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方法文章

寡聚肽模拟物的合成与质谱分析

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DOI：

10.3791/56652

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2018年2月21日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of the Pacific

本文内容

摘要

本文描述了一种通过质谱分析进行序列鉴定的寡聚肽拟物的手动合成方案。

摘要

肽模拟物（peptoids）是一类序列可控的肽类似寡聚物，由N-烷基化甘氨酸单元组成。在众多潜在应用中，肽模拟物被认为可作为一种分子信息存储介质。质谱分析被认为是测定肽模拟物序列的首选方法。肽模拟物可通过固相化学合成法，利用重复的两步反应循环进行合成。本文介绍了一种手动合成寡聚肽模拟物的方法，并利用串联质谱（MS/MS）技术对肽模拟物的序列进行分析。样品肽模拟物为一个九聚体，其序列交替含有N-(2-甲氧乙基)甘氨酸（Nme）和N-(2-苯乙基)甘氨酸（Npe），并在N端含有一个N-(2-氨基乙基)甘氨酸（Nae）。该肽模拟物的序列结构式为Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2，其中Ac代表乙酰基。合成反应在市售的固相反应容器中进行。以Rink酰胺树脂作为固相载体，使最终获得的肽模拟物在C端带有酰胺基团。所得肽模拟物产物通过配备电喷雾电离源的三重四极杆质谱仪进行序列分析。MS/MS检测产生一系列由带电肽模拟物解离形成的碎片离子谱图。这些碎片离子根据其质荷比（m/z）值被分离检测。将测得的碎片离子m/z值与理论预测的碎片离子名义质量进行比对，依据肽模拟物的裂解规律进行分析。由此得到带电肽模拟物的裂解图谱，该图谱与中性肽模拟物的单体序列相对应。因此，质谱分析可读取肽模拟物的序列信息。

引言

肽模拟物是一类序列可控的聚合物，其骨架结构模拟了肽的结构。肽模拟物可由多种不同的胺合成，从而使肽模拟物表现出高度可调的性质1,2。肽模拟物已被用作生物物理研究的分子模型，被视为潜在的治疗剂，并被设计为蛋白质的配体3,4,5,6。肽模拟物已开发为多种生物活性化合物，例如抗污损材料和抗体模拟材料、抗菌剂以及酶抑制剂7,8,9。由于具有高度有序且可调控的特性，肽模拟物也被认为是一种分子信息存储材料10。这些多样化应用的发现，促使人们需要发展高效的分析方法，以表征肽模拟物的序列和结构。基于串联质谱的技术已显示出作为分析序列可控聚合物（包括肽模拟物）序列特性的首选方法的潜力11,12,13,14,15。然而，系统性研究质谱分析中肽模拟物离子碎裂模式与其结构信息之间关联的工作仍非常有限。

多肽模拟物可通过固相法轻松合成。该方法已较为成熟，涉及一个两步单体添加循环的重复过程16,17。在每一次添加循环中，树脂负载的胺首先被卤代乙酸（通常为溴乙酸，BMA）乙酰化，随后与伯胺发生取代反应。尽管自动化合成方案已常规应用于多肽模拟物的合成，但在标准化学实验室中也可通过手动方法实现高产率的合成16,18,19,20。

本实验室已采用人工合成肽素的方法，并对现有方法中使用的装置进行了简化。我们此前曾利用串联质谱技术（MS/MS）研究了一系列肽素的裂解模式21,22,23。研究结果表明，当肽素经受碰撞诱导解离（CID）21,23或电子捕获解离（ECD）22实验时，会产生特征性的裂解片段。本文将展示如何在标准 化学实验室中合成寡肽素，如何使用三重四极杆质谱仪进行CID实验，以及如何分析谱图数据。待合成与表征的肽素为一种具有N端乙酰化和C端酰胺化的九聚体，其结构式为Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2。该肽素的结构如图1所示。

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方案

1. 肽模拟物的合成

注意：合成过程首先通过溶胀树脂并去除保护基团来活化树脂。随后通过重复添加单体的循环步骤，在树脂上生长肽拟物链。连接到树脂上的第一个单体为C端残基。肽拟物的延伸方向是从C端向N端进行。当获得目标肽拟物序列后，将树脂裂解，释放产物，并对肽拟物进行纯化。

  1. 试剂的制备
    注意：液体试剂使用微量移液器量取，固体试剂使用分析天平称量。
    1. 将 6.2 mL 的 N, N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）与 43.8 mL 的 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）混合，配制 0.8 M 的 DIC/DMF 溶液。
    2. 将 5.56 g 的 BMA 溶解于 50.0 mL 的 DMF 中，配制 0.8 M 的 BMA/DMF 溶液。
    3. 将 2 mL 的哌啶（Pip）与 8 mL 的 DMF 混合，得到 20% 的 Pip/DMF 溶液。
    4. 将 1.9 mL 的 Npe 溶解于 13.1 mL 的 DMF 中，得到 1.0 M 的 Npe/DMF 溶液。
    5. 将 1.3 mL 的 Nme 溶解于 13.7 mL 的 DMF 中，得到 1.0 M 的 Nme/DMF 溶液。
    6. 将 0.32 mL 的 Nae 溶解于 2 mL 的 DMF 中，得到 1.0 M 的 Nae/DMF 溶液。
      注意：合成中使用的大多数化学品具有危害性。三氟乙酸（TFA）、DIC、Pip 和 BMA 对皮肤、眼睛和呼吸道有害。DMF 和二氯甲烷（DCM）为疑似致癌物。所有反应均应在通风橱中进行，并使用适当个人防护装备。请查阅合成中所用化学品的材料安全数据表（MSDS）。
  2. 树脂活化
    1. 称取 84 mg 的 Rink 酰胺树脂（Resin，0.047 mmol，负载量 0.56 mmol/g），加入至一个 10 mL 的聚丙烯固相反应容器中。将推杆插入容器中。
    2. 向反应容器中加入 2 mL 的 DMF，并用压力盖密封容器。将容器置于摇床，于室温下以约 12 度的摆动角度和 385 次/分钟的振荡频率振荡 30 分钟。取下盖子，推动反应容器的推杆，将溶液排入废液容器中。
    3. 向容器中加入 2 mL 的 20% Pip/DMF 溶液，盖上盖子。在摇床上振荡 2 分钟，然后将溶液排入废液容器中。
    4. 向容器中加入 2 mL 的 20% Pip/DMF 溶液，盖上盖子，在室温下振荡 12 分钟。取下盖子，推动推杆将溶液排入废液容器中。
    5. 加入 1 mL 的 DMF，盖上盖子，振荡 1 分钟，取下盖子并推动推杆排出溶液，对树脂进行洗涤。再用 DMF 重复洗涤 4 次。
  3. 单体添加与 N 端乙酰化
    注意：每次单体添加循环包括两个反应步骤：溴乙酰化和取代反应。
    1. 进行第一次单体添加循环，生成 Nme-Resin。
    2. 进行溴乙酰化反应。在烧杯中混合 1 mL 的 0.8 M BMA/DMF 溶液和 1 mL 的 0.8 M DIC/DMF 溶液。将混合液转移至含有树脂的反应容器中，盖上盖子。将容器置于摇床，在室温下振荡 20 分钟。取下盖子，推动推杆将溶液排入废液容器中。
    3. 加入 1 mL 的 DMF，盖上盖子，振荡 1 分钟，推动推杆排出溶液，对树脂进行洗涤。再加入 1 mL 的 DCM，振荡 1 分钟后排出溶液。再用 DCM 洗涤一次，随后用 DMF 洗涤两次。
    4. 进行取代反应。加入 1 mL 的 1.0 M Nme/DMF 溶液，盖上盖子，在室温下振荡 60 分钟。取下盖子，推动推杆排出溶液。
    5. 加入 1 mL 的 DMF，振荡 1 分钟，推动推杆排出溶液，对树脂进行洗涤。再吸入 1 mL 的 DCM，振荡 1 分钟后排出溶液。再用 DCM 洗涤一次，随后用 DMF 洗涤两次。
    6. 重复步骤 1.3.2 至 1.3.5 的单体添加循环，生成 Nae-(Npe-Nme)4-resin。在重复取代反应步骤（1.3.4）时，根据肽拟物序列使用相应的胺溶液。
      注意：肽拟物链从 C 端向 N 端延伸，C 端残基与树脂相连。
    7. 进行 N 端乙酰化，生成 Ac-Nae-(Npe-Nme)4-resin。
    8. 在烧杯中混合 92 µL 的乙酸酐、43.5 µL 的 N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）和 2 mL 的 DMF，配制约 2 mL 的乙酰化混合液。
    9. 向含有树脂的容器中加入 2 mL 的乙酰化混合液，盖上盖子，在室温下振荡 60 分钟。取下盖子，推动推杆排出溶液。
    10. 加入 1 mL 的 DMF，振荡 1 分钟，推动推杆排出溶液，对树脂进行洗涤。再加入 1 mL 的 DCM，振荡 1 分钟后排出溶液。再用 DCM 洗涤一次，随后用 DMF 再洗涤两次。
    11. 加入 1 mL 的 DCM，振荡 1 分钟，推动推杆排出溶液，对树脂进行洗涤。再用 DCM 洗涤两次。取下盖子，让树脂在反应容器中室温下风干 10 分钟。
  4. 裂解与纯化
    1. 在烧杯中混合 3.8 mL 的 TFA、100 µL 的三异丙基硅烷（TIPS）和 100 µL 的 HPLC 级 H2O，配制 4 mL 的裂解混合液。
    2. 向含有树脂的容器中加入 4 mL 新鲜配制的裂解混合液，盖上盖子，在室温下振荡 2 小时。
    3. 取下盖子，将滤液收集至一个 50 mL 的聚丙烯离心管中。向容器中加入 1 mL 的 TFA，盖上盖子，振荡 1 分钟。将滤液收集至同一离心管中。
    4. 用氮气流轻轻吹扫，蒸发 TFA，直至剩余约 1 mL 的黏稠溶液。
    5. 向剩余溶液中加入 15 mL 的乙醚，盖上离心管盖子，在 -20 °C 冰箱中孵育 2 小时至过夜。粗品肽拟物 以白色固体形式析出。
    6. 在 4,427 x g 条件下离心 10 分钟，使固体沉淀。取下离心管盖子，小心倾倒乙醚至烧杯中，避免损失固体。
      注意：乙醚为易燃有机溶剂，请使用适用于乙醚的防爆离心机。
    7. 向含有固体的离心管中加入 10 mL 冰冷的乙醚，盖上盖子，置于离心机中。在 4,427 x g 条件下离心 10 分钟。从离心机中取出离心管，小心倾倒乙醚至烧杯中，避免损失固体。
    8. 用氮气流轻轻吹扫，使固体干燥。
    9. 加入 10 mL 的 HPLC 级 H2O 溶解干燥的固体。将溶液通过孔径为 0.45 µm 的尼龙注射式滤器过滤，滤液收集至已称重的 50 mL 聚丙烯离心管中。
    10. 将含有肽拟物溶液的离心管置于装有液氮的 12 盎司双层发泡聚苯乙烯杯（液氮填充至约 1/3 体积）中，边旋转边冷冻（壳冻法）。将冷冻后的溶液冷冻干燥过夜，得到固体肽拟物。
    11. 将固体肽拟物溶解于 10 mL 的 HPLC 级 H2O 中，再次进行壳冻法冷冻并冷冻干燥过夜，重复一次冷冻干燥过程。所得肽拟物纯度足以用于质谱法进行序列分析。

2. 质谱检测与序列分析

注意：MS/MS 实验在配备电喷雾电离（ESI）源的三重四极杆质谱仪中进行。数据采集由仪器配套的数据采集软件控制。一般步骤包括：1）进行全扫描质谱实验并记录质谱图，2）进行碰撞诱导解离（CID）MS/MS 实验并记录 MS/MS 谱图，3）将 MS/MS 谱图数据与基于肽模拟物结构特征预测的理论裂解模式进行比较。

  1. 样品溶液的制备
    1. 称取1.0–2.0 mg固体peptoid于3–5 mL玻璃小瓶中。加入1 mL乙腈与水的混合溶剂（ACN/H₂O，2O，1:1，v/v）溶解肽素，得到浓度约为10的储备样品溶液-3 M.
    2. 将20 µL储备液转移至1.5 mL离心管中，加入1 mL乙腈/水混合溶剂2O 以得到约 10 的稀释样品溶液-5 M.
    3. 以4,427 × g离心3分钟，去除稀释样品溶液中可能存在的不溶性颗粒。取上清液约700 µL转移至另一支1.5 mL离心管中，配制成浓度约为10的peptoid质谱工作溶液-5 M.
    4. 根据质谱测量过程中观察到的信号强度调整MS工作溶液的浓度。
    5. 去除稀释样品溶液中可能存在的不溶性颗粒的另一种方法是将样品溶液通过0.20 µm的一次性注射器滤器，收集滤液至1.5 mL离心管中，制备浓度约为10的peptoid质谱工作溶液-5 M.
  2. 记录质谱图
    1. 运行乙腈/水混合溶剂2通过电喷雾离子化（ESI）源以1:1（v/v）的比例引入O，并将仪器设置为标准正离子模式下的全扫描质谱模式，质荷比（m/z）范围为100–1500。
      注意：
      典型操作参数：
      ESI 针电压，5 kV
      毛细管电压，40 V
      干燥气体（氮气）温度，200 °C。
    2. 加入约 300 µL 的 peptoid MS 工作溶液（约 10-5 将样品溶液（M）吸入500 µL或1 mL注射器中，使用毛细聚醚醚酮（PEEK）管路将注射器连接至电喷雾电离（ESI）进样口。将注射器置于注射泵上，设定流速为10 µL/min，以将样品溶液注入ESI进样口。
    3. 打开电喷雾离子化（ESI）针电压以启动ESI过程，然后开启检测器。将显示模式设为轮廓模式，质荷比（m/z）范围设为100 - 1,500。在轮廓窗口中查看质谱图谱。m/z 1,265处的峰（显示为m/z 1,264.6）对应于肽模拟物离子或质子化肽模拟物。
    4. 记录质谱 2 分钟。在 "方法窗口"，使用2 min作为 "运行时间。” 打开记录窗口，填写合适的文件名，然后开始记录光谱。
      注意：所得质谱图如图所示 图3.
    5. 优化质荷比（m/z）为1,265的峰强度。将m/z范围设置为1,150 - 1,350，并在观察轮廓窗口中显示的以mV为单位的峰强度的同时调节毛细管电压。例如，将毛细管电压升高至50 V或更高，观察峰强度的变化。最佳峰强度约为150 - 200 mV。
      注意：调节毛细管电压会显著改变某些离子的丰度。提高毛细管电压可能增强肽模拟物离子的信号强度。然而，过高的毛细管电压可能引起肽模拟物离子在离子源内的解离，从而降低观测到的信号强度。调节干燥气温度可能增强m/z 1,265处峰的强度，但其效果不如调节毛细管电压显著。如果m/z 1,265处的峰未达到理想强度，可调整样品浓度（例如，将质谱工作溶液的浓度加倍）。
    6. 将仪器切换至 MS/MS 模式。设定前体离子为 m/z 1,265，MS/MS 质量扫描范围为 m/z 100 - 1,400。在 "方法窗口，“使用 m/z 1,265 作为 "Q1 第一次质谱" 并留下 "Q1 上一次质量" 空白。使用 m/z 100 作为 "Q3 第一次质谱" 以及 m/z 1,400 作为 "Q3 最后一次称重。"
      注意：在MS/MS模式下，第一个四极杆单元（Q1）作为质量过滤器，用于选择肽模拟物离子作为前体离子；第二个四极杆单元（Q2）为碰撞池；第三个四极杆单元（Q3）作为质量分析器。
    7. 将碰撞能量设为 40 eV，碰撞气（此处为氩气）压力设为 1.5 mTorr。
    8. 在谱图窗口中查看质谱图谱。质荷比（m/z）为 1,265 处的峰对应于肽模拟物离子，而质荷比较低的峰则代表该肽模拟物离子的碎片离子。
    9. 调节碰撞能量以优化碎片谱图的显示。例如，将碰撞能量提高至45 eV，并观察谱图轮廓的变化。
      注意：通常情况下，提高碰撞能量会增加碎片离子的丰度，同时降低肽模拟物离子的丰度。增加碰撞气压力也会提高碎片离子的丰度。
      注意：切勿将碰撞气体压力增加至超过 2 mTorr。
    10. 记录 MS/MS 谱图 2 分钟。在 "方法窗口，“使用2 min作为 "运行时间。” 打开记录窗口，填写合适的文件名，然后开始记录光谱。
    11. 重复记录1 - 2次。
  3. 肽模拟物序列分析
    注意：在 CID 条件下，肽模拟物离子将在肽模拟物骨架的酰胺键处发生断裂，产生一系列 N-末端片段（称为 B 离子）和一系列 C-末端片段（称为 Y 离子）。
    1. 从左侧到右侧依次画出乙酰化肽模拟物的化学结构，其中N端位于左侧，C端位于右侧，并在每个酰胺键处绘制一条虚线，以生成如图所示的裂解示意图 图2a用虚线圆圈画出质子，以表示电荷载体。从结构的左侧开始，在虚线上标注标签，以表示N端片段为B1，B2，至B8从右侧开始，在虚线上放置标签以标明C端片段为Y1, Y2，至 Y8.
      注意：可使用化学绘图软件绘制肽拟物结构。
    2. 想象在 4 处发生断裂th 从左侧水解酰胺键，并画出具有正确形式电荷的N端片段和C端片段的结构，如图所示 图2b. 将 B 的标签放置于4 在N端片段上，并将Y的标签置于5 在C端片段上。计算B的质荷比（m/z）值4 通过将结构中各元素的标称质量相加，得到数值580，并将m/z 580标注在N端片段上。计算Y离子的m/z值5 并将 m/z 685 定位于C端片段上。
    3. 计算所有八个 B 离子和所有八个 Y 离子的 m/z 值，并将它们整理成表格，如所示 表1.
      注意：可使用化学绘图软件计算碎片的质荷比（m/z）值。
    4. 使用随仪器配备的数据分析软件打开肽模拟物的质谱/质谱（MS/MS）谱图记录。将标记偏好设置为 "显示离子标签" 并将标签阈值设为3%。这将生成一张在峰上标注了m/z值的MS/MS谱图。
    5. 将MS/MS质谱数据导出为CSV格式的文本文件，并使用数据处理软件重建质谱图。在峰上标注m/z值。所得MS/MS质谱图如下所示 图4.
      注意：某些质谱仪配备有可生成 MS/MS 谱图的数据处理软件。在此情况下，无需导出 MS/MS 谱图数据。
    6. 将质谱/质谱图谱上显示的 m/z 值与所示的值进行匹配 表1 以鉴定相应的B离子和Y离子。例如，质荷比（m/z）为580的峰被鉴定为B离子4离子，m/z 685 被鉴定为 Y5-离子。在谱图上用相应的B和Y符号标记各峰，如图所示。 图4.

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结果

带有N端乙酰化的9聚肽拟物Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2的结构如图1所示。该肽拟物通过固相合成法，在带有滤板的聚丙烯反应容器中手动合成。使用Rink酰胺树脂（0.047 mmol，84 mg，负载量0.56 mmol/g）作为固相载体，以获得C端酰胺化的肽拟物。肽拟物链通过多次单体添加循环逐步构建。每个单体添加循环包含两个反应步骤：溴乙酰化和取代反应。溴乙酰化通过加入0.8 M BMA溶液和0.8 M DIC溶液实现，反应时间为20分钟。取代反应通过向乙酰化产物中加入1.0 M胺溶液实现，反应时间为1小时。N端乙酰化通过加入含有92 µL乙酸酐、43.5 µL DIPEA和2 mL DMF的混合溶液完成。肽拟物通过加入含有3.8 mL TFA、100 µL TIPS和100 µL HPLC级H2O的混合溶液从树脂上裂解下来，反应持续2小时。在通风橱中通过通入氮气流除去TFA，直至剩余约1 mL黏稠溶液。肽拟物产物在乙醚中沉淀，经离心分离...

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讨论

已采用所述方案合成了一个九聚肽模拟物 Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2。合成装置包括一个类似注射器的聚丙烯固相反应容器和一台机械振荡器。该反应容器可商业购得，且成本较低。机械振荡器是化学实验室中常见的设备。通过使用类似注射器的反应容器，可通过手动推动活塞将溶液吸入或推出容器。该技术使得单体添加和树脂裂解反应可在同一个反应容器中完成，从而省去了将树脂结合的中间产物转移至另一容器进行裂解的步骤。该方法还无需使用真空抽滤装置从反应容器中移除溶液。真空抽滤通常用于其他研究人员已报道的手动肽模拟物合成中19,20。在每步反应之间充分洗涤树脂对于获得高纯度产物至关重要。一个潜在的问题是在多次单体添加循环后，反应容器中的烧结滤板可能发生堵塞。解决该问题的方法是将树脂转移至新的反应容器中，并继续合成过程。该合成方法适用于长度不超过10至12个残基的肽模拟物。对于更长的肽模拟物，仅靠推动活塞难以完全移除反应容器中的溶液。此时可使用真空抽滤装置移除液体（应将活塞替换为密封塞）。在合成方案...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢迈克尔·康诺利先生和罗纳德·祖克曼博士（劳伦斯伯克利国家实验室分子制造研究所）在肽模拟物合成技术方面提供的支持。我们感谢美国国家科学基金会（CHE-1301505）提供的资助。所有质谱实验均在太平洋大学化学质谱中心完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ESI-三重四极杆质谱仪，Varian 320LAgilent Technologies Inc.质谱仪购自Varian, Inc.
Varian质谱工作站，版本6.9.2，数据采集与数据审查软件Varian Inc.该软件为Varian 320L套件的一部分
Burrell Scientific腕动式摇床，型号75 DDFisher Scientific International Inc.14-400-126
Hermle离心机，型号Z 206 AHermle Labortechnik GmbH
固相反应瓶，10 mLTorviqSF-1000
反应瓶用压力盖TorviqPC-SF
注射器滤器，孔径0.2 μmFisher Scientific Inc.03-391-3B
注射器滤器，孔径0.45 μmFisher Scientific Inc.03-391-3A
聚丙烯离心管，50 mLVWR International, LLC.490001-626
聚丙烯离心管，15 mLVWR International, LLC.490001-620
ChemBioDraw Ultra，版本12.0CambridgeSoft CorporationCambridgeSoft现为PerkinElmer Inc.的一部分
聚苯乙烯杯，12盎司普通超市
Rink酰胺树脂Chem-Impex International, Inc.10619
哌啶Chem-Impex International, Inc.02351剧毒
N,N’-二异丙基碳二亚胺Chem-Impex International, Inc.00110剧毒
溴乙酸Chem-Impex International, Inc.26843剧毒
2-苯乙胺VWR International, LLC.EM8.07334.0250
2-甲氧基乙胺Sigma-Aldrich Co. LLC.241067
N-Boc-乙二胺VWR International, LLC.AAAL19947-06
乙酸酐Sigma-Aldrich Co. LLC.252845
N,N-二甲基甲酰胺VWR International, LLC.BDH1117-4LG使用前需进一步蒸馏
N,N-二异丙基乙胺Chem-Impex International, Inc.00141
三异丙基硅烷Chem-Impex International, Inc.01966
三氟乙酸Chem-Impex International, Inc.00289剧毒
Millipore MILLI-Q Academic 水纯化系统Millipore CorporationZMQP60001用于制备HPLC级水
HPLC级水由Millipore MILLI-Q® Academic 水纯化系统制得
甲醇Pharmco-Aaper339USP/NFHPLC级
乙腈Fisher Scientific International, Inc.A998-4HPLC级
乙醚VWR International, LLC.BDH1121-19L使用前需进一步蒸馏
二氯甲烷VWR International, LLC.BDH1113-19L使用前需进一步蒸馏
氮气Fresno Oxygen/Barnes SupplyNIT 50-C-F超高纯度，99.9995%
氩气Fresno Oxygen/Barnes SupplyARG 50-C-F超高纯度，99.9995%

参考文献

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