本研究中，我们描述了通过后半规管途径作为向新生小鼠内耳递送基因的可靠方法。我们证明，通过后半规管进行基因递送能够灌注整个内耳。
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本文内容
摘要
摘要
内耳基因治疗作为治疗听力损失和眩晕的潜在方法，具有广阔的应用前景。内耳基因治疗成功的关键因素之一是找到一种递送方法，能够在最大限度减少听力损失的同时，实现对靶向细胞类型的稳定转导效率。在本研究中，我们描述了经后半规管途径作为新生小鼠内耳基因递送的一种可行方法。我们证明，通过后半规管进行基因递送能够灌注整个内耳。由于后半规管解剖位置易于识别，且所需对颞骨的操作极少，因此该手术途径成为内耳基因递送的一种理想选择。
引言
内耳基因治疗是一个快速发展的研究领域。该技术已在多种动物模型中用于对抗耳毒性、噪声性损伤以及遗传性听力损失1。最近多项研究表明，在通过内耳基因治疗递送治疗基因后，突变小鼠的听力和平衡功能实现了功能性恢复2,3,4,5,6,7。决定内耳基因治疗成功与否的关键因素之一是用于进入内耳的手术入路。理想的手术入路应易于操作，解剖标志应清晰且易于识别，并能实现对靶向细胞类型的高效转导。
在最近的一项研究中，我们发现，当通过whirler突变小鼠（一种听力损失和前庭功能障碍的模型）的后半规管注射病毒基因治疗剂时，前庭器官以及耳蜗中的感觉毛细胞均实现了高效的转导5。感觉毛细胞高效转导的结果是，这些突变小鼠的听觉和前庭功能得到了改善。
本文详细描述了通过后半规管入路进入新生小鼠内耳的方法。
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方案
所有动物实验程序均经国家耳聋与其他沟通障碍研究所（NIDCD ASP1378-15）动物护理与使用委员会批准。
1. 实验步骤的设置与准备
- 实验开始时，使用环氧乙烷对所有器械进行灭菌。在不同动物之间，采用玻璃珠灭菌器清洁器械。
- 将含有病毒基因治疗药物的溶液装入显微注射仪上的微量移液器中。本研究使用的病毒载体为 AAV2/8-whirlin（每毫升含 1 × 1013 个基因组拷贝，参见材料表）。
注意：通常将总量为 1.1 µL 的溶液装入微量移液器中。
2. 麻醉
注意：本研究使用的小鼠品系为whirler小鼠。实验中同时使用了纯合突变体（Whrnwi/wi）和杂合子同窝小鼠（Whrn+/wi）。
- 将母鼠放入单独的笼子中（与幼崽分开）。
- 将装有幼崽（P0–P5仔鼠）的原笼置于循环加热垫上（设定为37.5 °C），以保持小鼠体温。
- 剪下乳胶手套的拇指部分，并将一只仔鼠放入其中。
- 将装有仔鼠的乳胶手套拇指部分放入盛有冰块的桶中，持续约2分钟。
- 将麻醉后的仔鼠置于一个大型方形商用塑料冰袋上，仔鼠与冰袋表面之间垫有一块4" x 4"的纱布。
- 用碎冰填满一只耐用型乳胶手套，然后将该冰手套环绕放置在仔鼠周围。
- 通过观察仔鼠对各种刺激（包括用力捏脚趾）是否完全无反应，来判断其麻醉是否充分。在手术期间（约5–10分钟）保持仔鼠处于冰袋上。
注意：我们建议在手术过程中让仔鼠停留在冰袋上的时间不超过15分钟。
3. 手术入路（图1）
- 动物麻醉后，用碘伏擦拭液和酒精擦拭液清洁耳后皮肤。
- 使用显微剪刀在耳后约 2 mm 处做耳后切口，并用显微剪刀分离胸锁乳突肌。
- 辨认面神经和鼓泡。此年龄段的鼓泡为软骨性且半透明，位于面神经内侧。此时可通过鼓泡观察到镫骨动脉，可作为有用的解剖标志。
- 沿面神经向头侧和尾侧追踪，以定位后半规管（PSCC）。使用显微剪刀去除覆盖在后半规管表面的肌纤维和软组织。
注意：此年龄段的后半规管为软骨性结构。 - 使用连接在显微注射仪上的玻璃微移液管（直径约 10 μm）穿通后半规管。
- 将病毒基因治疗药物注射至内耳。
注意：通常在约 40 秒内向后半规管注射 20 次，每次 49 nL，总注射量约为 1 µL。所用病毒滴度为 1 × 1013 基因组拷贝/mL。 - 使用 5-0 聚乳酸羟乙酸缝线缝合皮肤切口。
4. 术后护理
- 将幼鼠置于加热垫上，并在麻醉恢复期间通过戴手套的手指持续进行手动刺激或滚动，以恢复其正常体温。
- 待幼鼠苏醒后，将其放回原居住的笼具中。
- 用接触过原笼具垫料的棉签轻轻擦拭每只幼鼠。
注意：此步骤的目的是使幼鼠的气味与手术前一致，从而提高母鼠在术后重新接受幼鼠的可能性。如条件允许，可收集母鼠尿液，并用棉签将其涂抹于幼鼠身上，以进一步降低被遗弃的风险。 - 在母鼠鼻部涂抹矿物油以降低其嗅觉敏感性8，然后将母鼠重新放回原笼具中。
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结果
通过后半规管将AAV8-whirlin基因治疗药物注射到新生whirler小鼠体内，导致椭圆囊毛细胞中表达whirlin蛋白（绿色）（图2），总体感染效率为53.1%（标准差38.1，n = 28）5。与对侧未注射耳的毛细胞相比，转导后的毛细胞具有更长的静纤毛（红色）（分别为5.35 ± 2.11 µm vs. 3.20 ± 0.34 µm）5。
在whirler小鼠中，向后半规管注射AAV8-whirlin也导致耳蜗毛细胞的转导（图3）。内毛细胞的平均感染效率为77.1%（标准差12.7，n = 8）5。与对侧未注射耳的毛细胞相比，转导的毛细胞在静纤毛尖端表达whirlin（绿色），且静纤毛...
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讨论
已有多种手术方法被用于进入啮齿类动物的内耳。耳蜗开窗术和圆窗途径是最常用于进入耳蜗的方法，而后半规管和内淋巴囊途径通常用于进入前庭器官1。在最近的一项研究中，我们发现通过后半规管注射病毒基因治疗剂，可在前庭器官和耳蜗中均实现高效的毛细胞转导5。事实上，在同一遗传性耳聋和前庭功能障碍小鼠模型中，与圆窗注射相比，后半规管注射所实现的耳蜗毛细胞转导效率更高5,9。鉴于圆窗与耳蜗在解剖结构上邻近，圆窗注射导致的耳蜗毛细胞转导效率反而低于后半规管注射，这一现象看似矛盾。这一发现可能的解释是，圆窗邻近耳蜗导水管；因此，当病毒基因治疗剂经圆窗注射时，其浓度可能因来自耳蜗导水管的脑脊液而被稀释10。
其他研究也报道了后半规管注射可导致耳蜗和前庭毛细胞转导的现象11,
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披露
作者没有相关披露事项。
致谢
本工作获得了美国国立耳聋与其他沟通障碍研究所（NIDCD）院内研究部/美国国立卫生研究院（NIH）基金的支持（项目编号 DC000082-02 赠予 W.W.C.，以及项目编号 DC000081 赠予先进成像核心实验室）。我们感谢 NIDCD 动物设施工作人员对我们实验动物的悉心照料。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 手术显微镜 | Zeiss | OPMI Pico ENT 显微镜。其他解剖显微镜也可使用。 | |
| 微型镊子 | Fine Science Tools | 11251-10, 11295-51 | #5 和 #55 Dumont 镊子 |
| 微型剪刀 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Nanoliter2000 微量注射仪 | World Precision Instruments | ||
| 加热垫 | Mastex | Model 500/600 | |
| 5-0 Vicryl 缝合线 | Ethicon | ||
| AAV8-whirlin | Vector Biolabs | ||
| 玻璃移液管 | Sutter Instruments | B100-75-10 | 硼硅酸盐玻璃 |
参考文献
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重印与许可
