触体被星形胶质细胞吞噬后会发出明亮的红色荧光。通过每1至2小时对选定区域（ROI）进行多次成像，可实时比较胶质细胞的吞噬与降解能力（补充影片 1, 补充视频 2）。通过该方法，我们证实了星形胶质细胞和小胶质细胞介导的吞噬作用具有不同的动力学特征（图6). 为定量分析胶质细胞的吞噬作用，测量面积（µm2) 的红色荧光信号...

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讨论

本文介绍了一种长期活体成像的方法 体外 使用纯化的胶质细胞和pH指示剂偶联的突触体进行吞噬作用检测。我们发现，与小胶质细胞相比，星形胶质细胞在突触体吞噬过程中表现出不同的内吞和降解能力。此外，我们的数据表明，星形胶质细胞分泌的因子中含有GAS6、Protein S和MEGF8等桥接分子，这些因子对于脑内胶质细胞高效地依赖磷脂酰丝氨酸（PS）的吞噬作用至关重要。此外， Megf10 敲除星形胶质细胞表现出对突触体吞噬功能缺陷。

为成功完成本实验，在洗涤步骤（第5节）中需仔细更换培养基和DPBS。原代培养的星形胶质细胞和小胶质细胞，尤其是小胶质细胞，对空气暴露非常敏感。因此，缩短各洗涤步骤之间的时间间隔对于维持细胞存活至关重要。在使用活细胞成像仪器进行长期活细胞成像时，建议采用手动对焦，因为自动对焦可能会增加激光/LED的照射时间，从而对细胞造成损伤。

本方法对突触体纯化方案19进行了轻微修改。原始文献中将梯度溶液分为3%、10%、15%和23%。...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢郑延柱（Yeon-Joo Jung）在突触体纯化过程中提供的实验支持，以及朴贞柱（Jungjoo Park）提供的暴露磷脂酰丝氨酸（PS）的突触体图像。此外，我们感谢郑实验室（Chung's laboratory）所有成员给予的有益讨论。本研究由韩国国家研究基金会（NRF）资助，资金来源于韩国政府（MSIP）（NRF-2016M3C7A1905391 和 NRF-2016R1C1B3006969）（W.-S. C）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>突触体纯化
PercollGE医疗生命科学17-0891-01
快速启动 Bradford 蛋白质测定试剂盒 2BIO-RAD5000202
<强>pH 指示剂偶联
二甲基亚砜（DMSO）LPS 溶液DMSO100
pHrodo 红色，琥珀酰亚胺酯分子探针P36600
<强>免疫筛选
10X Earle’Earle's 平衡盐溶液（EBSS）SigmaE7510
牛血清白蛋白BovogenBSA025
脱氧核糖核酸酶1（DNase）沃辛顿Is002007
(DMEM)Gibco11960-044
(dPBS)WelgeneLB001-02
胎牛血清（FBS）Gibco16000-044
小扁豆凝集素（Griffonia Simplicifolia Lectin，BSL-1）Vector LabsL-1100
山羊抗小鼠 IgG+IgM（H+L）杰克逊免疫研究实验室115-005-044
山羊抗小鼠 IgM（μ-链)杰克逊免疫研究实验室115-005-020
肝素结合性表皮生长因子SigmaE4643
人 HepaCAM 抗体R&D系统MAB4108
整合素β5单克隆抗体（KN52）eBioscience14-0497-82
L-半胱氨酸SigmaC7880
L-谷氨酸Gibco25030-081
N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）SigmaA8199
Neurobasal 培养基Gibco21103-049
O4 杂交瘤上清液（小鼠 IgM）Bansal 等人<上标 class="xref">23
木瓜蛋白酶沃辛顿Is003126
青霉素/链霉素Gibco15140-122
Pluristrainer 20 μmPluriSelect43-50020-03
聚-D-赖氨酸SigmaP6407
孕酮SigmaP8783
腐胺二盐酸盐SigmaP5780
纯化的抗小鼠 CD45 大鼠抗体BD Pharmingen550539
纯化小鼠抗大鼠CD45BD Pharmingen554875
丙酮酸钠Gibco11360-070
亚硒酸钠SigmaS5261
转铁蛋白SigmaT1147
胰蛋白酶SigmaT9935
胰蛋白酶抑制剂沃辛顿LS003086
超透明管（Tube, Thinwall, Ultra-Clear）贝克曼库尔特344059
<强>收集 IP-ACM
Macrosep Advance 离心装置（Omega 膜，10k）PALLMAP010C37
Macrosep Advance 离心装置（Omega 膜，30k）PALLMAP030C37
<强>吞噬作用活体成像检测
朱莉阶段NanoEntek
时间序列分析器 V3 插件https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html

参考文献

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