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方法文章

用于实时无创小动物成像的手持式临床光声成像系统

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⸱

DOI：

10.3791/56649

⸱

2017年10月16日

 ,  , 
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

本文内容

摘要

将演示一种用于实时无创小动物成像的临床手持式光声成像系统。

摘要

将光声成像技术应用于临床是一项重大挑战。目前，可用于临床的便携式实时光声成像系统极为罕见。本文报道了一种结合光声成像与临床超声成像的系统，该系统通过将超声探头与光传输装置集成，适用于小动物成像。我们通过展示小动物前哨淋巴结成像以及微创实时穿刺针引导来验证该系统的有效性。利用可获取原始通道数据的临床超声平台，实现了光声成像的集成，从而构建出便携式实时临床光声成像系统。在675 nm波长下使用亚甲蓝进行前哨淋巴结成像。此外，利用该成像系统实现了超声与光声双模态引导下的穿刺针定位。在10 Hz激光重复频率下，以每秒5帧的光声成像帧率，实现了最大深度达1.5 cm的成像。

引言

用于癌症的检测与分期，可采用多种不同的成像技术。目前广泛使用的成像方式包括磁共振成像（MRI）、X射线计算机断层扫描（CT）、X射线、超声（US）、正电子发射断层扫描（PET）、荧光成像 等等。1,2,3,4但现有的某些成像技术存在侵入性、具有有害辐射，或速度慢、成本高、设备笨重，以及对患者不友好等问题。因此，持续需要开发新型的快速、经济高效的成像技术，用于疾病诊断与治疗。5.

光声成像（PAI）是一种新兴的成像技术，它在较深的成像深度下结合了丰富的光学对比度与高分辨率的超声成像5,6,7,8,9在光声成像（PAI）中，采用短脉冲激光照射组织。组织吸收光能后产生轻微的温度升高，进而因热弹性膨胀而在组织内部生成压力波（即声波）。这些产生的声波（亦称为光声（PA）波）由位于组织边界外的宽带超声换能器（UST）接收。所获取的光声信号可用于重建光声图像，从而揭示组织内部的结构与功能信息。光声成像具有广泛的应用，包括：血管成像、前哨淋巴结成像、脑血管成像、肿瘤成像、分子成像 等等。10,11,12,13,14,15 光声成像由于具有穿透深度大、空间分辨率高以及软组织对比度优异等优势，因而在多种应用中展现出巨大潜力。光声成像中的对比度可来源于内源性物质，如血液、黑色素， 等等当内源性对比度不足时，可使用外源性对比剂，如有机染料、纳米颗粒、量子点 等等。16,17,18,19,20,21 可用于提高对比度。

尽管光声成像（PAI）相较于其他成像技术具有诸多优势，但其临床转化仍面临巨大挑战。主要局限性在于所用激光器体积庞大，大多数用于数据采集的超声换能器（UST）与临床超声系统不兼容，以及市面上尚无能够提供原始通道数据的商用临床超声成像系统。直到最近，才出现了可获取原始数据的商用临床超声设备22。在本研究中，我们旨在展示基于临床超声平台的手持式光声成像系统的可行性。我们将通过在小型动物模型中实现对前哨淋巴结（SLNs）的无创成像来验证这一目标。

侵袭性乳腺肿瘤是导致女性癌症死亡的主要原因之一。早期诊断和分期对制定治疗策略至关重要，而治疗策略在患者的预后中起着关键作用。乳腺癌分期通常采用前哨淋巴结活检（SLNB）23,24前哨淋巴结（SLN）是转移后最有可能发现癌细胞的首要淋巴结。前哨淋巴结活检（SLNB）包括注射染料或放射性示踪剂，随后通过小切口切开局部组织，若使用染料则通过视觉定位前哨淋巴结，若使用放射性示踪剂则借助盖革计数器进行定位。确认后，切除少量前哨淋巴结用于组织病理学检查。24,25阳性前哨淋巴结活检表明肿瘤已转移至附近淋巴结，可能还转移至其他器官。阴性前哨淋巴结活检表明转移的可能性极低26. 前哨淋巴结活检存在多种相关并发症，例如手臂麻木、淋巴水肿， 等等。27 为了消除与前哨淋巴结活检相关的并发症，需要一种非侵入性影像学技术。

在小型动物和人类的前哨淋巴结（SLN）定位研究中，光声（PA）成像已借助多种对比剂被广泛探索15,28,29,30,31,32。然而，如前所述，目前使用的系统尚无法应用于临床场景。另一个需要解决的问题是前哨淋巴结活检（SLNB）所涉及的外科手术过程28。为了缩短患者恢复时间并减少副作用，有必要采用微创技术进行细针穿刺活检（FNAB）。在本研究中，采用了一套临床用超声（US）系统，用于实现超声与光声的联合成像。为便于在临床环境中使用，专门设计了一款手持式定制支架，用于集成光学纤维和超声探头（UST）。使用亚甲蓝（MB）进行前哨淋巴结的识别与定位。此外，为消除与SLNB手术相关的并发症，本研究还展示了非侵入性的实时穿刺针追踪技术。

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方案

所有动物实验均按照新加坡南洋理工大学机构动物护理与使用委员会批准的指南和规定进行（动物实验方案编号 ARF-SBS/NIE-A0263）。

1. 便携式实时临床光声与超声成像系统

  1. 手持式临床光声成像（PAI）系统的示意图33如图1a所示。该系统由一个由倍频纳秒脉冲Nd:YAG泵浦激光器泵浦的光学参量振荡器（OPO）激光器、一个分叉的光纤束（图1b）、一个定制的3D打印手持探头支架（图1c）33、临床双模超声（US）和光声（PA）系统，以及一个临床兼容的线性阵列超声换能器（UST）组成（见材料表）。
  2. 在临床超声系统中，通过点击桌面上的软件图标来运行制造商提供的软件。
  3. 在触摸屏上，选择“研究”按钮以研究模式运行超声系统。从脚本列表中选择联合超声和光声成像脚本，然后点击运行按钮以联合模式进行成像。
  4. 使用激光触发输出或光电二极管将临床超声系统与激光器同步。
    注：将激光器的固定同步输出连接至超声系统的同步输入。确保提供正向晶体管-晶体管逻辑（TTL）信号作为同步信号。也可使用光电二极管信号进行同步。超声系统的同步输入通过光电二极管偏置模块连接至光电二极管探测器。每当激光器开启时，光电二极管会发出信号，以触发并同步激光器和超声系统。每次操作均需执行此步骤。
  5. 开启激光器时，先接通交流电源，然后将激光控制器上的钥匙向左旋转。确保重复频率为10 Hz（显示屏上显示F10），且Q开关延迟尽可能低至170 µs，以保证激光能量较低，之后再启动激光器。设置延迟时，按选择键直至看到延迟值，并将其增加至170。
    注：激光器预热时间约为20分钟。
  6. 在计算机上打开软件界面，在“goto”菜单中输入波长为675 nm，然后点击“开始”按钮，将波长设定为675 nm。
    注：激光器可在670至2,500 nm范围内调谐，但在670 nm时不稳定。
  7. 按下快门按钮，并使用开关开启激光器，以将激光束对准光纤输入端。
  8. 使用一个直径为1英寸（2.5 cm）、焦距为15 mm的平凸透镜，将激光束聚焦至光纤束，使所有光线均落在光纤输入端面上。
    注：该光纤束由1,600根细小光纤捆扎而成，中间分叉，具有两个矩形输出端，每个输出端包含800根光纤。800根光纤被压缩在0.1 × 4 cm的区域内，以匹配UST的尺寸。每根光纤的纤芯直径为185 µm，数值孔径为0.22。
  9. 对准完成后关闭激光器。
  10. 从四个具有不同照明角度（0°、5°、10°和15°）的探头支架中，根据应用需求（成像深度、物体尺寸、形状及位置）选择合适的探头支架。
    注：探头支架由实验室设计并3D打印而成，具有三个槽位，两个用于分叉光纤，中间一个用于UST。探头支架的尺寸基于光纤和UST的尺寸确定。通过蒙特卡罗模拟研究了深层成像所需光照条件。在15°照明下，浅层成像的信噪比（SNR）更高33。
  11. 将分叉光纤以15˚的光照角度安装到3D打印的探头支架中。
  12. 将UST插入支架的中央槽位。
    注：图1d展示了装有光纤和UST的探头支架照片。该线性阵列UST包含128个阵元，中心频率为8.5 MHz，分数带宽为95%。UST长度为3.85 cm。然而，系统仅有64个并行数据采集硬件通道，需两次激光脉冲才能采集全部128个阵元的数据。因此，系统的有效帧率为激光脉冲重复频率的一半，即每秒5帧34。
  13. 通过松开侧面螺丝，调节UST与光纤端面之间的距离至1 cm，调整到位后拧紧螺丝。
    注：该参数通过模拟和仿体实验优化，适用于前哨淋巴结（SLN）成像33。UST可通过探头支架上的两个螺丝固定，从而灵活调节光纤与UST之间的距离。
  14. 开启激光器，并确保在UST前方形成矩形的激光光斑。
  15. 关闭激光器。通过增加延迟来将激光能量调至成像所需的设定值。
    注：请参考Nd:YAG激光器手册中允许设置的最大延迟值。本系统在SLN成像中的设定延迟值为210。

2. 分辨率表征

  1. 取市售的鸡组织块，将其切成 6 × 6 cm2 的组织片，再用刀将其切成厚度为 0.5 cm 的薄片。
  2. 将一个点状物体（如直径为 0.6 mm 的 23 G 针头）放置在鸡胸组织表面。
  3. 打开激光器。
    注意：在本实验方案的后续操作中，使用激光器时应佩戴安全护目镜。仅在对准过程中可例外，因为此时激光能量较弱。
  4. 通过逐层叠加厚度为 0.5 cm 的鸡胸组织片（最多叠加至 3 cm），在不同深度下采集针头的光声图像。在各鸡胸组织层之间涂抹超声耦合凝胶，以改善超声波耦合效果。
  5. 将波束成形后的图像保存并存储为 .mat 文件。
  6. 关闭激光器。
  7. 使用实验室自编代码及图像处理软件17处理数据。
    注：为确定轴向和横向分辨率，需从归一化的光声信号中提取相应方向上的点扩散函数，并将其拟合至高斯分布函数17，进而获得半高全宽。获取点扩散函数通常需要对一个点状目标成像。然而，当点状目标成像困难时（例如在本实验中，过小的点目标产生的信号非常微弱，因此我们使用了稍大的目标），存在另一种获取点扩散函数的方法。若目标尺寸较大，则可先获得边缘扩散函数，再通过对边缘扩散函数求一阶导数，即可得到点扩散函数。因此，计算分辨率时并不绝对需要使用点状目标22。

3. 淋巴结成像的动物准备

注意：上述手持式临床成像系统已用于小动物前哨淋巴结（SLN）的成像。实验中选用6至8周龄健康雌性大鼠（NTac:Sprague Dawley，220 ± 30 g）。之所以使用雌性大鼠，是因为雄性大鼠发生乳腺癌的频率较低。然而，雄性大鼠也可用于此类研究。此外，文献中更广泛使用雌性大鼠进行SLN成像。

  1. 大鼠麻醉
    1. 成像前，使用麻醉液对大鼠进行麻醉，麻醉液包含氯胺酮（100 mg/mL）、赛拉嗪（20 mg/mL）和可注射生理盐水，按2:1:1的比例混合。每100 g动物体重加入0.2 mL该混合液，用带针头（27G，½英寸）的无菌外科1 mL注射器抽取备用。
    2. 用手固定大鼠颈部皮肤，并用酒精棉片消毒其右下腹区域。将麻醉液注射入动物体内。
    3. 通过夹捏脚趾检查反射，确认动物已完全麻醉。
  2. 进行SLN成像时，使用市售脱毛膏轻柔去除目标区域的毛发。用量以完全覆盖该区域为宜。涂抹后3–5分钟，用湿棉签擦除脱毛膏。为防止眼睛干燥及意外激光损伤，涂抹人工泪液软膏。
  3. 在实验台上铺蓝色垫巾，将动物侧卧放置其上。通过鼻罩给予吸入麻醉（0.75%异氟烷与氧气（1.2 L/min）混合），以在整个实验过程中维持麻醉状态。将脉搏血氧仪夹在大鼠后肢足掌上，以持续监测心率和外周血氧饱和度。
     注意：使用经批准用于动物的加热垫，确保动物体温维持正常。

4. 体内 大鼠SLN成像

  1. 成像前，使用注射器将0.5至1 mL超声耦合剂涂于皮肤表面，并用涂抹器均匀涂抹。在成像区域放置一块尺寸为6 cm × 6 cm、厚度为0.5 cm的鸡胸肉组织切片，并在鸡组织表面再涂抹适量超声耦合剂以改善耦合效果。
    注意： 淋巴结位于大鼠皮下（2-3 mm内）。在人体中，淋巴结的深度约为1 cm。因此，将鸡组织置于大鼠的成像区域，以模拟人体成像场景。 Alternatively，可使用模拟组织的仿体替代鸡组织。
  2. 打开激光器。将手持探头支架置于鸡组织上方，以超声和光声联合模式进行扫描（从右向左移动支架）。
    注意：激光束的面积约为 3 cm2 且能量密度计算约为 8 mJ/cm2，低于美国国家标准协会（ANSI）的安全限值（20 mJ/cm²）2)35成像深度在临床超声系统中设置为2 cm。激光开启时，必须始终佩戴护目镜。
  3. 将光声成像的成像深度设置为 2 cm。
  4. 在注射对比剂之前，通过左右移动手持探头，获取胸部前肢上方感兴趣区域的对照图像。
    注意：所有数据均以波束成形数据类型保存，以供进一步处理。
  5. 注射0.2 mL造影剂，(即，MB（10 mg/mL）注射至动物前肢足垫，并充分按摩2分钟，以促进造影剂通过淋巴管流向淋巴结。
  6. 5分钟后，使用手持探头沿鸡组织进行扫描，借助光声信号定位前哨淋巴结。
    注意：所有帧均以波束成形后的数据类型保存。
  7. 点击超声系统控制面板上的“冻结”按钮，然后点击触摸屏显示器上的“导出选定帧”按钮，以导出已记录的数据。
    注意：数据可以以不同格式存储，即波束成形、扫描转换、通道和 I.Q. 格式。
  8. 在动物样本上方逐层添加两层厚度为0.5 cm的鸡组织切片，定位浅表淋巴结（SLN），以验证成像深度达1.5 cm的可行性。
  9. 成像后，移除所有鸡组织切片
  10. 关闭激光器。

5. SLN的光声光谱分析

  1. 将一片厚度为 0.5 cm 的鸡胸组织放置在大鼠上。
  2. 使用软件将激光波长设置为 670 nm。
  3. 打开激光器，沿鸡胸组织区域移动探头进行扫描，并借助光声信号定位前哨淋巴结（SLN）。
  4. 确定前哨淋巴结位置后，保持探头稳定。
  5. 在提供的激光调谐软件中，将波长设为 800 nm，扫描速度设为 10 nm/s，然后点击“开始”按钮。
    注意：此操作将以 10 nm/s 的速度使波长从 670 nm 连续变化至 800 nm。波长扫描范围应根据所用对比剂的吸收光谱进行调整。亚甲蓝（MB）在 670 nm 附近有明显的吸收峰。
  6. 观察光声信号随波长变化的情况。
  7. 关闭激光器。
  8. 移除鸡胸组织切片。

6. 使用光声成像进行实时针头追踪

  1. 将一块厚度为 0.5 cm 的鸡胸组织切片放置在动物体上。将波长设置为 675 nm。
  2. 打开激光器。移动探头，在光声信号的辅助下，通过屏幕定位并识别前哨淋巴结（SLN）。
  3. 实时针头追踪
    1. 将一支规格为 0.6 × 32 mm2 的 23 G 针头，平行于超声探头（UST），穿过鸡组织插入动物体内，以到达前哨淋巴结（SLN），同时在临床超声系统显示器上进行实时引导。
  4. 实验结束后，关闭激光器。从动物体上移除鸡组织和脉搏血氧仪，并将动物移至工作台。用棉片擦去大鼠体表的超声耦合剂。
  5. 将动物放回垫料中，并持续监测直至其恢复意识。
  6. 待动物行为恢复正常后，将其放回笼中。

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结果

使用Nd:YAG激光器、OPO和归一化光声信号幅度图的光声测量装置示意图
图1：系统描述。(a) 集成双模态临床超声系统的光声成像（PAI）系统示意图。OPO——光学参量振荡器，OF——光纤束，FH——光纤夹持器，USM——临床超声设备。光纤夹持器集成了超声换能器（UST）和两路输出的光纤束。麻醉机提供异氟烷和氧气，用于在实验期间维持动物的麻醉状态。(b) 分叉光纤的照片。I/P表示光纤的输入端，O/P表示光纤的两个输出端。(c) 光纤夹持器的照片，包含三个插槽，其中两个用于放置光纤，一个用于放置UST。(d) 超声换能器（UST）和光纤束（OF）末端固定在光纤...

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讨论

目前，癌症筛查、诊断和治疗的成本非常高。现有的多种成像方式被用于癌症的筛查和诊断。然而，这些成像技术中的许多都存在局限性，包括设备体积庞大、诊断具有侵入性、对患者不友好、成本过高、需要电离辐射，或使用放射性对比剂。因此，迫切需要一种高效、经济、可实时成像并提供引导的系统。结合超声（US）和光声（PA）成像的技术可用于实现有效的、非侵入性癌症筛查、诊断和分期。使用经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的对比剂（如亚甲蓝，MB），可使临床光声成像更具可行性。由于光声成像是一种非侵入性操作，因此可避免前哨淋巴结活检（SLNB）手术相关的并发症。

在临床光声成像（PAI）取得成功之前，仍有一些挑战需要关注。首先，用于PAI的激光器体积需要进一步缩小。目前的激光器体积庞大、重量较重，通常需要光学平台来安置。它们对微小的光路对准变化非常敏感，因此不适合临床便携使用。小型二极管激光器与笨重的OPO激光器相比输出功率很低，且通常不可调谐。最近，便携式OPO激光器已开始上市，这有望显著解决设备便携性问题。其次，如何将光传输系统与超声探头高效耦合，是一项具有挑战性的任务。虽然已有将小型二极管激光器直接...

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披露

作者在该手稿中无相关经济利益，亦无其他潜在利益冲突需披露。

致谢

作者感谢新加坡教育部资助的第1级研究基金（RG48/16：M4011617）和第2级研究基金（ARC2/15：M4020238）提供的经费支持。作者感谢Dr. Rhonnie Austria Dienzo在动物操作方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Q 开关 Nd:YAG 激光器ContinuumSurelite泵浦激光器
光学参量振荡器ContinuumOPO 激光器
临床超声成像系统AlpinionE-CUBE 12R双模态超声与光声成像系统
线阵超声换能器AlpinionL3-12具有 8.5 MHz 中心频率、95% 分数带宽的 128 元素线阵换能器
分叉光纤CeramOptec定制用于将激光光源耦合至手持式光纤支架
透镜ThorlabsLB1869将激光聚焦至光纤输入端
超声耦合凝胶Progress/parker acquasonic gelPA-GEL-CLEA-5000声学耦合
图像处理软件MathworksMatlab基于 Matlab 开发的自编程序
麻醉机medical plus pte ltd带氧气浓缩器的非重复呼吸麻醉机为动物提供氧气和异氟烷
便携式脉搏血氧仪MedtronicPM10N 配兽用传感器监测动物的脉搏血氧饱和度
实验动物供应商In Vivos Pte Ltd, Singapore为科研用途提供小型实验动物的供应商
呼吸面罩定制与动物固定装置配合使用，向动物输送麻醉混合气体
鸡胸肉组织Pasar用于增加成像深度，模拟人类成像场景
23G 针头BD Precisionglide23G，1.5 英寸用于实时针头引导
光纤电缆支架定制用于固定分叉光纤电缆的输入端
手持探头定制 3D 打印设有两个槽位用于固定光纤的两个输出端，一个槽位用于安装超声换能器
亚甲蓝（10 mg/mL）Sterop光声成像对比剂
激光波长调谐软件Surelite OPO PLUSSLOPO用于调节 OPO 激光器波长的软件
光电二极管ThorlabsSP05/M用于检测激光脉冲以触发超声系统
光电二极管偏置模块ThorlabsPBM42用于放大光电二极管信号以触发超声信号
脱毛膏Reckitt BenckiserVeet用于去除成像区域的毛发
激光功率计OphirStarlite, p/n: 7Z01565用于测量激光功率

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