通过在稀疏分布的细胞群体中诱导基因的缺失或获得功能，可研究基因在脑内的细胞自主性功能。本文描述 在体 电穿孔法递送 Cre 重组酶至具有 floxed 基因的稀疏发育期皮层神经元以实现基因功能缺失 在体内.
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方法文章
通过诱导小鼠大脑皮层中的 Cre-lox 重组 子宫内 电穿孔
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
通过在少量且稀疏分布的神经元中诱导某个基因的功能缺失或功能获得，可以揭示该基因在神经元中的细胞自主性功能。实现这一目标需要构建一种嵌合组织，其中发生基因功能缺失或获得的神经元被遗传学上未受干扰的组织所包围。本文中，我们将Cre-lox重组系统与子宫内电穿孔技术相结合，以生成可用于研究基因在神经元中细胞自主性功能的嵌合脑组织。利用子宫内电穿孔技术，将编码荧光标记蛋白和Cre重组酶的DNA质粒（可通过资源库获取）导入发育中的小鼠胚胎脑内皮层神经元，这些神经元的特定基因两侧含有loxP位点。此外，我们还描述了若干对子宫内电穿孔方法的改进，以提高动物存活率和实验可重复性。该方法还包括确定Cre介导的重组在稀疏或密集神经元群体中的滴定效应。对标记脑组织进行组织学切片时，无需（但可适配）免疫组织化学染色。所使用的质粒可确保荧光标记的神经元均表达Cre重组酶。通过共聚焦显微镜观察树突和轴突分支以及树突棘，组织学切片可用于神经元形态学分析。由于功能缺失或获得发生在稀疏的嵌合组织中，该方法可在体内研究基因产物在细胞水平上的必要性和充分性。 在子宫内 电穿孔以生成可用于研究神经元中基因细胞自主功能的嵌合脑组织。通过电穿孔将编码荧光标记和Cre重组酶的DNA构建体（可通过资源库获取）导入含有两侧带有loxP位点基因的发育中皮层神经元，这些神经元位于小鼠胚胎脑内 在体 电穿孔。此外，我们描述了对电穿孔方法的多种改进 在子宫内 提高存活率和可重复性的电穿孔方法。该方法还包括在稀疏或密集的神经元群体中建立Cre介导重组的滴定度。标记脑组织的组织学制备无需免疫组织化学（但可适配免疫组织化学）。所用载体可确保荧光标记的神经元携带Cre重组酶基因。组织学制备可通过共聚焦成像对树突和轴突分支以及树突棘进行神经元形态学分析。由于功能缺失或功能获得是在稀疏的嵌合组织中实现的，该方法可用于研究基因产物的细胞自主性必要性和充分性。 在体内.
引言
构建遗传嵌合体是研究目的基因功能的经典实验范式。要确定某个基因是否对特定细胞表型是必需的，最简单的方法是在整个生物体中造成该基因的功能丧失（例如基因敲除）。然而，若要确定某个基因是否仅在特定细胞类型中发挥作用，则在整个生物体中进行基因敲除并非有效策略。相反，需要一种能够在特定细胞中导致基因功能丧失，而该细胞周围仍被野生型（即遗传未受干扰）组织所包围的方法——换句话说，就是创建嵌合组织。如果突变细胞表现出突变表型，而周围的野生型细胞则无此表型，则表明该基因以细胞自主性方式发挥作用。通过分析突变细胞被野生型组织包围的嵌合组织，可理想地揭示基因的细胞自主性功能，尤其适用于神经元和胶质细胞构成庞大互连网络的脑组织研究。
多种形式的嵌合脑组织为研究基因的细胞自主功能提供了强有力的模型。聚焦于神经元移植1、女性X连锁嵌合现象2,3,4以及内源性体细胞嵌合现象5,6的研究均基于嵌合脑组织得出结论。通过Cre-lox重组系统实现基因的条件性删除是一种充分利用了大量可用转基因小鼠品系的方法。在该方法中，将两个l....
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方案
本文所述方法已获得詹姆斯·麦迪逊大学动物护理与使用委员会（ACUC）的批准，并符合所有相关的法规和机构指南。
1. 小鼠准备
- 饲养年轻的（>P60 雄性和雌性纯合 floxed 小鼠交配以建立繁殖对25.
注意：一个良好的阴性对照是设置一组额外的野生型小鼠繁育对，其中Cre重组酶的表达不会引起嵌合现象26. - 让雌鼠与雄鼠交配并产下第一窝幼崽，期间将雄鼠与雌鼠共同饲养以提高幼崽存活率。断奶后， 例如 在出生后第21天（P21），将雌性和雄性分开。
- 小鼠繁育
- 设置雌性和雄性小鼠的定时交配25. 利用视觉提示确定雌性动物的动情周期27，并在交配后的第二天早晨检查阴道栓25.
- 若发现阴栓，将雌鼠分离并称重，记为胚胎第（E）0.5天。
- 每3-5天继续称量雌鼠体重，以判断其是否怀孕。怀孕雌鼠在受孕后7-10天（E0）体重将增加10-20%。
注意：此步骤比目视检查更早且更可靠地确认妊娠状态25
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结果
在E15.5天电转单个质粒GFP.Cre（见材料列表），并在P14天进行观察。根据质粒浓度和注射体积的不同，可获得稀疏或密集的标记结果。22,26例如，注射 1 µL 2 mg/mL GFP.Cre 可导致标记细胞呈稀疏分布，其中部分细胞可能较亮（图1A），并定位于第二/三层（II/III层）图1B）。由于组织是 100 µm 较厚，大部分树突分支得以保存（图1C）。树突棘可在高倍镜下（60X； 图1D）。注射 1.5 µL 在相同浓度下会导致非常密集的标记（图2A在II/III层中（图2B），这可能并.......
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讨论
本文介绍了在基因 floxed 的小鼠中，将in utero电穿孔技术与 Cre 重组酶相结合以生成嵌合脑组织的方法。该方法的一个优势在于，每次靶向不同的细胞亚群时，无需构建新的小鼠品系：in utero电穿孔可根据电穿孔的时间和位置，用于靶向兴奋性神经元、抑制性神经元或胶质细胞15,16,17,18,19,20,21,34。在本方法中，由于我们采用直径为 5 mm 的电穿孔电极，可覆盖发育中端脑的较大区域，因此对大脑皮层的靶向具有高度一致性和可重复性。若需靶向脑内其他部位.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢詹姆斯·麦迪逊大学生物学系和詹姆斯·麦迪逊大学光学显微镜与成像中心的大力支持。感谢Mark L. Gabriele博士在幼年出生后组织制备方面的宝贵建议，以及Justin W. Brown博士和Corey L. Cleland博士在手术材料和实验空间方面的慷慨协调。本研究部分由4-VA协作研究资助（4-VA为推动弗吉尼亚州共同发展的合作联盟，资助对象：G.S.V.）以及弗吉尼亚科学院小型项目研究资助（资助对象：G.S.V.）提供经费支持。本研究还获得了Betty Jo Loving Butler '58本科生研究奖学金（授予K.M.B.）、Farrell暑期研究奖学金（授予K.M.B.）、詹姆斯·麦迪逊大学二十一世纪奖学金（授予K.M.B.）、詹姆斯·麦迪逊大学百年纪念奖学金（授予C.J.H.）、詹姆斯·麦迪逊大学Lucy Robinson Search '30纪念奖学金（授予Z.L.H.）以及詹姆斯·麦迪逊大学科学与数学学院教师援助资助（授予G.S.V.）的慷慨支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C57BL/6J 小鼠 | 杰克逊实验室 | #000664 | 参见“1. 小鼠准备”（步骤 1.1，“野生型小鼠”） |
| GFP.Cre 空载体 | AddGene | #20781 | 参见“2. DNA 准备”（步骤 2.1，“编码 Cre 重组酶及荧光标记的单一 DNA 构建体”）。GFP.Cre 空载体由 Tyler Jacks 惠赠。 |
| pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE（Supernova） | AddGene | #69138 | 参见“2. DNA 准备”（步骤 2.1，“Supernova”系统）及 http://snsupport.webcrow.jp/。pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE（Supernova）由 Takuji Iwasato 惠赠。 |
| pK031.TRE-Cre（Supernova） | AddGene | #69136 | 参见“2. DNA 准备”（步骤 2.1，“Supernova”系统）及 http://snsupport.webcrow.jp/。pK031.TRE-Cre（Supernova）由 Takuji Iwasato 惠赠。 |
| pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE（Supernova） | AddGene | #85006 | 参见“2. DNA 准备”（步骤 2.1，“Supernova”系统）及 http://snsupport.webcrow.jp/。pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE（Supernova）由 Takuji Iwasato 惠赠。 |
| EndoFree 质粒大提试剂盒（10） | Qiagen | #12362 | 参见“2. DNA 准备”（步骤 2.3，“无内毒素质粒纯化试剂盒”） |
| 台盼蓝粉末，生物试剂级 | Sigma | T6146-5G | 参见“2. DNA 准备”（步骤 2.5，“台盼蓝”） |
| 氯化钠，ACS 级，2.5 kg | VWR | BDH9286-2.5KG | 参见“2. DNA 准备”（步骤 2.5，“NaCl”） |
| 氯化钾，ACS 级，500 g | VWR | #97061-566 | 参见“2. DNA 准备”（步骤 2.5，“KCl”） |
| 磷酸氢二钠，ReagentPlus 级，100 g | Sigma-Aldrich | S0876-100G | 参见“2. DNA 准备”（步骤 2.5，“Na2HPO4”） |
| 磷酸二氢钾，ReagentPlus 级，100 g | Sigma-Aldrich | P5379-100G | 参见“2. DNA 准备”（步骤 2.5，“KH2PO4”） |
| 盐酸，ACS 试剂，500 mL | 赛默飞世尔科技 | A144-500 | 参见“2. DNA 准备”（步骤 2.5，“HCl”） |
| P-97 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument | P-97 | 参见“3. 移液管准备”（步骤 3.1，“玻璃毛细管拉制仪”） |
| 3.0 mm 宽槽灯丝 | Sutter Instrument | FT330B | 参见“3. 移液管准备”（步骤 3.1，“玻璃毛细管拉制仪”） |
| 薄壁玻璃毛细管，4 英寸，外径/内径 1 / 0.75 | 世界精密仪器公司 | TW100-4 | 参见“3. 移液管准备”（步骤 3.1.1，“玻璃毛细管”） |
| 单层 Soft-Tech 擦拭纸，4.5 英寸 | Phenix | LW-8148 | 参见“3. 移液管准备”（步骤 3.2.1，“单层任务擦拭纸”）；其他单层擦拭纸（如 Kimwipes）也可使用。 |
| Graefe 镊子，7 cm，直头，0.7 mm 1×2 齿 | 世界精密仪器公司 | #14140 | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.1，“Graefe 镊子”） |
| 虹膜剪，11.5 cm，直头，12 个装 | 世界精密仪器公司 | #503708-12 | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.1，“虹膜剪”） |
| Hartman 蚊式镊，9 cm，直头，12 个装 | 世界精密仪器公司 | #503728-12 | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.1，“Hartman 蚊式镊”） |
| 通用非织造海绵，2 英寸 × 2 英寸，4 层 | Medrepexpress | #2204-c | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.1，“非织造纱布海绵”） |
| 环头镊，10 cm，直头，2.2 mm 内径 | 世界精密仪器公司 | #503203 | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.1，“环头镊”） |
| Pyrex 完整培养皿，外径 × 高 100 mm × 20 mm | Sigma-Aldrich | CLS3160102-12EA | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.1，“培养皿”） |
| 平底型器械托盘，不锈钢，13-5/8 英寸 × 9-3/4 英寸 × 5/8 英寸 | 亚马逊 | B007SHGAHA | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.1，“不锈钢托盘”） |
| 铂金镊式电极，5 mm | BTX | #45-0489 | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.3 和 4.16，“镊式电极”） |
| ECM 830 脚踏开关 | BTX | #45-0211 | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.3 和 4.17，“脚踏开关”） |
| ECM 830 电穿孔仪 | BTX | #45-0052 | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.3，“电穿孔仪”） |
| 单动物异氟烷麻醉系统，带小型诱导箱 | 哈佛仪器 | #72-6468 | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.4 和 4.6，“鼻罩”，步骤 4.4，“诱导室”） |
| 眼科软膏 | Hanna Pharmaceutical Supply Co | #0536108691 | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.7，“兽用眼科软膏”） |
| Space Gel（AIMS） | VWR | #95059-640 | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.8，“填充过饱和盐溶液的密封袋”） |
| 脱毛凝胶乳霜，敏感配方 | Veet | #062200809951 | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.9，“脱毛膏”） |
| 10 µL 低吸附移液器吸头套装（960 个/包） | Phenix Research Products | TSP-10LKIT | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.12，“无菌 10 µL 微量移液器吸头”） |
| 校准微量毛细移液管用吸管组件 | Sigma-Aldrich | A5177 | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.15，“吸管组件”） |
| 编织可吸收缝合线，4-0，针号 NFS-2(FS-2)，27 英寸 | Medrepexpress | MV-J397 | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.19，“可吸收缝合线”） |
| “LiquiVet Rapid” 组织粘合剂 | Medrepexpress | VG3 | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.20，“组织粘合剂”） |
| 皮下注射器，聚丙烯材质，鲁尔锁头，容量 1.0 mL | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.21，“1 mL 注射器”） |
| BD Precisionglide 注射器针头，26 号，长度 1/2 英寸 | Sigma-Aldrich | Z192392-100EA | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.21，“26G，½” 针头”） |
| Nestlets 巢材 | Ancare | NES3600 | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.24，“巢材”） |
| 葵花籽，黑油，无菌 | Bio-Serv | S5137 | 参见“4. 胚内电穿孔”（步骤 4.24，“葵花籽”） |
| 多聚甲醛，97% | Alfa Aesar | A11313 | 参见“5. 组织学”（步骤 5.1.1，“PFA”） |
| 经济型镊子 #3，11 cm，尖端 0.2 × 0.4 mm | 世界精密仪器公司 | #501976 | 参见“5. 组织学”（步骤 5.5，“镊子”） |
| 琼脂粉 | Alfa Aesar | #10752 | 参见“5. 组织学”（步骤 5.8.1，“琼脂”） |
| 单刃剃须刀片，#9 刀片 | Stanley Tools | #11-515 | 参见“5. 组织学”（步骤 5.9，“单刃剃须刀片”） |
| 标本盘 S，直径 50 mm | Leica | #14046327404 | 参见“5. 组织学”（步骤 5.9，“振动切片机标本盘”） |
| 缓冲槽 S 组件 | Leica | #1404630132 | 参见“5. 组织学”（步骤 5.10，“缓冲槽”） |
| VT1000 S 振动切片机 | Leica | #14047235612 | 参见“5. 组织学”（步骤 5.10，“振动切片机”） |
| 双刃剃须刀片 | Personna | BP9020 | 参见“5. 组织学”（步骤 5.10，“刀片”） |
| 刀架 S | Leica | #14046230131 | 参见“5. 组织学”（步骤 5.10，“刀架”） |
| Studio Elements 金色 Taklon 短柄圆头刷套装 | 亚马逊 | B0089KU6XE | 参见“5. 组织学”（步骤 5.12.1，“细头画笔”） |
| Superfrost Plus 载玻片 | 电子显微镜服务公司 | #71869-11 | 参见“5. 组织学”（步骤 5.12.1，“显微镜载玻片”） |
| ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂，10 ml | 赛默飞世尔科技 | P36970 | 参见“5. 组织学”（步骤 5.12.3–5.12.4，“封片剂”） |
| 盖玻片，24 × 50 mm，1 号 | Phenix Research Products | MS1415-10 | 参见“5. 组织学”（步骤 5.12.4，“盖玻片”） |
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI） | Sigma-Aldrich | D9542 | 参见“5. 组织学”（步骤 5.13.1，“DAPI”） |
| 固定式直立显微镜 | 奥林巴斯 | BX51WI | 参见“5. 组织学”（步骤 5.15，“光学显微镜”） |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | 尼康 | TE2000/C2si | 参见“5. 组织学”（步骤 5.15，“共聚焦显微镜”） |
| 4x 物镜，NA = 0.20 | 尼康 | CFI Plan Apo Lambda 4X | 参见“5. 组织学”（步骤 5.15，“低倍物镜”） |
| 20x 物镜，NA = 0.75 | 尼康 | CFI Plan Apo Lambda 20X | 参见“5. 组织学”（步骤 5.15，“中倍物镜”） |
| 60x 物镜，NA = 1.40 | 尼康 | CFI Plan Apo VC 60X Oil | 参见“5. 组织学”（步骤 5.15，“高倍物镜”） |
参考文献
- Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genot....
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