本方案阐述了评估监测活力参数和DNA修复过程在利用低气压等离子体处理后复苏Bacillus subtilis芽孢中的相关性所需的重要连续步骤，通过时间分辨共聚焦显微镜和扫描电子显微镜追踪荧光标记的DNA修复蛋白来实现。
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本文内容
摘要
摘要
等离子体灭菌是工业、临床及航天领域中传统灭菌方法的一种有前景的替代方案。低压等离子体（LPP）放电含有多种活性物质，可导致微生物迅速失活。为了研究LPP灭菌的效率及其作用机制，我们采用模式生物Bacillus subtilis的芽孢，因其对传统灭菌方法具有极强的抗性。本文描述了B. subtilis芽孢单层的制备、在双电感耦合等离子体反应器中利用低压等离子体进行灭菌的过程、通过扫描电子显微镜（SEM）对芽孢形态进行表征，以及通过活细胞显微镜分析芽孢的萌发与生长过程。等离子体活性物质的主要靶标是基因组物质（DNA），而在芽孢复苏过程中修复等离子体诱导的DNA损伤对生物体的存活至关重要。在此，我们通过时间分辨共聚焦荧光显微镜追踪荧光标记的DNA修复蛋白（RecA），研究经LPP处理后芽孢的萌发能力以及DNA修复在芽孢萌发和生长过程中的作用。将经处理与未经处理的芽孢单层激活以启动萌发，并利用倒置共聚焦活细胞显微镜随时间观察单个芽孢的反应。我们的观察结果显示，能够萌发并生长的芽孢比例依赖于LPP处理时间，在处理120秒后达到最低值。RecA-YFP（黄色荧光蛋白）荧光仅在少数芽孢中被检测到，且在所有生长中的细胞中均有表达，经LPP处理的芽孢中荧光略有增强。此外，部分源自LPP处理芽孢的营养态细菌表现出胞质增加，并倾向于发生裂解。本文所述的单个芽孢分析方法可为研究芽孢萌发与生长的其他方面提供范例。
引言
太空探索的主要目标之一是在太阳系的其他行星和卫星上寻找生命形式和生物分子的迹象。将地球来源的微生物或生物分子转移到关键探索区域，可能对火星和木卫二等天体上的生命探测任务的进展和完整性构成重大风险1。由空间研究委员会（COSPAR）于1967年制定的行星保护国际准则，对载人和无人航天器前往其他行星、卫星、小行星及其他天体的任务施加了严格规定，要求在发射前对航天器及关键硬件组件进行清洁和灭菌，以消除地球微生物污染，并防止天体之间的交叉污染2。在过去十年中，非热等离子体的应用在生物医学、营养学研究以及航天任务中获得了广泛关注3,4,5。等离子体灭菌作为一种有前景的替代传统灭菌方法的技术，具有快速高效的微生物灭活能力6，同时对敏感和热不稳定的材料较为温和。等离子体放电包含多种活性物质，如自由基、带电粒子、中性/激发态原子，以及紫外（UV）和真空紫外（VUV）波段的光子，这些成分共同导致微生物的快速失活3。在本研究中，我们采用由双感应耦合低气压等离子体（DICP）源产生的低气压等离子体7,
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方案
1. Bacillus subtilis 芽孢的制备与纯化
- 用于产孢，取相应菌株的5 mL过夜培养物进行转移 B. subtilis 菌株，加入适当的抗生素，接种于200 mL双倍浓度的液体Schaeffer孢子形成培养基（每升含16 g营养肉汤、2 g KCl、0.5 g MgSO₄）4*7 H2O，2 mL 1 M Ca(NO3)2，2 mL 0.1 M MnCl2 *• 4 H2O, 2 mL 1 mM FeSO4，2 mL 50% (w/v) 葡萄糖18）并在充分通气条件下培养 37 °C 72 小时或直至 > 95% 的培养物已完成孢子形成。以下菌株的孢子用于实验： B. subtilis PY79（野生型） B. subtilis PY79ΔrecA::neo（缺乏DNA修复蛋白RecA） B. subtilis PY79 recA-yfp::cat（RecA 与黄色荧光蛋白 [YFP] 融合）19).
- 通过在50 mL离心管中以3,000 x g离心15分钟收集孢子，并使用无菌蒸馏H₂O通过重复洗涤步骤（....
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结果
经等离子体处理的B. subtilis芽孢存活率
本研究中使用的 B. subtilis 芽孢经等离子体处理后，其存活率随处理时间延长而降低（图2）。表达与YFP融合的recA基因菌株的芽孢，其存活曲线与野生型菌株相似，表明该遗传修饰对细菌活力无显著影响。RecA缺陷型菌株的芽孢对等离子体处理的敏感性高于野生型菌株，表明RecA基因的存在可减轻等离子体诱导的活力丧失。特别是15秒（P <0.003）和30秒（P <0.004）的短时间等离子体处理，导致RecA缺陷型菌株的活力较野生型和RecA-YFP菌株显著下降。经过90秒等离子体处理后，所有菌株的活力均下降约三个数量级。
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讨论
使用低温低压等离子体对表面进行灭菌是替代传统灭菌方法（如电离辐射、化学试剂处理）的一种有前景的方案例如 像 H 这样的气体2O2 或环氧乙烷）或干热与湿热23普通灭菌方法大多可实现有效灭菌，但已知会影响被处理材料，并对操作人员构成潜在风险。低压等离子体利用多种组分（如紫外光子、自由电子、离子以及激发态原子或分子）的协同作用，实现快速且均匀的生物失活。例如 ROS）。因此，LPP 可应用于对热和腐蚀敏感的材料，例如用于植入物的热塑性聚合物、电子仪器或复杂的三维结构。在本文中，我们展示了该测试系统的应用，其中采用喷雾形成的单层 B. subtilis 孢子20 在最近已详细描述的特定低压等离子体反应器中进行处理7显微镜明场观察等离子体处理后的孢子可能足以对灭菌效率进行总体评估。然而，我们的研究兴趣在于揭示低压等离子体作用的内在机制，以及其在分子水平上对孢子失活的影响。结合荧光示踪显微技术，该方法能够使我.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢Andrea Schröder在本研究部分工作中提供的出色技术协助，以及Nikea J. Ulrich在视频拍摄期间提供的帮助。 我们还要感谢Lyle A. Simmons慷慨提供了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株LAS72和LAS24。本研究部分得到了德国研究基金会（DFG）Paketantrag项目（PlasmaDecon PAK 728）对PA（AW 7/3-1）和RM（MO 2023/2-1）的资助，以及德国航空航天中心（DLR）DLR-FuW-Projekt ISS LIFE项目、RF-FuW计划、子项目475（资助编号：F.M.F、M.R.和R.M.）的资助。F.M.F.获得了德国科隆德国航空航天中心（DLR）亥姆霍兹空间生命科学研究学院（SpaceLife）提供的博士奖学金资助，该奖学金由亥姆霍兹协会（Helmholtz-Gemeinschaft）资助六年（资助编号VH-KO-300），并额外获得了来自DLR包括航空航天执行委员会和航空航天医学研究所的资金支持。本研究的结果将纳入Felix M. Fuchs的博士学位论文中。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 双组分喷嘴（型号 970-8） | Schlick | 14,404 | 230 V，50 Hz，D 4.484/8，0.8 mm 内径 |
| Luria Bertani 培养基 | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| 管路连接器 | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN 聚酰胺管 | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| 载玻片 | VWR | 48300-026 | |
| 电动计时器 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor细胞培养皿 | 门策尔，费舍尔参考文献 | 3406816 | 直径25 mm，圆形 |
| MgSO₄·7H₂O2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H₂O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| 葡萄糖 | 默克 | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| 营养肉汤（NB） | 默克 | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | 默克 | 110283 | |
| 96孔板 | 赛默飞世尔科技 | 243656 | |
| 蔡司 LSM 780，Axio Observer Z1 | 卡尔蔡司显微镜有限公司 | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | 卡尔蔡司显微镜有限公司 | n/a | |
| ZEN 2 和 ZEN lite 2012（软件） | 卡尔蔡司显微镜有限公司 | n/a | |
| SigmaPlot，版本 13.0（统计软件） | Systat GmbH，德国厄克斯拉特 | n/a | |
| Attofluor 细胞培养皿 | Invitrogen | A7816 | |
| µ-35 mm高底网格-500玻璃底培养皿 | ibidi | 81168 |
参考文献
- Nicholson, W. L., Schuerger, A. C., Race, M. S. Migrating microbes and planetary protection. Trends Microbiol. 17, 389-392 (2009).
- COSPAR. COSPAR Planetery Protection Policy. Space Research Today, COSPAR's Information Bulletin. 193, 1-14 (2015).
- De Geyter, N., Morent, R.
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重印与许可
