一种基于细胞的简单免疫荧光法检测血液中抗N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体自身抗体

摘要

我们在人胚胎肾细胞（HEK293）中异位表达了绿色荧光蛋白标记的NMDA受体NR1亚基，作为抗原用于检测疑似自身免疫性脑炎患者血液中针对NMDA受体的自身抗体。这种简单的方法可能适用于临床环境中的筛查。

摘要

抗NMDA受体自身抗体的存在可导致患者出现多种神经精神症状，称为抗NMDA受体自身免疫性脑炎。准确诊断该疾病的关键在于检测血液或脑脊液（CSF）中是否存在针对NMDA受体的特异性自身抗体。NMDA受体是一种离子通道蛋白复合物，包含四个亚基，其中包括两个必需的NMDA受体1亚基（NR1）以及一个或两个NMDA受体2A亚基（NR2A）、NMDA受体2B亚基（NR2B）、NMDA受体2C亚基（NR2C）或NMDA受体2D亚基（NR2D）。据报道，抗NMDA受体自身抗体的表位位于NMDA受体NR1亚基的胞外N端结构域。本研究的目标是建立一种简便的基于细胞的免疫荧光检测方法，可用于筛查血液中是否存在针对NMDA受体NR1亚基的自身抗体，从而促进抗NMDA受体自身免疫性脑炎的临床与基础研究。

引言

抗NMDA受体自身免疫性脑炎是一种新近被认识的疾病实体，可发生于所有年龄段的患者，且主要影响女性患者^1,2。在病因初始不明的脑炎患者中，它是诊断频率最高的脑炎类型之一³。抗NMDA受体脑炎患者通常先出现头痛或发热等前驱症状，随后迅速出现意识水平改变以及多种急性神经精神症状，包括激越、易激惹、焦虑、失眠、幻觉、妄想、攻击行为、怪异举止、运动异常、自主神经功能紊乱和癫痫发作^4,5。对该疾病进行早期识别并及时采用免疫治疗，对于改善患者预后甚至实现完全康复具有重要意义⁶。因此，建议将抗NMDA受体自身免疫性脑炎作为表现为急性或新发精神病性特征患者的重要的鉴别诊断之一^7,8。

除了临床特征外，检测血液或脑脊液中抗NMDA受体的自身抗体对于准确诊断抗NMDA受体自身免疫性脑炎至关重要⁹。目前，大多数用于检测抗NMDA受体自身抗体的免疫学检测方法仅在少数研究实验室中可获得^10,11，且仅有一种 commercially available 的基于细胞的免疫荧光检测法可用于筛查抗NMDA受体自身抗体¹²。本研究的目标是建立一种简便的实验室自建基于细胞的免疫荧光检测法，可方便地在实验室中用于筛查抗NMDA受体自身抗体的存在，从而促进抗NMDA受体自身免疫性脑炎的临床研究。NMDA受体是一种在脑内特异性表达的异源四聚体离子通道蛋白复合物。它由两个必需的NR1亚基，以及一个或两个NR2A、NR2B、NR2C或NR2D亚基组合构成¹³。先前的研究报道，抗体主要靶向的表位位于NR1亚基的胞外N端结构域⁵。因此，在本方案中，我们在人胚胎肾上皮细胞系（HEK293）中表达带有绿色荧光蛋白（GFP）标签的人重组NMDA受体NR1亚基蛋白，并建立一种基于细胞的免疫荧光检测法，用于检测血液中IgG类抗NMDA受体自身抗体。

方案

该研究已获得中国台湾桃园市林口长庚纪念医院机构审查委员会的批准（102-2577A3）。

1. NR1-GFP 表达质粒的制备

1. 在无菌的 1.5 mL 离心管中，将 10 ng NR1-GFP 质粒与 100 µL 大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α 感受态细胞混合，用移液器轻轻吹打混合液 4–6 次，然后将离心管置于冰上孵育 20 分钟。
2. 将离心管在 42 °C 水浴中孵育 1 分钟，从水浴中取出离心管，向管中加入 1 mL LB 培养基（Lysogeny Broth），然后将离心管置于 37 °C 摇床中振荡培养 1 小时。
3. 取 50 µL 混合液涂布于含氨苄青霉素（0.1 mg/mL）的 LB 琼脂平板上，将平板置于 37 °C 培养箱中过夜培养。
4. 用无菌枪头从过夜培养的 LB 琼脂平板上挑取单个菌落，将枪头在含有 5 mL LB 培养基和氨苄青霉素（0.1 mg/mL）的细菌培养管中轻轻旋转混匀。将培养管置于 37 °C 摇床中振荡过夜培养。
5. 将 3 mL 过夜培养的菌液转移至含有 250 mL 无菌 LB 培养基和氨苄青霉素（0.1 mg/mL）的 500 mL 三角瓶中。将三角瓶置于 37 °C 振荡培养。使用分光光度计定期检测菌液在 600 nm 波长下的光密度（OD），直至 OD600 达到 0.6–1.0。
   注意：将 800 µL 过夜培养的菌液与 200 µL 甘油充分混匀，制备甘油菌种，于 -80 °C 保存以备后续使用。
6. 从 250 mL 细菌培养物中提取 NR1-GFP 表达质粒
   1. 在 4 °C 条件下，以 6,000 × g 离心 15 分钟收集菌体。
   2. 将菌体沉淀重悬于含 RNase A 的 10 mL 重悬缓冲液中，充分涡旋振荡至无可见团块。
   3. 向菌液中加入 10 mL 裂解缓冲液，轻轻倒置混合 4–6 次，并在室温（RT）下孵育 5 分钟。
   4. 向裂解液中加入 10 mL 预冷的沉淀缓冲液，轻轻倒置混合 4–6 次。
   5. 将裂解液倒入带有盖子的滤器套筒中，在室温下静置 10 分钟。
   6. 取下滤器出口端的盖子，将推杆插入套筒中，轻轻下压推杆，将滤过的裂解液收集至 50 mL 离心管中。
   7. 向滤过的裂解液中加入 2.5 mL 厂家提供的专用缓冲液，通过倒置约 10 次混匀，然后将混合液置于冰上孵育 30 分钟。
   8. 将滤过的裂解液混合物上样至已用 10 mL 平衡缓冲液预平衡的过滤柱中，依靠重力自然流过。
   9. 用 30 mL 洗涤缓冲液洗涤柱子两次，然后用 15 mL 洗脱缓冲液洗脱 DNA。
   10. 向洗脱的 DNA 溶液中加入 10.5 mL（0.7 倍体积）异丙醇，充分混匀，然后在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 30 分钟。
   11. 小心弃去上清液，用 5 mL 无内毒素的 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀一次，再以 20,000 × g 离心 10 分钟。
   12. 弃去上清液，在化学通风橱中干燥沉淀 5–10 分钟，然后将沉淀溶解于 300–500 µL 无内毒素缓冲液中。
   13. 使用分光光度计测定溶液在 260/280 nm 紫外波长下的吸光度，以确定质粒浓度。
       注意：使用相同方案制备表达质粒 GFP。

2. 使用 NR1-GFP 表达质粒转染 HEK293 细胞

1. 向48孔培养板的每个孔中加入200 µL 2%明胶溶液，在37 °C孵育至少30分钟。
2. 吸除孔中的明胶溶液，每孔接种5 × 10⁴个HEK293细胞，加入含10%胎牛血清（FBS）的200 µL细胞培养基。将培养板置于37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中过夜孵育。
   注意：细胞计数使用血细胞计数板进行。
3. 次日，将用过的培养基更换为每孔200 µL含10% FBS的新鲜培养基。
4. 针对每个单独的孔，通过将100 ng NR1-tGFP质粒与20 µL培养基混合制备溶液A，通过将0.8 µL转染试剂与20 µL培养基混合制备溶液B。根据实验所需孔数计算并放大各溶液的总体积。
5. 将溶液A与溶液B混合制备溶液C，在室温下孵育20–30分钟。
6. 向每孔含有HEK293细胞的孔中加入40 µL溶液C，轻轻摇动培养板混匀，然后将培养板置于37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中过夜孵育。
7. 在荧光显微镜下（放大倍数40X–200X，激发/发射波长：482/502 nm）观察宿主细胞中NR1-GFP重组蛋白的表达情况，并继续进行基于细胞的免疫荧光检测。
   注意：使用相同方案将GFP表达质粒转染至HEK293细胞中。

3. 基于细胞的免疫荧光检测

1. 吸弃孔中的废弃培养基，然后每孔加入 200 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次。
2. 每孔加入 200 µL 4% 多聚甲醛溶液，在室温下孵育 15 分钟。
3. 吸弃孔中的多聚甲醛溶液，每孔用 200 µL PBS 洗涤三次。
4. 每孔加入 200 µL 含 10% 脱脂奶粉的 PBST 溶液（PBS 中含 0.1% Tween-20），在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。
5. 吸弃孔中的含 10% 脱脂奶粉的 PBST 溶液，然后每孔用 200 µL PBST 洗涤一次。
6. 将稀释的血浆（以 PBST 按 1:100 稀释）作为一抗加入各孔，在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。
   注意：血浆来源于疑似患有自身免疫性脑炎患者的血液。
7. 吸弃孔中的稀释血浆，每孔用 200 µL PBST 洗涤三次。
8. 每孔加入 200 µL 与 Alexa Fluor 594 偶联的山羊抗人 IgG 抗体（以 PBST 按 1:1,000 稀释），将培养板在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。
9. 吸弃与 Alexa Fluor 594 偶联的山羊抗人 IgG 溶液，每孔用 200 µL PBST 洗涤三次。
10. 每孔加入 100 µL 甘油溶液（含 50% 甘油的 PBS 溶液，并加入 1:100,000 的 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI））。
11. 使用荧光显微镜，配备 10X 目镜以及 4X、10X 和 20X 物镜观察并拍摄细胞图像。
    注意：每种染料需使用正确的滤光片：NR1-GFP（激发/发射波长 = 482/502 nm），Alexa Fluor 594（激发/发射波长 = 561/594 nm），DAPI（激发/发射波长 = 358/461 nm）。使用表达 GFP 的 HEK 细胞以相同方法进行阴性对照实验。

结果

按照本方案第1节所述步骤，从250 mL细菌培养物中平均可获得200–300 µg无内毒素的表达质粒NR1-GFP和GFP。按照本方案第2节所述，将100 ng/孔的表达质粒用于转染培养在48孔板中的HEK293细胞。转染后24–30小时，细胞表达NR1-GFP和GFP重组蛋白，可在荧光显微镜下检测到。图1A显示表达NR1-GFP的宿主细胞图像，而图1D显示表达GFP的细胞图像。绿色信号可作为实验质量控制指标：在荧光显微镜下，约30%的细胞呈现绿色信号。图1A和1D显示表达NR1-GFP的宿主细胞图像。绿色信号可作为实验质量控制指标：在荧光显微镜下，约30%的细胞呈现绿色信号。表达NR1-GFP的细胞用于筛查人血浆样本中是否存在抗NMDA受体自身抗体。

讨论

文献中已报道多种基于细胞的免疫学检测方法，用于筛查抗NMDA受体的自身抗体，包括活细胞免疫荧光检测¹¹、固定细胞免疫荧光检测⁹以及基于流式细胞术的检测方法¹⁴。活细胞免疫荧光检测应在表达NR1蛋白的细胞制备后尽快进行，而基于流式细胞术的检测则需要经过培训的技术人员和特殊设备。固定细胞免疫荧光检测是一种更为便捷的方法，适用于临床检测环境。因此，许多研究采用商业化的间接固定细胞免疫荧光检测试剂盒，用于筛查血清和脑脊液样本中的抗NMDA受体自身抗体^12,15。所使用的试剂盒（见材料表）包含已固定且异源表达NMDA受体重组NR1亚基的HEK293细胞。该检测方法在血清和脑脊液样本中抗NMDA受体IgG抗体的检测中表现出优异的性能¹²。在本实验方案中，我们采用了与试剂盒制造商推荐方法相同的操作流程，唯一区别在于我们使用了NR1-GFP表达质粒...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
GRIN1（GFP 标签）- 人类谷氨酸受体，离子型，N-甲基-D-天冬氨酸 1（GRIN1），转录变体 NR1-1	Origene (Rockville, MD, USA)	RG219368	带有 C 末端 tGFP 序列标签的 NR1-cDNA 克隆
pCMV6-AC-GFP	Origene (Rockville, MD, USA)	PS100010	带有 C 末端 tGFP 标签的哺乳动物表达载体
EndoFree 质粒大提试剂盒	Qiagen (Hilden Germany)	12362
Lipofectamine 2000 转染试剂	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11668-019
Opti-MEM I 低血清培养基	Thermo Fisher	31985-070
DMEM，高糖，含丙酮酸钠	Thermo Fisher	11995-065
经鉴定的胎牛血清，美国来源	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.01
山羊抗人 IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 594 标记	Thermo Fisher	A-11014
阳性对照：抗谷氨酸受体（NMDA 型）	Euroimmun AG, Lübeck, Germany	CA 112d-0101
Euroimmun 检测试剂盒