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方法文章

通过诱导小鼠大脑皮层中的 Cre-lox 重组 子宫内 电穿孔

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DOI：

10.3791/56675

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2017年11月17日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, James Madison University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

通过在稀疏分布的细胞群体中诱导基因的缺失或获得功能，可研究基因在脑内的细胞自主性功能。本文描述 在体 电穿孔法递送 Cre 重组酶至具有 floxed 基因的稀疏发育期皮层神经元以实现基因功能缺失 在体内.

摘要

通过在少量且稀疏分布的神经元中诱导某个基因的功能缺失或功能获得，可以揭示该基因在神经元中的细胞自主性功能。实现这一目标需要构建一种嵌合组织，其中发生基因功能缺失或获得的神经元被遗传学上未受干扰的组织所包围。本文中，我们将Cre-lox重组系统与子宫内电穿孔技术相结合，以生成可用于研究基因在神经元中细胞自主性功能的嵌合脑组织。利用子宫内电穿孔技术，将编码荧光标记蛋白和Cre重组酶的DNA质粒（可通过资源库获取）导入发育中的小鼠胚胎脑内皮层神经元，这些神经元的特定基因两侧含有loxP位点。此外，我们还描述了若干对子宫内电穿孔方法的改进，以提高动物存活率和实验可重复性。该方法还包括确定Cre介导的重组在稀疏或密集神经元群体中的滴定效应。对标记脑组织进行组织学切片时，无需（但可适配）免疫组织化学染色。所使用的质粒可确保荧光标记的神经元均表达Cre重组酶。通过共聚焦显微镜观察树突和轴突分支以及树突棘，组织学切片可用于神经元形态学分析。由于功能缺失或获得发生在稀疏的嵌合组织中，该方法可在体内研究基因产物在细胞水平上的必要性和充分性。 在子宫内 电穿孔以生成可用于研究神经元中基因细胞自主功能的嵌合脑组织。通过电穿孔将编码荧光标记和Cre重组酶的DNA构建体（可通过资源库获取）导入含有两侧带有loxP位点基因的发育中皮层神经元，这些神经元位于小鼠胚胎脑内 在体 电穿孔。此外，我们描述了对电穿孔方法的多种改进 在子宫内 提高存活率和可重复性的电穿孔方法。该方法还包括在稀疏或密集的神经元群体中建立Cre介导重组的滴定度。标记脑组织的组织学制备无需免疫组织化学（但可适配免疫组织化学）。所用载体可确保荧光标记的神经元携带Cre重组酶基因。组织学制备可通过共聚焦成像对树突和轴突分支以及树突棘进行神经元形态学分析。由于功能缺失或功能获得是在稀疏的嵌合组织中实现的，该方法可用于研究基因产物的细胞自主性必要性和充分性。 在体内.

引言

构建遗传嵌合体是研究目的基因功能的经典实验范式。要确定某个基因是否对特定细胞表型是必需的，最简单的方法是在整个生物体中造成该基因的功能丧失（例如基因敲除）。然而，若要确定某个基因是否仅在特定细胞类型中发挥作用，则在整个生物体中进行基因敲除并非有效策略。相反，需要一种能够在特定细胞中导致基因功能丧失，而该细胞周围仍被野生型（即遗传未受干扰）组织所包围的方法——换句话说，就是创建嵌合组织。如果突变细胞表现出突变表型，而周围的野生型细胞则无此表型，则表明该基因以细胞自主性方式发挥作用。通过分析突变细胞被野生型组织包围的嵌合组织，可理想地揭示基因的细胞自主性功能，尤其适用于神经元和胶质细胞构成庞大互连网络的脑组织研究。

多种形式的嵌合脑组织为研究基因的细胞自主功能提供了强有力的模型。聚焦于神经元移植1、女性X连锁嵌合现象2,3,4以及内源性体细胞嵌合现象5,6的研究均基于嵌合脑组织得出结论。通过Cre-lox重组系统实现基因的条件性删除是一种充分利用了大量可用转基因小鼠品系的方法。在该方法中，将两个loxP位点引入目的基因序列（如外显子）的两侧，使该序列被同向排列的loxP位点所包围（即“floxed”）。Cre重组酶可切除两个loxP位点之间的序列7。可通过将floxed小鼠与另一表达Cre重组酶及荧光标记物的小鼠品系（“Cre报告品系”）杂交，实现Cre介导的重组。该方法已通过多种方式被用于揭示特定细胞亚群（如兴奋性神经元或星形胶质细胞）中基因的功能8。Cre报告品系可表达CreERT2，从而使Cre介导的重组具有药物诱导性（即通过可诱导Cre介导的基因敲除实现单神经元标记，SLICK）9。另一种称为双标记嵌合分析（MADM）的策略10,11，利用Cre介导的染色体间重组，可在杂合组织中同时产生纯合突变细胞。在这些方法中，每次测试新的候选基因或细胞亚型时都需要构建新的小鼠品系。或者，Cre重组酶也可在出生后通过离子电渗法12或病毒载体（例如携带细胞亚型特异性启动子的腺相关病毒13或慢病毒14）导入。该策略可实现强烈且出生后的标记。为了在产前稀疏地靶向发育中的大脑皮层神经元，理想的策略是将Cre重组酶与荧光标记物共同进行子宫内电穿孔（in utero electroporation）。

除了通过 Cre-lox 重组系统结合 在体 电穿孔以产生嵌合组织 在体内，我们引入了对其他已发表方案中若干步骤的改进15,16,17,18,19,20,21我们提供了提高定时妊娠雌鼠繁育成功率的相关信息。同时，我们概述了在皮层组织中实现稀疏且明亮神经元标记的两种策略：其中一种策略是通过滴定编码Cre重组酶和荧光标记物的单一载体的用量22另一种策略是使用 "超新星" 系统，专为考虑这些参数而设计23,24此外，我们还提供了制备稳定微注射移液管的改进方法以及对相关步骤的简化 在子宫内 电穿孔手术。最后，我们概述了一种简化的组织学制备方法中的关键步骤，该方法无需额外染色或免疫组织化学，即可用于分析树突棘以及树突和轴突的分支结构。

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方案

本文所述方法已获得詹姆斯·麦迪逊大学动物护理与使用委员会（ACUC）的批准，并符合所有相关的法规和机构指南。

1. 小鼠准备

  1. 饲养年轻的（>P60 雄性和雌性纯合 floxed 小鼠交配以建立繁殖对25.
    注意：一个良好的阴性对照是设置一组额外的野生型小鼠繁育对，其中Cre重组酶的表达不会引起嵌合现象26.
  2. 让雌鼠与雄鼠交配并产下第一窝幼崽，期间将雄鼠与雌鼠共同饲养以提高幼崽存活率。断奶后， 例如 在出生后第21天（P21），将雌性和雄性分开。
  3. 小鼠繁育
    1. 设置雌性和雄性小鼠的定时交配25. 利用视觉提示确定雌性动物的动情周期27，并在交配后的第二天早晨检查阴道栓25.
    2. 若发现阴栓，将雌鼠分离并称重，记为胚胎第（E）0.5天。
    3. 每3-5天继续称量雌鼠体重，以判断其是否怀孕。怀孕雌鼠在受孕后7-10天（E0）体重将增加10-20%。
      注意：此步骤比目视检查更早且更可靠地确认妊娠状态25.
    4. 如果雌鼠未怀孕，重复步骤 1.3.1–1.3.3。
  4. 一旦确认怀孕，选择手术日期 在体 电穿孔。为了靶向II/III层皮层锥体神经元前体细胞，应在E15.5时期进行电穿孔。

2. DNA 准备

  1. 选择一种编码 Cre 重组酶以及荧光标记物（例如绿色荧光蛋白，GFP）的单一 DNA 构建体28,29。或者，使用先前文献中详细描述的“Supernova”系统23,24。参见材料列表以获取示例构建体。
  2. 使用标准微生物学技术在大肠杆菌（E. coli）中扩增步骤 2.1 中的 DNA 构建体30。
  3. 按照制造商说明书，使用无内毒素质粒纯化试剂盒纯化 DNA 构建体。使用无内毒素水洗脱构建体。
    注意：选择无内毒素纯化试剂盒而非标准纯化试剂盒至关重要。
  4. 根据所需的标记密度，将 DNA 洗脱液浓缩至 1–3 mg/mL26。
    注意：使用新的 DNA 构建体时，必须始终建立滴度，因为不同构建体的长度和启动子各不相同。建议以多种不同浓度和/或用量注射构建体以评估表达情况。例如，注射 1 µL 或 1.5 µL 的 2.0 mg/mL GFP.Cre 可分别实现视觉皮层第 II/III 层锥体神经元的稀疏（1 µL）或密集（1.5 µL）标记26。
  5. 将 0.4% 台盼蓝溶于 1× 磷酸盐缓冲液（PBS；137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，溶于 H2O，用 HCl 调至 pH 7.4）中，按 1:10 体积比加入浓缩的 DNA 溶液中。
  6. 将 10× PBS 按 1:10 体积比加入浓缩的 DNA 溶液中。
  7. 将浓缩的 DNA 溶液储存于 4 °C。该溶液可长期保存。

3. 移液管设置

  1. 使用玻璃毛细管拉制仪，拉制一支具有极长（10–15 mm）锥部和极细尖端的移液管，其特征类似于用于胚胎干细胞注射或核移植的移液管31.
    注意：为防止碎屑污染移液管，应在手术前2天内制备。
    1. 按照制造商的说明，通过执行斜率测试来校准玻璃毛细管拉制仪。根据所得的加热值，设置拉制程序参数如下：heat =（斜率测试值 + 15），pull = 30，vel = 120，time = 100，pressure = 200。插入玻璃毛细管，将其固定在拉制仪的夹具上，启动预设的拉制程序，在玻璃毛细管上形成锥形。
    2. 使用复式光学显微镜确保拉制长度在10-15 mm之间例如 10倍物镜31.
  2. 将移液管折断，形成粗糙边缘的尖端，直径为20-25 µ微米直径。
    1. 将单层实验擦拭纸（见材料列表）置于50 mL烧杯上方并用一只手将其拉紧。另一只手握住移液器（尖端朝下），垂直且完全地穿过擦拭纸中心，使移液器尖端整齐断裂31.
      注意：将移液枪头完全穿过擦拭垫会产生 20–25 µ直径为 m 的尖端，成功率约为 70%。
    2. 在复式光学显微镜下确认（例如 20倍物镜）
      注意：敲击玻璃时需佩戴护目镜。
  3. 用移液器吸取1 µ将0.4%台盼蓝的1x PBS溶液吸入部分填充的移液管中，然后用1 µ基于身高的 L 标记 µ使用细尖耐酒精标记笔在移液管上标记 L。使用已校准的移液管在丢弃前对其他移液管进行校准。将移液管存放于移液管架中，避免灰尘及其他颗粒污染。

4. 在体 电穿孔

  1. 将格拉夫镊子、虹膜剪、哈特曼蚊式钳、无纺纱布海绵、环头镊和培养皿放置在不锈钢托盘上，并用铝箔包裹。将托盘和1 L 0.9%生理盐水（水中含0.9% wt/vol NaCl）放入高压灭菌器中，在121 °C和3.5 kPa条件下灭菌40分钟。灭菌后从高压灭菌器中取出，并置于已消毒的手术区域。
    注意：手术过程中必须保持无菌条件。
  2. 在手术前至少2小时，将已灭菌的1 L生理盐水瓶置于小型水浴中加热至38 °C。
  3. 将镊子型电极和脚踏开关连接至电穿孔仪（见材料清单）。根据制造商说明，设置电穿孔仪在脚踏开关触发时输出五个50 V、50 ms的脉冲，脉冲间隔为950 ms。对镊子型电极进行消毒后，放置于已消毒的手术区域。
  4. 按照先前发表的方法制作麻醉鼻罩32，但使用丁腈或乳胶手套指尖部分作为隔膜，紧密覆盖在鼻罩开口处。在隔膜上剪一个足够大的孔，以便套住小鼠的吻部。
  5. 在E15.5天，将怀孕小鼠置于充满异氟烷（2–4%）的诱导室中，以1 L/min的流速通入纯氧，进行深度麻醉。约1分钟后，检测翻正反射（轻轻倾斜诱导室，确认小鼠无法自行恢复体位）。称量小鼠体重，以确定后续手术中镇痛药物的给药剂量。
  6. 将小鼠转移至手术区域，通过鼻罩以1 L/min流速通入含1–2%异氟烷的纯氧，维持小鼠处于手术麻醉水平。使用镊子检测足底反射（轻捏脚掌，确认小鼠无回缩反应），以验证麻醉效果。监测呼吸频率和幅度，应表现为深而规律的呼吸（约70–100次/分钟），且黏膜呈粉红色并保持湿润。
  7. 在眼睛上涂抹足量的兽用眼膏，完全覆盖眼球，以防止术中干燥损伤。
  8. 弯曲装有过饱和盐溶液密封袋中的金属活化片（见材料清单），引发盐类的放热结晶反应。在密封袋上方铺两层单层擦拭布，将小鼠置于其上以维持体温。
  9. 用棉签将脱毛膏按摩涂抹于腹部区域，直至腹部毛发溶解（约20–40秒），然后擦去毛发。用70%乙醇和棉签仔细清除残留物及脱毛膏。 在腹部区域覆盖带窗无菌手术巾。
  10. 采用无菌技术，用格拉夫镊子提起皮肤并远离腹壁，使用虹膜剪在皮肤上做一条长约2 cm的腹中线切口，注意不要损伤下方肌肉。
    注意：使用手术刀进行切口是格拉夫镊子与虹膜剪的可接受替代方法，如先前文献所述17。
  11. 找到腹直肌的白线以辨识中线位置。用格拉夫镊子提起肌肉并远离腹腔，使用虹膜剪在此处再做一条长约2 cm的中线切口，暴露腹腔（子宫呈半透明状，胚胎可在其下可见）。确保不损伤下方的子宫和肠道组织。切口大小应仅足以舒适地拉出并暴露子宫（通常约2 cm）。
    注意：使用手术刀进行切口是格拉夫镊子与虹膜剪的可接受替代方法，如先前文献所述17。
  12. 使用无菌10 µL微量移液器吸头，将卡洛芬（溶于无菌0.9%生理盐水）以4 mg/kg剂量注入腹腔，用于镇痛。
  13. 在腹直肌切口左侧边缘夹持一把哈特曼蚊式钳，并将其放置在切口左侧倒置的培养皿上，以保持切口左侧开放。在切口右侧边缘夹持另一把哈特曼蚊式钳，并放置在切口右侧倒置的培养皿上，以保持切口右侧开放。在切口周围放置纱布海绵。
  14. 使用环头镊（不带限位螺钉），轻柔地夹住任意两个相邻胚胎之间的子宫组织，避免压伤或损伤任何组织。将所有胚胎逐一拉出切口，放置在纱布海绵上。拉出最后几个胚胎时，注意不要牵拉卵巢或宫颈。一旦暴露，必须使用温热生理盐水保持子宫湿润。子宫通常包含5至8个胚胎。
    注意：可在生理盐水中添加青霉素和链霉素17。
  15. 将校准过的移液器连接至吸液管组件（见材料清单），将步骤2中配制的DNA溶液精确注射1 µL，穿过子宫壁注入每个胚胎的侧脑室。侧脑室在胚胎端脑背侧表现为两个暗色区域（比周围端脑组织颜色更深）。在显微注射和电穿孔过程中，用拇指和食指操作胚胎，暴露侧脑室，并在注射时轻柔地将胚胎推向子宫壁。通过观察台盼蓝充满侧脑室来确认注射成功。
  16. 将镊子型电极的阴极（见材料清单）置于子宫上，正对内侧和尾侧皮层，以靶向视觉皮层（若靶向大脑其他区域，则需调整电极位置）16,26。将阳极置于胚胎头部稍下方和前方的子宫位置。
  17. 确认阳极和阴极已接触胚胎周围子宫的正确位置。使用脚踏开关，触发电极间输出五个50 V、50 ms的脉冲，脉冲间隔为950 ms。
    注意：注入的带负电荷DNA将向阴极移动，并被整合到最靠近阴极的室管膜区细胞中。
  18. 将子宫以原位方向放回腹腔。手动极其轻柔地引导子宫复位时，使用生理盐水润滑，注意不要使胚胎在子宫内发生移位。
  19. 使用可吸收缝线（见材料清单）以单纯间断缝合法关闭腹肌，打外科结固定。结扎末端时不要剪得过短，以免结松脱。
    注意：必须将腹肌缝合至伤口边缘完全闭合，但不得造成肌肉缺血变白。打结应牢固，防止松脱。
  20. 使用可吸收缝线关闭皮肤层（单纯间断缝合，外科结，同步骤4.19）。涂抹少量组织粘合剂封闭伤口。在缝线结上也涂抹组织粘合剂以防止松脱。使用移液器清除伤口周围可被吸出的多余组织粘合剂。
  21. 将异氟烷浓度降低至0.5–1.5%。待组织粘合剂干燥后（可用手套轻触测试），停止异氟烷麻醉，将雌鼠单独置于温暖的笼中恢复。使用1 mL注射器配合26G、½"针头，腹腔注射0.03 mg/kg的丁丙诺啡。
  22. 持续监测小鼠，直至其完全恢复并表现正常行为（即理毛、探索笼具、进食或饮水）。恢复后，将雌鼠放回与雄鼠同笼饲养。
    注意：若所有步骤均正确执行，小鼠通常在2分钟内恢复意识，并立即开始在笼内活动，无任何不适表现。
  23. 若小鼠出现不适症状（例如弓背姿势、卟啉分泌物）33，应在饮水中添加卡洛芬至0.1 mg/mL。若出现多种不适症状，或即使给予卡洛芬后不适持续超过4小时，应立即使用1 mL注射器配合26G、½"针头，腹腔注射致死剂量的氯胺酮（240 mg/kg）-赛拉嗪（48 mg/kg）-乙酰丙嗪（1.85 mg/kg）混合液实施安乐死，并辅以经批准的第二种安乐死方法33。
  24. 为提高电穿孔胚胎出生后的存活率，应将笼具置于安静的饲养室中，避免噪音和振动。通过塑料小屋、筑巢材料以及葵花籽等膳食补充剂丰富环境（见材料清单）。不要移动或干扰笼具，尤其是在分娩后前3天内。

5. 荧光显微镜用组织学样品制备

注意：本组织学方案经过优化，适用于制备出生后第13天（P13）以上经电穿孔转染的动物组织 在体对于出生后较年轻动物（P0-P13）的组织制备，建议遵循所有步骤（包括经心灌注），但在切片前应先将脑组织包埋于琼脂中（步骤5.9）。甚至可在电穿孔后1-2天内的胚胎中制备组织，方法如前所述。18,20.

  1. 准备多聚甲醛（PFA）溶液。
    注意：必须在实验前一天内配制新鲜的PFA。
    注意：多聚甲醛具有毒性，应在通风橱中使用，并配备适当的个人防护装备。
    1. 配制 50 mL 4% PFA 溶液时，将 40 mL 水加热至 60 °C °C. 加入2 g PFA，同时用玻璃棒或搅拌子搅拌。加入10 µ每2分钟加入1 L 10 M NaOH，直至PFA溶解。
    2. 加入5 mL 10x PBS，并加水至终体积为50 mL。
    3. 将溶液定容至 50 mL 后，根据需要使用 10 M HCl 调节 pH 至 7.4。待溶液冷却后，于 4 °C 保存。 °C.
  2. 使用1 mL注射器（配26G针头）经腹腔注射氯胺酮（240 mg/kg）、赛拉嗪（48 mg/kg）和乙酰丙嗪（1.85 mg/kg）混合溶液，处死小鼠。 ½" 针头。经心脏灌注10或20 mL冰冷的1×PBS，随后灌注25或40 mL新鲜配制的冰冷4% PFA17对于幼龄出生后小鼠（P0-P13）使用较小体积，对于较大龄小鼠（P14及以上）使用较大体积。
  3. 灌注结束后，立即使用大剪刀在枕骨与第一颈椎之间剪断小鼠尸体头部，随后用虹膜剪剥离并丢弃颅骨周围大部分皮肤，尤其是额骨、顶骨和枕骨周围的皮肤。保持颅骨和脑组织完整。
  4. 将颅骨和脑组织置于含有10 mL 4%多聚甲醛的50 mL锥形管中，4 °C固定24 h °C 用于固定组织后，向锥形管中加入 30 mL 1×PBS，将溶液稀释至 1% PFA，并于 4℃ 保存。 °C.
    注意：每个头骨和脑组织应使用单独的锥形管进行后固定。脑组织在1% PFA中的孵育时间不得超过2周，否则荧光会开始减弱。
  5. 将脑组织和颅骨置于平面上，下方垫有经1×PBS润湿的单层实验擦拭纸。使用镊子（见材料列表）去除颅骨周围残留的皮肤或膜组织。
  6. 使用镊子，先去除枕骨，然后小心地去除顶骨，操作时将镊子从脑表面向外移开。仔细清除所有脑膜，以防止损伤大脑皮层。
  7. 用镊子尖端沿颅骨插入脑组织下方，切断所有脑神经，然后取出脑组织。
  8. 对于幼年出生后（P0-P13）大脑
    1. 将 25 mL 1×PBS 加热至 80 °C，加入 1 g 琼脂，混匀溶解，配制 25 mL 4% 琼脂溶液 °C. 用玻璃棒或搅拌子搅拌并溶解1 g琼脂。
    2. 冷却至35 °C，同时继续搅拌。将脑组织放入一个小容器中（例如 50 mL 锥形管的盖子），将琼脂溶液倒入脑组织上，静置使其凝固。
  9. 使用单刃剃须刀片在脑组织上进行冠状切面的手动切割，切口位置大约位于前囟（bregma）前方0.5 mm处。在视觉皮层后方约0.5 mm处进行另一处冠状切面切割。在振动切片机样品盘中心放置一滴氰基丙烯酸酯胶水，胶水直径应与脑组织前端直径相同。将脑组织的前端置于胶水滴上，确保组织前端整个表面均通过胶水牢固粘附于样品盘上。
  10. 将缓冲液托盘安装到振动切片机上，并使用内置夹紧杠杆固定。将刀片插入刀片夹持器中，并用内置夹紧螺钉将刀片夹持器安装到振动切片机上。使用内置夹紧装置将带有脑组织的标本盘固定在缓冲液托盘上。将速度设置为5.70（= 0.285 mm/s），频率设置为5.33（53.3 Hz）。
  11. 用1×PBS填充至脑组织上方，并将刀片浸入PBS中，开始切取100 μm厚的切片。 µm 冠状切面穿过组织。
  12. 若无需进一步处理，如4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核染色或免疫组织化学。
    1. 使用细尖画笔将切片直接从振动切片机转移至载玻片上，每张载玻片放置4-6个切片。
    2. 用细尖画笔吸去溶液，使切片自然干燥，直至脑片在载玻片上不再漂动。
    3. 然后，在载玻片上每个切片各加一滴封片剂（参见材料列表）。
    4. 轻轻将一块 24 × 50 mm 的盖玻片覆盖在切片上，确保：1）切片上无气泡产生，2）切片位置不移动，3）封片剂完全覆盖载玻片与盖玻片之间的区域。让封片剂至少固化 24–48 小时。
  13. 用 DAPI 对细胞核进行染色以进行皮质层的组织学检查
    1. 使用细尖画笔将每个切片转移至含有10的溶液中 µg/mL DAPI（见材料列表），用1×PBS将储备液（20 mg/mL DAPI溶于水）稀释而成。
    2. 室温下在DAPI溶液中孵育5分钟，然后用细头画笔将切片从DAPI溶液转移至1x PBS中，室温下在1x PBS中孵育5分钟。再将切片转移至新鲜的1x PBS中两次，每次5分钟。随后，用细头画笔将切片转移至载玻片上，执行步骤5.11.2–5.11.4，并继续进行步骤5.13。
  14. 将含有瓦拉普（Valap，等量的凡士林、羊毛脂和石蜡）的玻璃培养皿置于电热板上，用低火加热至完全熔化。用毛刷将熔化的瓦拉普涂抹于载玻片的暴露边缘进行封固。
  15. 使用光学显微镜或共聚焦显微镜（见材料列表）以及适用于观察荧光染料的滤光片组来检测组织中的荧光例如 DAPI：激发光波长 325-375 nm，发射光波长 435-485 nm；GFP：激发光波长 450-490 nm，发射光波长 500-550 nm17可使用低倍（4X，数值孔径，NA = 0.20）、中倍（20X，数值孔径，NA = 0.75）和高倍（60X，数值孔径，NA = 1.40）物镜采集共聚焦图像。

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结果

在E15.5天电转单个质粒GFP.Cre（见材料列表），并在P14天进行观察。根据质粒浓度和注射体积的不同，可获得稀疏或密集的标记结果。22,26例如，注射 1 µL 2 mg/mL GFP.Cre 可导致标记细胞呈稀疏分布，其中部分细胞可能较亮（图1A），并定位于第二/三层（II/III层）图1B）。由于组织是 100 µm 较厚，大部分树突分支得以保存（图1C）。树突棘可在高倍镜下（60X； 图1D）。注射 1.5 µL 在相同浓度下会导致非常密集的标记（图2A在II/III层中（图2B），这可能并...

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讨论

本文介绍了在基因 floxed 的小鼠中，将in utero电穿孔技术与 Cre 重组酶相结合以生成嵌合脑组织的方法。该方法的一个优势在于，每次靶向不同的细胞亚群时，无需构建新的小鼠品系：in utero电穿孔可根据电穿孔的时间和位置，用于靶向兴奋性神经元、抑制性神经元或胶质细胞15,16,17,18,19,20,21,34。在本方法中，由于我们采用直径为 5 mm 的电穿孔电极，可覆盖发育中端脑的较大区域，因此对大脑皮层的靶向具有高度一致性和可重复性。若需靶向脑内其他部位...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢詹姆斯·麦迪逊大学生物学系和詹姆斯·麦迪逊大学光学显微镜与成像中心的大力支持。感谢Mark L. Gabriele博士在幼年出生后组织制备方面的宝贵建议，以及Justin W. Brown博士和Corey L. Cleland博士在手术材料和实验空间方面的慷慨协调。本研究部分由4-VA协作研究资助（4-VA为推动弗吉尼亚州共同发展的合作联盟，资助对象：G.S.V.）以及弗吉尼亚科学院小型项目研究资助（资助对象：G.S.V.）提供经费支持。本研究还获得了Betty Jo Loving Butler '58本科生研究奖学金（授予K.M.B.）、Farrell暑期研究奖学金（授予K.M.B.）、詹姆斯·麦迪逊大学二十一世纪奖学金（授予K.M.B.）、詹姆斯·麦迪逊大学百年纪念奖学金（授予C.J.H.）、詹姆斯·麦迪逊大学Lucy Robinson Search '30纪念奖学金（授予Z.L.H.）以及詹姆斯·麦迪逊大学科学与数学学院教师援助资助（授予G.S.V.）的慷慨支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
C57BL/6J 小鼠杰克逊实验室#000664参见“1. 小鼠准备”（步骤 1.1，“野生型小鼠”）
GFP.Cre 空载体AddGene#20781参见“2. DNA 准备”（步骤 2.1，“编码 Cre 重组酶及荧光标记的单一 DNA 构建体”）。GFP.Cre 空载体由 Tyler Jacks 惠赠。
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE（Supernova）AddGene#69138参见“2. DNA 准备”（步骤 2.1，“Supernova”系统）及 http://snsupport.webcrow.jp/。pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE（Supernova）由 Takuji Iwasato 惠赠。
pK031.TRE-Cre（Supernova）AddGene#69136参见“2. DNA 准备”（步骤 2.1，“Supernova”系统）及 http://snsupport.webcrow.jp/。pK031.TRE-Cre（Supernova）由 Takuji Iwasato 惠赠。
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE（Supernova）AddGene#85006参见“2. DNA 准备”（步骤 2.1，“Supernova”系统）及 http://snsupport.webcrow.jp/。pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE（Supernova）由 Takuji Iwasato 惠赠。
EndoFree 质粒大提试剂盒（10）Qiagen#12362参见“2. DNA 准备”（步骤 2.3，“无内毒素质粒纯化试剂盒”）
台盼蓝粉末，生物试剂级SigmaT6146-5G参见“2. DNA 准备”（步骤 2.5，“台盼蓝”）
氯化钠，ACS 级，2.5 kgVWRBDH9286-2.5KG参见“2. DNA 准备”（步骤 2.5，“NaCl”）
氯化钾，ACS 级，500 gVWR#97061-566参见“2. DNA 准备”（步骤 2.5，“KCl”）
磷酸氢二钠，ReagentPlus 级，100 gSigma-AldrichS0876-100G参见“2. DNA 准备”（步骤 2.5，“Na2HPO4”）
磷酸二氢钾，ReagentPlus 级，100 gSigma-AldrichP5379-100G参见“2. DNA 准备”（步骤 2.5，“KH2PO4”）
盐酸，ACS 试剂，500 mL赛默飞世尔科技A144-500参见“2. DNA 准备”（步骤 2.5，“HCl”）
P-97 微量移液器拉制仪Sutter InstrumentP-97参见“3. 移液管准备”（步骤 3.1，“玻璃毛细管拉制仪”）
3.0 mm 宽槽灯丝Sutter InstrumentFT330B参见“3. 移液管准备”（步骤 3.1，“玻璃毛细管拉制仪”）
薄壁玻璃毛细管，4 英寸，外径/内径 1 / 0.75世界精密仪器公司TW100-4参见“3. 移液管准备”（步骤 3.1.1，“玻璃毛细管”）
单层 Soft-Tech 擦拭纸，4.5 英寸PhenixLW-8148参见“3. 移液管准备”（步骤 3.2.1，“单层任务擦拭纸”）；其他单层擦拭纸（如 Kimwipes）也可使用。
Graefe 镊子，7 cm，直头，0.7 mm 1×2 齿世界精密仪器公司#14140参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.1，“Graefe 镊子”）
虹膜剪，11.5 cm，直头，12 个装世界精密仪器公司#503708-12参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.1，“虹膜剪”）
Hartman 蚊式镊，9 cm，直头，12 个装世界精密仪器公司#503728-12参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.1，“Hartman 蚊式镊”）
通用非织造海绵，2 英寸 × 2 英寸，4 层Medrepexpress#2204-c参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.1，“非织造纱布海绵”）
环头镊，10 cm，直头，2.2 mm 内径世界精密仪器公司#503203参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.1，“环头镊”）
Pyrex 完整培养皿，外径 × 高 100 mm × 20 mmSigma-AldrichCLS3160102-12EA参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.1，“培养皿”）
平底型器械托盘，不锈钢，13-5/8 英寸 × 9-3/4 英寸 × 5/8 英寸亚马逊B007SHGAHA参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.1，“不锈钢托盘”）
铂金镊式电极，5 mmBTX#45-0489参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.3 和 4.16，“镊式电极”）
ECM 830 脚踏开关BTX#45-0211参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.3 和 4.17，“脚踏开关”）
ECM 830 电穿孔仪BTX#45-0052参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.3，“电穿孔仪”）
单动物异氟烷麻醉系统，带小型诱导箱哈佛仪器#72-6468参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.4 和 4.6，“鼻罩”，步骤 4.4，“诱导室”）
眼科软膏Hanna Pharmaceutical Supply Co#0536108691参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.7，“兽用眼科软膏”）
Space Gel（AIMS）VWR#95059-640参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.8，“填充过饱和盐溶液的密封袋”）
脱毛凝胶乳霜，敏感配方Veet#062200809951参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.9，“脱毛膏”）
10 µL 低吸附移液器吸头套装（960 个/包）Phenix Research ProductsTSP-10LKIT参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.12，“无菌 10 µL 微量移液器吸头”）
校准微量毛细移液管用吸管组件Sigma-AldrichA5177参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.15，“吸管组件”）
编织可吸收缝合线，4-0，针号 NFS-2(FS-2)，27 英寸MedrepexpressMV-J397参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.19，“可吸收缝合线”）
“LiquiVet Rapid” 组织粘合剂MedrepexpressVG3参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.20，“组织粘合剂”）
皮下注射器，聚丙烯材质，鲁尔锁头，容量 1.0 mLSigma-AldrichZ551546-100EA参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.21，“1 mL 注射器”）
BD Precisionglide 注射器针头，26 号，长度 1/2 英寸Sigma-AldrichZ192392-100EA参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.21，“26G，½” 针头”）
Nestlets 巢材AncareNES3600参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.24，“巢材”）
葵花籽，黑油，无菌Bio-ServS5137参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.24，“葵花籽”）
多聚甲醛，97%Alfa AesarA11313参见“5. 组织学”（步骤 5.1.1，“PFA”）
经济型镊子 #3，11 cm，尖端 0.2 × 0.4 mm世界精密仪器公司#501976参见“5. 组织学”（步骤 5.5，“镊子”）
琼脂粉Alfa Aesar#10752参见“5. 组织学”（步骤 5.8.1，“琼脂”）
单刃剃须刀片，#9 刀片Stanley Tools#11-515参见“5. 组织学”（步骤 5.9，“单刃剃须刀片”）
标本盘 S，直径 50 mmLeica#14046327404参见“5. 组织学”（步骤 5.9，“振动切片机标本盘”）
缓冲槽 S 组件Leica#1404630132参见“5. 组织学”（步骤 5.10，“缓冲槽”）
VT1000 S 振动切片机Leica#14047235612参见“5. 组织学”（步骤 5.10，“振动切片机”）
双刃剃须刀片PersonnaBP9020参见“5. 组织学”（步骤 5.10，“刀片”）
刀架 SLeica#14046230131参见“5. 组织学”（步骤 5.10，“刀架”）
Studio Elements 金色 Taklon 短柄圆头刷套装亚马逊B0089KU6XE参见“5. 组织学”（步骤 5.12.1，“细头画笔”）
Superfrost Plus 载玻片电子显微镜服务公司#71869-11参见“5. 组织学”（步骤 5.12.1，“显微镜载玻片”）
ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂，10 ml赛默飞世尔科技P36970参见“5. 组织学”（步骤 5.12.3–5.12.4，“封片剂”）
盖玻片，24 × 50 mm，1 号Phenix Research ProductsMS1415-10参见“5. 组织学”（步骤 5.12.4，“盖玻片”）
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）Sigma-AldrichD9542参见“5. 组织学”（步骤 5.13.1，“DAPI”）
固定式直立显微镜奥林巴斯BX51WI参见“5. 组织学”（步骤 5.15，“光学显微镜”）
激光扫描共聚焦显微镜尼康TE2000/C2si参见“5. 组织学”（步骤 5.15，“共聚焦显微镜”）
4x 物镜，NA = 0.20尼康CFI Plan Apo Lambda 4X参见“5. 组织学”（步骤 5.15，“低倍物镜”）
20x 物镜，NA = 0.75尼康CFI Plan Apo Lambda 20X参见“5. 组织学”（步骤 5.15，“中倍物镜”）
60x 物镜，NA = 1.40尼康CFI Plan Apo VC 60X Oil参见“5. 组织学”（步骤 5.15，“高倍物镜”）

参考文献

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