从小鼠雌性生殖道收集交配后精液并测定精液液化

摘要

精液液化是精子从精液凝胶中释放出来的必要条件。本研究提供了从雌性生殖道在交配后收集精液以及测定精液液化时间的操作步骤。

摘要

在小鼠中，射出的精液会沉积于子宫内。射精后，精液会从凝胶状逐渐转变为水样状态，这一过程称为液化。本研究展示了如何从小鼠模型的雌性生殖道中收集射精后的精液。首先，将处于动情期的成年雌性小鼠与雄性小鼠同笼过夜。次日早晨，通过观察阴道口是否存在交配栓来确认交配是否成功。对具有交配栓的雌性小鼠实施安乐死，并完整取出整个生殖道（包括阴道、子宫、输卵管和卵巢），确保形成一个封闭系统以防止精液泄漏。将取出的生殖道置于1.5 mL微量离心管中，剪除阴道部分以释放管内的精液。为了最大限度地回收精液用于分析，使用无齿镊子从卵巢端向阴道端轻轻挤压子宫角，以排出残留的精液。随后丢弃整个生殖道。将含有精液的离心管短暂离心。将一支25 μL毛细吸管以180°角（与管壁平行）插入管中，记录毛细管液面上升至25 μL刻度线所需的时间。来自已知生育力雄鼠的精液通常需要约60–180秒填满25 μL毛细管。该精液采集技术还可用于其他后续实验，如精子成像和运动能力分析。

引言

女性生殖道由上生殖道和下生殖道组成。上生殖道包括输卵管、子宫和子宫颈管内侧部。下生殖道包括子宫颈管外侧部和阴道。在人类中，射出的精液沉积于阴道前壁，紧邻子宫颈管外侧部¹。然而在小鼠中，精液在交配后数分钟内即被运送至子宫²。

精液含有精液凝胶，射精后数秒内即凝固，导致精子被包裹并失去活动能力³。液化过程通过将精液从凝胶状转变为水样状态，释放被固定的精子。这一过程对精子运动能力及哺乳动物的繁殖至关重要。目前对精液液化的认识主要基于体外（in vitro）研究，即在培养皿中观察精液的液化现象。在人类中，前列腺特异性抗原（PSA，也称为激肽释放酶相关肽酶3或KLK3）的酶活性通过水解精液凝胶蛋白（精液中存在的凝胶形成蛋白）在液化过程中起主要作用^4,5,6。精液凝胶蛋白的降解使精子从精液凝块中释放出来，从而提高精子的活动能力。游离的精子向输卵管游动以完成卵子受精。液化（或精液黏度）检测是生育诊所进行精液分析时评估男性生育力的标准初筛项目之一⁷。

方案

本研究中使用的所有动物和实验操作均按照华盛顿州立大学（WSU）动物护理与使用委员会的指南进行，并符合WSU批准的动物实验方案#4702和#4735的要求。

1. 小鼠

1. 使用标准的C57BL/6J成年雄性小鼠或其他感兴趣的品系。将动物饲养在温度和湿度受控的环境中， 随意摄取 水和食物的获取。
   1. 使用8周龄至10月龄的雄性种鼠，实验中仅使用经证实具有繁殖能力的种鼠。
2. 使用成年雌性小鼠，其生殖道雌激素受体α（由Esr1基因编码）具有组织特异性敲除 Esr1 上皮细胞中的基因¹⁰ (Wnt7a^Cre/+;Esr1^f/f，称为基因敲除或 "敲除"）以及对照组同窝幼崽（Esr1^f/f，称为 "CTRL"在此研究中。
   1. 使用8周龄的雌性小鼠。雌性小鼠的年龄根据具体实验需求有所不同。
3. 在上午08:00确定动情周期的阶段。仅使用处于动情期（estrus）阶段的雌性动物。有关阴道涂片和细胞学分析的详细方法，请参考已发表的实验流程。

结果

在与具有生育能力的对照组（CTRL）雄性小鼠交配后约8小时，从对照组和敲除组（KO）雌性小鼠中收集精液。精液液化（或精液黏度）通过填充25 μL毛细管所需的时间进行量化。从对照组子宫收集的精液填充毛细管所需时间为2.06 ± 0.12 分钟（均值±标准误，n = 5）（图1）。然而，从敲除组子宫收集的精液在实验时间内超过60分钟仍未完成填充（60.0 ± 0.0，均值±标准误，n = 5）。这些数据表明，与敲除组子宫相比，对照组子宫中的精液液化程度显著更高，或黏度显著更低。

为了说明从雌性生殖道收集精液的下游应用之一，采用视频成像法评估了精子活力。从对照组（CTRL）子宫收集的精液在显微镜视野中显示出自由游动的精子，如图2A的快照所示。从基因敲除组（KO）子宫收集的精液显示大多数精子聚集在一起，活动能力极低（图2B）。这些结果表明，交配后8小时从雌性生殖道收集的精液可用.......

讨论

从小鼠子宫收集精液相较于精液分析具有优势 体外 因为前者可以揭示精液与女性生殖道分泌物之间的生理相互作用. 本研究所介绍的技术可使研究人员在理想的生理条件下评估精液质量以及精子的活力和运动能力。此外，还可对从子宫收集的精液进行多种后续分析；例如，可通过计数确定进入子宫的实际精子数量，并可通过成像进行精子运动能力检测。为评估受精能力，最佳的精液采集时间应为交配后1至2小时内。¹.

除了上述已提及的下游应用外，研究人员还可以评估感兴趣的抑制剂或化合物对精子运输过程的影响，例如精液液化（或精液黏度）、生殖道内的精子数量、精子活力，或精子向雌性生殖道不同区域的迁移。这些化合物可在交配前施用于雌性生殖道内⁸然后，可以从交配后的精液样本中评估这些抑制剂/化合物的影响. 这些方法可用于测试抑制精子运输的避孕药物的实用性。

在精液采集及液化/黏度测量过程中，需要考虑的关键因素包括精子的敏感性以及.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牙签	Diamond	750-Flat	经高压灭菌的无菌牙签，使用钝头牙签。请勿使用尖头牙签
解剖剪刀	Fisher	08-940
弹簧剪刀	Roboz	RS-5600
精细镊子	Roboz	RS-5045
25-μL 玻璃毛细管	VWR	53432-761
Leibovitz’s L-15 培养基	Life Technologies	11415064	添加 1% FBS
胎牛血清（FBS）	Gemini Bio-Products	100-106
1.5-mL 微量离心管	Axygen	MCT-150-C
2-mL 微量离心管	Axygen	MCT-200-A
数字干式恒温仪	VWR	13259-052	用于精液采集前预热微量离心管
迷你离心机	Corning	LSE 6765
35-mm 培养皿	VWR	10861-656
15-mL 聚丙烯离心管	VWR	10025-686
水浴锅	Precision	TSGP05
加热载物台体视显微镜	Leica Microsystems	MZ10F	用于精液采集前保持组织温度
明场显微镜	Leica Microsystems	DMi8	可选。用于精子运动的视频成像
相机	Leica Microsystems	DMC2900	可选。用于精子运动的视频成像
载玻片	Fisher	12-552-3	可选。用于精子运动的视频成像
盖玻片	VWR	48393-059	可选。用于精子运动的视频成像
漂白剂			用 dH2O 稀释至 10% 浓度