本文描述了一种通过质谱分析进行序列鉴定的寡聚肽拟物的手动合成方案。
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摘要
摘要
肽模拟物（peptoids）是一类序列可控的肽类似寡聚物，由N-烷基化甘氨酸单元组成。在众多潜在应用中，肽模拟物被认为可作为一种分子信息存储介质。质谱分析被认为是测定肽模拟物序列的首选方法。肽模拟物可通过固相化学合成法，利用重复的两步反应循环进行合成。本文介绍了一种手动合成寡聚肽模拟物的方法，并利用串联质谱（MS/MS）技术对肽模拟物的序列进行分析。样品肽模拟物为一个九聚体，其序列交替含有N-(2-甲氧乙基)甘氨酸（Nme）和N-(2-苯乙基)甘氨酸（Npe），并在N端含有一个N-(2-氨基乙基)甘氨酸（Nae）。该肽模拟物的序列结构式为Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2，其中Ac代表乙酰基。合成反应在市售的固相反应容器中进行。以Rink酰胺树脂作为固相载体，使最终获得的肽模拟物在C端带有酰胺基团。所得肽模拟物产物通过配备电喷雾电离源的三重四极杆质谱仪进行序列分析。MS/MS检测产生一系列由带电肽模拟物解离形成的碎片离子谱图。这些碎片离子根据其质荷比（m/z）值被分离检测。将测得的碎片离子m/z值与理论预测的碎片离子名义质量进行比对，依据肽模拟物的裂解规律进行分析。由此得到带电肽模拟物的裂解图谱，该图谱与中性肽模拟物的单体序列相对应。因此，质谱分析可读取肽模拟物的序列信息。
引言
肽模拟物是一类序列可控的聚合物，其骨架结构模拟了肽的结构。肽模拟物可由多种不同的胺合成，从而使肽模拟物表现出高度可调的性质1,2。肽模拟物已被用作生物物理研究的分子模型，被视为潜在的治疗剂，并被设计为蛋白质的配体3,4,5,6。肽模拟物已开发为多种生物活性化合物，例如抗污损材料和抗体模拟材料、抗菌剂以及酶抑制剂7,8,9。由于具有高度有序且可调控的特性，肽模拟物也被认为是一种分子信息存储材料10。这些多样化应用的发现，促使人们需要发展高效的分析方法，以表征肽模拟物的序列和结构。基于串联质谱的技术已显示出作为分析序列可控聚合物（包括肽模拟物）序列特性的首选方法的潜力11,12,
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方案
1. 肽模拟物的合成
注意：合成过程首先通过溶胀树脂并去除保护基团来活化树脂。随后通过重复添加单体的循环步骤，在树脂上生长肽拟物链。连接到树脂上的第一个单体为C端残基。肽拟物的延伸方向是从C端向N端进行。当获得目标肽拟物序列后，将树脂裂解，释放产物，并对肽拟物进行纯化。
- 试剂的制备
注意：液体试剂使用微量移液器量取，固体试剂使用分析天平称量。- 将 6.2 mL 的 N, N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）与 43.8 mL 的 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）混合，配制 0.8 M 的 DIC/DMF 溶液。
- 将 5.56 g 的 BMA 溶解于 50.0 mL 的 DMF 中，配制 0.8 M 的 BMA/DMF 溶液。
- 将 2 mL 的哌啶（Pip）与 8 mL 的 DMF 混合，得到 20% 的 Pip/DMF 溶液。
- 将 1.9 mL 的 Npe 溶解于 13.1 mL 的 DMF 中，得到 1.0 M 的 Npe/DMF 溶液。
- 将 1.3 mL 的 Nme 溶解于 13.7 mL 的 DMF 中，得到 1.0 M 的 Nme/DMF 溶液。
- 将 0.32 mL 的 Nae 溶解于 2 mL 的 DMF 中，得到 1.0 M 的 Nae/DMF 溶液。
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结果
带有N端乙酰化的9聚肽拟物Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2的结构如图1所示。该肽拟物通过固相合成法，在带有滤板的聚丙烯反应容器中手动合成。使用Rink酰胺树脂（0.047 mmol，84 mg，负载量0.56 mmol/g）作为固相载体，以获得C端酰胺化的肽拟物。肽拟物链通过多次单体添加循环逐步构建。每个单体添加循环包含两个反应步骤：溴乙酰化和取代反应。溴乙酰化通过加入0.8 M BMA溶液和0.8 M DIC溶液实现，反应时间为20分钟。取代反应通过向乙酰化产物中加入1.0 M胺溶液实现，反应时间为1小时。N端乙酰化通过加入含有92 µL乙酸酐、43.5 µL DIPEA和2 mL DMF的混合溶液完成。肽拟物通过加入含有3.8 mL TFA、100 µL TIPS和100 µL HPLC级H2O的混合溶液从树脂上裂解下来，反应持续2小时。在通风橱中通过通入氮气流除去TFA，直至剩余约1 mL黏稠溶液。肽拟物产物在乙醚中沉淀，经离心分离.......
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讨论
已采用所述方案合成了一个九聚肽模拟物 Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2。合成装置包括一个类似注射器的聚丙烯固相反应容器和一台机械振荡器。该反应容器可商业购得，且成本较低。机械振荡器是化学实验室中常见的设备。通过使用类似注射器的反应容器，可通过手动推动活塞将溶液吸入或推出容器。该技术使得单体添加和树脂裂解反应可在同一个反应容器中完成，从而省去了将树脂结合的中间产物转移至另一容器进行裂解的步骤。该方法还无需使用真空抽滤装置从反应容器中移除溶液。真空抽滤通常用于其他研究人员已报道的手动肽模拟物合成中19,20。在每步反应之间充分洗涤树脂对于获得高纯度产物至关重要。一个潜在的问题是在多次单体添加循环后，反应容器中的烧结滤板可能发生堵塞。解决该问题的方法是将树脂转移至新的反应容器中，并继续合成过程。该合成方法适用于长度不超过10至12个残基的肽模拟物。对于更长的肽模拟物，仅靠推动活塞难以完全移除反应容器中的溶液。此时可使用真空抽滤装置移除液体（应将活塞替换为密封塞）。在合成方案.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢迈克尔·康诺利先生和罗纳德·祖克曼博士（劳伦斯伯克利国家实验室分子制造研究所）在肽模拟物合成技术方面提供的支持。我们感谢美国国家科学基金会（CHE-1301505）提供的资助。所有质谱实验均在太平洋大学化学质谱中心完成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ESI-三重四极杆质谱仪，Varian 320L | Agilent Technologies Inc. | 质谱仪购自Varian, Inc. | |
| Varian质谱工作站，版本6.9.2，数据采集与数据审查软件 | Varian Inc. | 该软件为Varian 320L套件的一部分 | |
| Burrell Scientific腕动式摇床，型号75 DD | Fisher Scientific International Inc. | 14-400-126 | |
| Hermle离心机，型号Z 206 A | Hermle Labortechnik GmbH | ||
| 固相反应瓶，10 mL | Torviq | SF-1000 | |
| 反应瓶用压力盖 | Torviq | PC-SF | |
| 注射器滤器，孔径0.2 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3B | |
| 注射器滤器，孔径0.45 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3A | |
| 聚丙烯离心管，50 mL | VWR International, LLC. | 490001-626 | |
| 聚丙烯离心管，15 mL | VWR International, LLC. | 490001-620 | |
| ChemBioDraw Ultra，版本12.0 | CambridgeSoft Corporation | CambridgeSoft现为PerkinElmer Inc.的一部分 | |
| 聚苯乙烯杯，12盎司 | 普通超市 | ||
| Rink酰胺树脂 | Chem-Impex International, Inc. | 10619 | |
| 哌啶 | Chem-Impex International, Inc. | 02351 | 剧毒 |
| N,N’-二异丙基碳二亚胺 | Chem-Impex International, Inc. | 00110 | 剧毒 |
| 溴乙酸 | Chem-Impex International, Inc. | 26843 | 剧毒 |
| 2-苯乙胺 | VWR International, LLC. | EM8.07334.0250 | |
| 2-甲氧基乙胺 | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 241067 | |
| N-Boc-乙二胺 | VWR International, LLC. | AAAL19947-06 | |
| 乙酸酐 | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 252845 | |
| N,N-二甲基甲酰胺 | VWR International, LLC. | BDH1117-4LG | 使用前需进一步蒸馏 |
| N,N-二异丙基乙胺 | Chem-Impex International, Inc. | 00141 | |
| 三异丙基硅烷 | Chem-Impex International, Inc. | 01966 | |
| 三氟乙酸 | Chem-Impex International, Inc. | 00289 | 剧毒 |
| Millipore MILLI-Q Academic 水纯化系统 | Millipore Corporation | ZMQP60001 | 用于制备HPLC级水 |
| HPLC级水 | 由Millipore MILLI-Q® Academic 水纯化系统制得 | ||
| 甲醇 | Pharmco-Aaper | 339USP/NF | HPLC级 |
| 乙腈 | Fisher Scientific International, Inc. | A998-4 | HPLC级 |
| 乙醚 | VWR International, LLC. | BDH1121-19L | 使用前需进一步蒸馏 |
| 二氯甲烷 | VWR International, LLC. | BDH1113-19L | 使用前需进一步蒸馏 |
| 氮气 | Fresno Oxygen/Barnes Supply | NIT 50-C-F | 超高纯度，99.9995% |
| 氩气 | Fresno Oxygen/Barnes Supply | ARG 50-C-F | 超高纯度，99.9995% |
参考文献
- Sun, J., Zuckermann, R. N. Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material. ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).
- Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward....
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重印与许可
