本方案阐述了评估监测活力参数和DNA修复过程在利用低气压等离子体处理后复苏Bacillus subtilis芽孢中的相关性所需的重要连续步骤，通过时间分辨共聚焦显微镜和扫描电子显微镜追踪荧光标记的DNA修复蛋白来实现。
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摘要
摘要
等离子体灭菌是工业、临床及航天领域中传统灭菌方法的一种有前景的替代方案。低压等离子体（LPP）放电含有多种活性物质，可导致微生物迅速失活。为了研究LPP灭菌的效率及其作用机制，我们采用模式生物Bacillus subtilis的芽孢，因其对传统灭菌方法具有极强的抗性。本文描述了B. subtilis芽孢单层的制备、在双电感耦合等离子体反应器中利用低压等离子体进行灭菌的过程、通过扫描电子显微镜（SEM）对芽孢形态进行表征，以及通过活细胞显微镜分析芽孢的萌发与生长过程。等离子体活性物质的主要靶标是基因组物质（DNA），而在芽孢复苏过程中修复等离子体诱导的DNA损伤对生物体的存活至关重要。在此，我们通过时间分辨共聚焦荧光显微镜追踪荧光标记的DNA修复蛋白（RecA），研究经LPP处理后芽孢的萌发能力以及DNA修复在芽孢萌发和生长过程中的作用。将经处理与未经处理的芽孢单层激活以启动萌发，并利用倒置共聚焦活细胞显微镜随时间观察单个芽孢的反应。我们的观察结果显示，能够萌发并生长的芽孢比例依赖于LPP处理时间，在处理120秒后达到最低值。RecA-YFP（黄色荧光蛋白）荧光仅在少数芽孢中被检测到，且在所有生长中的细胞中均有表达，经LPP处理的芽孢中荧光略有增强。此外，部分源自LPP处理芽孢的营养态细菌表现出胞质增加，并倾向于发生裂解。本文所述的单个芽孢分析方法可为研究芽孢萌发与生长的其他方面提供范例。
引言
太空探索的主要目标之一是在太阳系的其他行星和卫星上寻找生命形式和生物分子的迹象。将地球来源的微生物或生物分子转移到关键探索区域，可能对火星和木卫二等天体上的生命探测任务的进展和完整性构成重大风险1。由空间研究委员会（COSPAR）于1967年制定的行星保护国际准则，对载人和无人航天器前往其他行星、卫星、小行星及其他天体的任务施加了严格规定，要求在发射前对航天器及关键硬件组件进行清洁和灭菌，以消除地球微生物污染，并防止天体之间的交叉污染2。在过去十年中，非热等离子体的应用在生物医学、营养学研究以及航天任务中获得了广泛关注3,4,5。等离子体灭菌作为一种有前景的替代传统灭菌方法的技术，具有快速高效的微生物灭活能力6，同时对敏感和热不稳定的材料较为温和。等离子体放电包含多种活性物质，如自由基、带电粒子、中性/激发态原子，以及紫外（UV）和真空紫外（VUV）波段的光子，这些成分共同导致微生物的快速失活3。在本研究中，我们采用由双感应耦合低气压等离子体（DICP）源产生的低气压等离子体7,8，对分布在玻璃测试表面的Bacillus subtilis芽孢进行灭活处理。
芽孢杆菌科（Bacillaceae）的革兰氏阳性细菌广泛分布于土壤、沉积物和空气等自然环境中，也存在于洁净室设施和国际空间站等特殊环境9,10,11。芽孢杆菌属（Bacillus）最显著的特征是能够形成高度抗逆的休眠内生孢子（以下简称孢子），以在营养匮乏等不利条件下存活12。与营养细胞相比，孢子对多种处理方式和环境胁迫（如高温、紫外线、γ射线辐射、干燥、机械破坏以及强氧化剂或改变pH的有毒化学物质）具有更强的抗性（参见文献13,14的综述），因此是评估微生物灭活方法效率的理想研究对象。由于基因组DNA是等离子体处理细菌的主要靶标15,16，孢子复苏过程中对等离子体诱导的DNA损伤（如DNA双链断裂）的修复对于细菌存活至关重要13,17。
因此，我们通过时间分辨共聚焦荧光显微镜对单个孢子及其荧光标记的DNA修复蛋白RecA的表达进行动态追踪，研究经低压氩等离子体处理后孢子的萌发能力以及DNA修复在孢子萌发和生长期中的作用。本文详细提供了以下实验步骤：制备单层的枯草芽孢杆菌（B. subtilis）孢子以获得可重复的实验结果；利用低压等离子体对孢子单层进行灭菌处理；制备经等离子体处理的孢子用于扫描电子显微镜（SEM）的超微结构评估；以及在单个孢子水平上开展活细胞显微观察，同时监测细胞内响应等离子体处理而发生的活性DNA修复过程。
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方案
1. Bacillus subtilis 芽孢的制备与纯化
- 用于产孢，取相应菌株的5 mL过夜培养物进行转移 B. subtilis 菌株，加入适当的抗生素，接种于200 mL双倍浓度的液体Schaeffer孢子形成培养基（每升含16 g营养肉汤、2 g KCl、0.5 g MgSO₄）4*7 H2O，2 mL 1 M Ca(NO3)2，2 mL 0.1 M MnCl2 *• 4 H2O, 2 mL 1 mM FeSO4，2 mL 50% (w/v) 葡萄糖18）并在充分通气条件下培养 37 °C 72 小时或直至 > 95% 的培养物已完成孢子形成。以下菌株的孢子用于实验： B. subtilis PY79（野生型） B. subtilis PY79ΔrecA::neo（缺乏DNA修复蛋白RecA） B. subtilis PY79 recA-yfp::cat（RecA 与黄色荧光蛋白 [YFP] 融合）19).
- 通过在50 mL离心管中以3,000 x g离心15分钟收集孢子，并使用无菌蒸馏H₂O通过重复洗涤步骤（最多15次）纯化样品2O，并通过相差显微镜检查纯度和萌发状态。确保孢子悬液由折光性强的明亮孢子组成（> 99%），且不含营养细胞（杆状）、已萌发的芽孢（呈黑色/灰色外观）及细胞碎片，否则会干扰后续显微镜实验。持续洗涤样品直至达到所需纯度。
- 测定孢子滴度通过涂布平板法 50 µL 在LB-琼脂平板上进行10倍系列稀释（即：使用 30 µL 样本 + 270 µL 无菌水进行1:10稀释。取 30 µL 从特定稀释度到 270 µL H2O，用于计算CFU（菌落形成单位）并将平板置于 37 °C 过夜。在测定菌落形成单位（CFU）后，将样品调整至109 每毫升孢子数通过无菌水浓缩或稀释进行调整。
2. 气溶胶沉积的Bacillus subtilis芽孢样品制备
注意：孢子的聚集和重叠可能导致处理过程中出现遮蔽效应，最终导致失活动力学数据的错误。为尽量减少这一问题，采用气溶胶沉积技术制备孢子样品20。简言之，通过电子定时器控制高精度双组分喷嘴，调节液体通量，同时与加压载气（此处为 N2）的气流协同作用。利用氮气气流将注入的液体样品从喷嘴出口分散。
- 将样品载体（用于存活动力学实验的无菌显微镜载玻片，或用于荧光追踪 DNA 修复过程/共聚焦激光扫描显微镜 cLSM 的圆形 25 mm 盖玻片）放置于电动气溶胶喷雾装置内，并与喷嘴对齐。所用孢子浓度需相当于最终所需浓度的百倍。
- 将 1 mL 孢子培养物转移至喷嘴液体入口，在 1.3 bar 压力下启动喷雾过程，持续 0.1 秒。喷出的孢子悬浮液（1 × 107）在载玻片表面形成一层薄膜，并在数秒内迅速干燥，形成均匀分布的单层孢子。将处理后的样品载体置于无菌容器中，室温保存。
3. 低压等离子体处理
- 准备等离子体系统以处理生物样品，使用500 W的氩等离子体在5 Pa条件下运行5分钟。通过此步骤可清洁系统内所有表面并使其预热，从而在系统通气过程中减少环境中分子（主要是氮气、氧气和水）在表面的吸附。完成系统预处理后，对腔室通气，并借助玻璃支架小心地将样品放置于反应器容器的中心位置。
- 实验需使用至少三个生物学重复。关闭腔室并抽真空至2 Pa以下。随后将工艺气体通入腔室，调节系统压力至5 Pa。
- 在设定的处理时间结束后，关闭电源和气体供应，并小心通气以防止样品从样品支架上被吹落。通气完成后取出样品，并将下一组参数的样品放入系统中。对于未经等离子体处理的对照组，仅将样品暴露于真空（5 Pa）和工艺气体中，持续时间与最长的等离子体处理时间相同。
4. 芽孢存活率的回收与评估
- 配制高压灭菌的10%聚醋酸乙烯酯（PVA）溶液，并小心地将样品载体覆盖约 500 µL 静置风干4 h。用无菌镊子剥离已干燥的PVA层（现含有孢子样品），转移至2 mL反应管中。向管中加入1 mL无菌水，通过涡旋振荡溶解PVA层。该操作可导致 >孢子回收率达95%，且不影响其萌发能力21.
- 在96孔板中用无菌水以1:10的比例对样本进行连续稀释（即 270 µL 无菌 H2O + 30 µL 样品/前体稀释）。涂布平板 50 µL 各稀释度的Lysogeny broth营养琼脂（LB）平板，置于 37 °C 过夜培养后，计数生长的菌落数量（CFU）。
5. 萌发孢子中DNA修复过程的活细胞显微观察与追踪
- 进行萌发实验时，通过将700 µL培养基煮沸并用移液器转移至无菌显微镜培养皿中，制备厚度为1 mm的1.5% LB-琼脂垫。10分钟后，使用无菌手术刀切出一块8 mm × 8 mm × 1 mm的LB-琼脂垫，并小心地将其转移至位于25 mm玻璃盖玻片上的孢子单层上方。
注意：此步骤对于观察单个孢子至关重要，可追踪其对由营养琼脂诱导的萌发激活的反应。因此，LB-琼脂具有两个作用：（1）固定孢子于表面，避免其在表面重新定位或偏离光学焦平面；（2）激活孢子以启动萌发。 - 在样品上覆盖琼脂后，迅速将玻璃盖玻片转移至成像室，并使用配备63X/1.3平场复消色差油浸物镜的倒置共聚焦激光扫描显微镜对样品进行显微观察。
- 使用514 nm激发波长进行荧光（YFP）成像，发射光检测范围为520至560 nm。
- 使用光电倍增管（透射光路径）在扫描模式下采集明场图像。
- 以2.6%的激光功率记录时间序列图像，将共聚焦孔径设为5个艾里单位，采样频率为每30秒1帧，持续时间从0 h至5 h，具体根据实验需求而定。需特别注意的是，514 nm单色激光照射剂量过高会完全抑制孢子萌发（图1A, B）。
- 在整个成像过程中，将样品置于加热载台上，保持37 °C（环境空气湿度）。每种条件至少进行三次生物学重复实验。若出现孢子聚集、多层分布或灰尘颗粒污染，可能导致等离子体处理受阻（“遮蔽效应”），从而使被遮蔽区域的孢子发生萌发（图1C, D）。
图1：等离子体处理孢子在共聚焦活细胞荧光显微镜观察过程中观察到的潜在问题。 (A，B高剂量单色（514 nm）激光照射抑制孢子萌发。（A）概览图（3 × 3 拼接图像） B. subtilis (LAS72, RecA-YFP) 芽孢在萌发启动后 180 分钟。中间的视野每隔 30 秒接受一次高剂量激光照射（514 nm，70% 激光功率），而周围区域（= 视野）未进行照明（明场通道与 RecA-YFP 荧光的合并图像；有序结构的出现是由于使用了带有压印图案的 35 mm 成像培养皿所致） 500 µm 网格. (B) 展示了光照区域与非光照区域边界的4倍放大图像，显示暴露于高剂量单色激光照射的孢子未发生萌发和生长，而非光照区域的孢子则完全恢复为营养态细菌，并表达强烈的RecA-YFP荧光（绿色信号）。C，D被污染物颗粒覆盖或处于多层孢子结构中的孢子（箭头所示）似乎可保护下层孢子免受等离子体处理的灭活作用，从而使其能够萌发并继续生长（“遮蔽效应”）。C孢子经等离子体处理60秒后，在萌发开始后180分钟进行成像，或在（D）持续120秒，并在240分钟后成像。 请点击此处以查看此图的放大版本。
6. 扫描电子显微镜（SEM）
- 采用扫描电子显微镜提供经等离子体处理的孢子与未经处理的对照组在表面形态上的超微结构信息。使用溅射镀膜仪在盖玻片上的干燥孢子单层表面镀上金-钯（3 nm）。使用场发射扫描电子显微镜对样品进行成像，加速电压为5 kV，并配备片内二次电子探测器以显示表面形貌反差。
7. 数据分析
- 根据处理样品的平均菌落形成单位（CFU）N 与未经处理的真空对照样品的平均菌落形成单位（CFU）N0 的比值 N/N0，确定孢子存活率。以处理时间（秒）为函数，绘制氩等离子体处理对孢子灭活的曲线。所有数据均以平均值±标准差表示（n = 3）。
- 使用成像软件分析活细胞成像所获得的图像。量化等离子体处理后孢子萌发及萌发后生长的比例，在实验开始时以及4小时后，统计代表性视野中的孢子数量。在孢子存活率测定中，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合统计学软件进行显著性检验，P 值 <0.05 被认为具有统计学显著性。
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结果
经等离子体处理的B. subtilis芽孢存活率
本研究中使用的 B. subtilis 芽孢经等离子体处理后，其存活率随处理时间延长而降低（图2）。表达与YFP融合的recA基因菌株的芽孢，其存活曲线与野生型菌株相似，表明该遗传修饰对细菌活力无显著影响。RecA缺陷型菌株的芽孢对等离子体处理的敏感性高于野生型菌株，表明RecA基因的存在可减轻等离子体诱导的活力丧失。特别是15秒（P <0.003）和30秒（P <0.004）的短时间等离子体处理，导致RecA缺陷型菌株的活力较野生型和RecA-YFP菌株显著下降。经过90秒等离子体处理后，所有菌株的活力均下降约三个数量级。
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讨论
使用低温低压等离子体对表面进行灭菌是替代传统灭菌方法（如电离辐射、化学试剂处理）的一种有前景的方案例如 像 H 这样的气体2O2 或环氧乙烷）或干热与湿热23普通灭菌方法大多可实现有效灭菌，但已知会影响被处理材料，并对操作人员构成潜在风险。低压等离子体利用多种组分（如紫外光子、自由电子、离子以及激发态原子或分子）的协同作用，实现快速且均匀的生物失活。例如 ROS）。因此，LPP 可应用于对热和腐蚀敏感的材料，例如用于植入物的热塑性聚合物、电子仪器或复杂的三维结构。在本文中，我们展示了该测试系统的应用，其中采用喷雾形成的单层 B. subtilis 孢子20 在最近已详细描述的特定低压等离子体反应器中进行处理7显微镜明场观察等离子体处理后的孢子可能足以对灭菌效率进行总体评估。然而，我们的研究兴趣在于揭示低压等离子体作用的内在机制，以及其在分子水平上对孢子失活的影响。结合荧光示踪显微技术，该方法能够使我...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢Andrea Schröder在本研究部分工作中提供的出色技术协助，以及Nikea J. Ulrich在视频拍摄期间提供的帮助。 我们还要感谢Lyle A. Simmons慷慨提供了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株LAS72和LAS24。本研究部分得到了德国研究基金会（DFG）Paketantrag项目（PlasmaDecon PAK 728）对PA（AW 7/3-1）和RM（MO 2023/2-1）的资助，以及德国航空航天中心（DLR）DLR-FuW-Projekt ISS LIFE项目、RF-FuW计划、子项目475（资助编号：F.M.F、M.R.和R.M.）的资助。F.M.F.获得了德国科隆德国航空航天中心（DLR）亥姆霍兹空间生命科学研究学院（SpaceLife）提供的博士奖学金资助，该奖学金由亥姆霍兹协会（Helmholtz-Gemeinschaft）资助六年（资助编号VH-KO-300），并额外获得了来自DLR包括航空航天执行委员会和航空航天医学研究所的资金支持。本研究的结果将纳入Felix M. Fuchs的博士学位论文中。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 双组分喷嘴（型号 970-8） | Schlick | 14,404 | 230 V，50 Hz，D 4.484/8，0.8 mm 内径 |
| Luria Bertani 培养基 | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| 管路连接器 | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN 聚酰胺管 | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| 载玻片 | VWR | 48300-026 | |
| 电动计时器 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor细胞培养皿 | 门策尔，费舍尔参考文献 | 3406816 | 直径25 mm，圆形 |
| MgSO₄·7H₂O2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H₂O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| 葡萄糖 | 默克 | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| 营养肉汤（NB） | 默克 | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | 默克 | 110283 | |
| 96孔板 | 赛默飞世尔科技 | 243656 | |
| 蔡司 LSM 780，Axio Observer Z1 | 卡尔蔡司显微镜有限公司 | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | 卡尔蔡司显微镜有限公司 | n/a | |
| ZEN 2 和 ZEN lite 2012（软件） | 卡尔蔡司显微镜有限公司 | n/a | |
| SigmaPlot，版本 13.0（统计软件） | Systat GmbH，德国厄克斯拉特 | n/a | |
| Attofluor 细胞培养皿 | Invitrogen | A7816 | |
| µ-35 mm高底网格-500玻璃底培养皿 | ibidi | 81168 |
参考文献
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