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方法文章

从小鼠雌性生殖道收集交配后精液并测定精液液化

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DOI：

10.3791/56670

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2017年11月18日

 , 
1School of Molecular Biosciences, Center for Reproductive Biology, College of Veterinary Medicine, Washington State University

本文内容

摘要

精液液化是精子从精液凝胶中释放出来的必要条件。本研究提供了从雌性生殖道在交配后收集精液以及测定精液液化时间的操作步骤。

摘要

在小鼠中，射出的精液会沉积于子宫内。射精后，精液会从凝胶状逐渐转变为水样状态，这一过程称为液化。本研究展示了如何从小鼠模型的雌性生殖道中收集射精后的精液。首先，将处于动情期的成年雌性小鼠与雄性小鼠同笼过夜。次日早晨，通过观察阴道口是否存在交配栓来确认交配是否成功。对具有交配栓的雌性小鼠实施安乐死，并完整取出整个生殖道（包括阴道、子宫、输卵管和卵巢），确保形成一个封闭系统以防止精液泄漏。将取出的生殖道置于1.5 mL微量离心管中，剪除阴道部分以释放管内的精液。为了最大限度地回收精液用于分析，使用无齿镊子从卵巢端向阴道端轻轻挤压子宫角，以排出残留的精液。随后丢弃整个生殖道。将含有精液的离心管短暂离心。将一支25 μL毛细吸管以180°角（与管壁平行）插入管中，记录毛细管液面上升至25 μL刻度线所需的时间。来自已知生育力雄鼠的精液通常需要约60–180秒填满25 μL毛细管。该精液采集技术还可用于其他后续实验，如精子成像和运动能力分析。

引言

女性生殖道由上生殖道和下生殖道组成。上生殖道包括输卵管、子宫和子宫颈管内侧部。下生殖道包括子宫颈管外侧部和阴道。在人类中，射出的精液沉积于阴道前壁，紧邻子宫颈管外侧部1。然而在小鼠中，精液在交配后数分钟内即被运送至子宫2。

精液含有精液凝胶，射精后数秒内即凝固，导致精子被包裹并失去活动能力3。液化过程通过将精液从凝胶状转变为水样状态，释放被固定的精子。这一过程对精子运动能力及哺乳动物的繁殖至关重要。目前对精液液化的认识主要基于体外（in vitro）研究，即在培养皿中观察精液的液化现象。在人类中，前列腺特异性抗原（PSA，也称为激肽释放酶相关肽酶3或KLK3）的酶活性通过水解精液凝胶蛋白（精液中存在的凝胶形成蛋白）在液化过程中起主要作用4,5,6。精液凝胶蛋白的降解使精子从精液凝块中释放出来，从而提高精子的活动能力。游离的精子向输卵管游动以完成卵子受精。液化（或精液黏度）检测是生育诊所进行精液分析时评估男性生育力的标准初筛项目之一7。

最近发表的一篇文章表明，通过分析雌性小鼠交配后从其生殖道收集的精液，可以揭示精液液化缺陷，而这种缺陷可能继而导致生育能力下降8。精液黏稠度过高等液化异常在男性不育病例中占11.8%-32.3%9，提示正常的精液液化对哺乳动物繁殖至关重要。然而，目前对液化障碍的研究和治疗仅集中于雄性个体7。雌性生殖道是否在精液液化过程中发挥作用，这一可能性尚未被探索。因此，精液采集及液化时间测定的方法将为研究人员提供一种新的诊断工具，用于判断液化障碍是否可能是所研究模式生物不育的原因之一。

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方案

本研究中使用的所有动物和实验操作均按照华盛顿州立大学（WSU）动物护理与使用委员会的指南进行，并符合WSU批准的动物实验方案#4702和#4735的要求。

1. 小鼠

  1. 使用标准的C57BL/6J成年雄性小鼠或其他感兴趣的品系。将动物饲养在温度和湿度受控的环境中， 随意摄取 水和食物的获取。
    1. 使用8周龄至10月龄的雄性种鼠，实验中仅使用经证实具有繁殖能力的种鼠。
  2. 使用成年雌性小鼠，其生殖道雌激素受体α（由Esr1基因编码）具有组织特异性敲除 Esr1 上皮细胞中的基因10 (Wnt7aCre/+;Esr1f/f，称为基因敲除或 "敲除"）以及对照组同窝幼崽（Esr1f/f，称为 "CTRL"在此研究中。
    1. 使用8周龄的雌性小鼠。雌性小鼠的年龄根据具体实验需求有所不同。
  3. 在上午08:00确定动情周期的阶段。仅使用处于动情期（estrus）阶段的雌性动物。有关阴道涂片和细胞学分析的详细方法，请参考已发表的实验流程。11.

2. 交配及交配栓的评估

  1. 在发情日（16:00），将雌性小鼠放入雄性小鼠的笼子中。
  2. 次日早晨（08:00），将雌性小鼠与雄性小鼠分隔开。
  3. 采用一种已发表方法的改良法12，通过检查阴道或交配栓的存在与否来判断是否发生交配。
  4. 抓住雌性小鼠尾根部，短暂抬起其后肢。
  5. 使用牙签观察阴道口处是否存在乳白色精液凝块，以确定交配栓的位置。如果存在交配栓，牙签将无法插入阴道腔内。

3. 组织采集前的准备

  1. 在15 mL离心管中配制10 mL含1%胎牛血清的Leibovitz L-15培养基（称为L15培养基 + 1% FBS）。将培养基置于水浴中，37 °C孵育15分钟。
  2. 为保持组织和精子在后续应用中的活性，将预热的L15培养基 + 1% FBS 2 mL分装至2 mL微量离心管中，用于组织收集。
  3. 将体视显微镜载物台预热至37 °C。将加热块设定为37 °C，并将一个空的1.5 mL微量离心管放入加热块中。
  4. 若后续应用需要进行精子活力成像，需将玻片预热至37 °C。

4. 组织采集

  1. 将预热的 L15 培养基 + 1% FBS 分装液带至组织采集区域。
  2. 使用二氧化碳窒息法处死雌性小鼠（约 08:30），随后进行颈椎脱臼。
    注意：假设交配发生在午夜，则此操作约在交配后 8 小时进行。
  3. 将动物置于仰卧位，暴露腹部区域。
  4. 在靠近后肢的腹部区域喷洒 70% 酒精。
  5. 使用解剖剪在下腹部皮肤上剪开一个小口（约 1 cm）。
  6. 用惯用手拉住尾巴（必要时连同后肢），非惯用手将皮肤向相反方向（朝向头部）拉开，以暴露腹肌。该方法用于尽量减少毛发对内脏器官的污染。
  7. 在腹部基部、靠近阴道处，以 V 形剪开腹肌，暴露内脏器官。
  8. 将肠道和腹部脂肪移至一侧，暴露生殖道。
  9. 修剪掉阴道区域上方的膀胱及其他组织。
  10. 剪开耻骨联合，以暴露阴道组织。
  11. 在阴道开口处提起阴道组织，并用剪刀将阴道管与直肠组织分离。
  12. 使用弹簧剪小心地从子宫两侧修剪掉系膜脂肪。
    注意：子宫内含有精液，非常脆弱。操作时需避免刺破子宫，否则会导致精液丢失。
  13. 提起下部生殖道，并从两侧剪除卵巢脂肪垫。
  14. 将整个生殖道转移至含有预热的 Leibovitz's L-15 培养基 + 1% FBS 的离心管中。

5. 子宫内容物采集精液液化（黏度）的测定

  1. 在体视显微镜的加热台上，将组织转移至含有 3.5 mL 预热的 L-15 培养基（含 1% FBS）的 35 mm 无菌组织培养皿中，以清除组织上的血液及其他污染物。
    注意：清洗过程中应夹取脂肪组织，避免接触子宫。此时，精液应仍完整存在于子宫内。
  2. 用实验室擦拭纸吸去组织表面多余的培养基。
  3. 手持组织的阴道端，将卵巢端置入预热的微量离心管中。在固定阴道端的同时，于子宫基部切断子宫角，使子宫角落入微量离心管内。
  4. 让精液从子宫角自然流出至管中。使用无齿镊子从卵巢端向阴道端轻轻挤压子宫角，排出残留的精液。
  5. 将废弃组织放入生物危害袋中并进行焚烧处理。
  6. 将含有精液的离心管在小型离心机中短暂离心（约 1–2 秒）。
  7. 将离心管平放于加热台上——精液不会溢出。
  8. 准备好计时器，并设置为“计时”模式。
  9. 将一支 25 µL 毛细管以 180° 角度（与管壁平行）插入精液样本中。此操作旨在减少不同操作者因持毛细管角度不同而引入的实验变异。
  10. 一旦毛细管接触精液，立即启动计时器。
  11. 记录精液上升至 25 µL 刻度线所需的时间（秒）。
  12. 测量完成后，立即将含有精液的离心管放回干式加热块中，用于后续功能分析，例如精子运动能力的视频成像。
  13. 将接触过精液的毛细管浸入 10% 次氯酸钠溶液中消毒 20 分钟，随后将毛细管丢弃至锐器盒中。

6. 精子运动的视频成像

  1. 打开显微镜和视频成像软件。
  2. 将剩余精液20 µL移液至预热的载玻片上，同时将载玻片置于加热台上。
  3. 加盖玻璃盖玻片。
  4. 将载玻片有盖玻片的一面朝下放置在显微镜载物台上。
  5. 使用20倍物镜找到目标观察区域。
  6. 切换至100倍物镜进行视频成像。
  7. 以每秒12帧（fps）的速度记录30秒的视频。
  8. 每只动物至少在3个不同区域随机记录视频。
  9. 快速完成成像操作，并尽量减少载玻片的光照暴露，以保持精子的运动能力和活性。
    注意：该成像操作应在2–3分钟内完成。
  10. 使用ImageJ软件进行数据分析，方法如前所述8。

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结果

在与具有生育能力的对照组（CTRL）雄性小鼠交配后约8小时，从对照组和敲除组（KO）雌性小鼠中收集精液。精液液化（或精液黏度）通过填充25 μL毛细管所需的时间进行量化。从对照组子宫收集的精液填充毛细管所需时间为2.06 ± 0.12 分钟（均值±标准误，n = 5）（图1）。然而，从敲除组子宫收集的精液在实验时间内超过60分钟仍未完成填充（60.0 ± 0.0，均值±标准误，n = 5）。这些数据表明，与敲除组子宫相比，对照组子宫中的精液液化程度显著更高，或黏度显著更低。

为了说明从雌性生殖道收集精液的下游应用之一，采用视频成像法评估了精子活力。从对照组（CTRL）子宫收集的精液在显微镜视野中显示出自由游动的精子，如图2A的快照所示。从基因敲除组（KO）子宫收集的精液显示大多数精子聚集在一起，活动能力极低（图2B）。这些结果表明，交配后8小时从雌性生殖道收集的精液可用...

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讨论

从小鼠子宫收集精液相较于精液分析具有优势 体外 因为前者可以揭示精液与女性生殖道分泌物之间的生理相互作用. 本研究所介绍的技术可使研究人员在理想的生理条件下评估精液质量以及精子的活力和运动能力。此外，还可对从子宫收集的精液进行多种后续分析；例如，可通过计数确定进入子宫的实际精子数量，并可通过成像进行精子运动能力检测。为评估受精能力，最佳的精液采集时间应为交配后1至2小时内。1.

除了上述已提及的下游应用外，研究人员还可以评估感兴趣的抑制剂或化合物对精子运输过程的影响，例如精液液化（或精液黏度）、生殖道内的精子数量、精子活力，或精子向雌性生殖道不同区域的迁移。这些化合物可在交配前施用于雌性生殖道内8然后，可以从交配后的精液样本中评估这些抑制剂/化合物的影响. 这些方法可用于测试抑制精子运输的避孕药物的实用性。

在精液采集及液化/黏度测量过程中，需要考虑的关键因素包括精子的敏感性以及...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由华盛顿州立大学兽医学院（WSU）启动资金资助，资助对象为 WW。作者感谢华盛顿州立大学（WSU）Sierra Olsen 对本文稿的审阅。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
牙签Diamond750-Flat经高压灭菌的无菌牙签，使用钝头牙签。请勿使用尖头牙签
解剖剪刀Fisher08-940
弹簧剪刀RobozRS-5600
精细镊子RobozRS-5045
25-μL 玻璃毛细管VWR53432-761
Leibovitz’s L-15 培养基Life Technologies11415064添加 1% FBS
胎牛血清（FBS）Gemini Bio-Products100-106
1.5-mL 微量离心管AxygenMCT-150-C
2-mL 微量离心管AxygenMCT-200-A
数字干式恒温仪VWR13259-052用于精液采集前预热微量离心管
迷你离心机CorningLSE 6765
35-mm 培养皿VWR10861-656
15-mL 聚丙烯离心管VWR10025-686
水浴锅PrecisionTSGP05
加热载物台体视显微镜Leica MicrosystemsMZ10F用于精液采集前保持组织温度
明场显微镜Leica MicrosystemsDMi8可选。用于精子运动的视频成像
相机Leica MicrosystemsDMC2900可选。用于精子运动的视频成像
载玻片Fisher12-552-3可选。用于精子运动的视频成像
盖玻片VWR48393-059可选。用于精子运动的视频成像
漂白剂用 dH2O 稀释至 10% 浓度

参考文献

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