体内评估小鼠股骨骨折愈合过程中骨痂发育：采用一种适用于小鼠股骨的磁共振成像兼容骨固定装置

摘要

在软骨内骨愈合过程中，评估骨折愈合组织中组织发育情况对于监测愈合进程至关重要。本文报道了一种适用于小鼠股骨的磁共振成像（MRI）兼容外固定装置，可在小鼠骨再生过程中实现MRI扫描。

摘要

软骨内骨折愈合是一个复杂的过程，涉及骨折愈合组织中纤维组织、软骨组织和骨组织的形成。愈合组织中不同类型组织的含量为评估骨折愈合进程提供了重要信息。在使用小型动物开展的临床前骨折愈合研究中，目前可用于纵向监测愈合组织发育的体内技术包括数字化放射成像和微计算机断层扫描（µCT）成像。然而，这两种技术仅能区分矿化组织与非矿化组织，因此无法将软骨组织与纤维组织区分开来。相比之下，磁共振成像（MRI）基于组织的含水量来显示解剖结构，因而可能能够无创地识别骨折愈合组织中的软组织和软骨组织。本文报道了一种适用于小鼠股骨的MRI兼容外固定装置，可用于小鼠骨再生过程中的MRI扫描。实验结果表明，该固定装置与定制的安装装置可实现重复性MRI扫描，从而能够对骨折愈合组织的组织发育进行纵向分析。

引言

继发性骨折愈合是最常见的骨愈合形式，该过程复杂，模拟了胚胎软骨内成骨的某些特定方面。^1,2,3早期骨折血肿主要由免疫细胞、肉芽组织和纤维组织构成。骨折间隙的低氧张力和高生物力学应变会抑制成骨细胞的分化，但可促进前体细胞向软骨细胞分化。^4,5,6这些细胞在损伤部位开始增殖，形成软骨样基质，为骨折骨提供初步稳定性。在骨痂成熟过程中，软骨细胞逐渐肥大，发生凋亡或转分化为成骨细胞。在软骨向骨组织过渡区域发生新生血管化，使氧浓度升高，从而促进骨组织的形成。⁷骨折间隙骨性桥接后，生物力学稳定性增强，随后破骨细胞对外部骨痂进行重塑，以恢复生理性骨轮廓与结构³因此，骨折愈合组织中纤维性、软骨性和骨性组织的含量为骨愈合过程提供了重要信息。在人类和小鼠中，愈合障碍或延迟愈合均会通过愈合组织发育的改变而显现。^8,9,....

方案

所有动物实验均符合国际实验动物护理与使用法规，并经德国图宾根地区监管机构批准（编号：1250，Regierungspräsidium Tübingen）。所有小鼠以每笼2至5只的密度饲养，维持14小时光照、10小时黑暗的昼夜节律，自由供应水和食物。 随意摄取.

1. 手术材料的准备及小鼠的预处理

1. 对所有手术器械进行灭菌处理。采用120-135 °C的高压灭菌温度，灭菌时间为20-30分钟。
2. 购买体重在19-35 g之间的C57BL/6小鼠或其他品系小鼠。遵循国家指南规定的动物护理和实验方案，并获得研究者所在机构动物护理与使用委员会的批准。在开始实验前，至少给予7天的适应性饲养期。
3. 通过饮水方式为所有小鼠提供镇痛药物，术前1天开始，持续至术后第3天。

2. 外固定器的手术操作与应用

1. 将小鼠放入预先装有5-7%异氟烷和60 mL/min氧气的诱导管中。待小鼠失去姿势反射后，将其从麻醉诱导管中取出，并通过吸入式面罩维持麻醉，面罩提供1-3%异氟烷和60 mL/min氧气。
   1. 监测麻醉期间的呼吸模式和后肢足底反射。确保呼吸频率约为100次/分钟，且后肢足底反射消失。
      ​注意：所需气体的量取决于小鼠的年龄、性别、体重和品系。
....

结果

首先，可通过分析 MRI 扫描图像来确认手术是否成功（见图2示例）。四根钢钉应均位于股骨干中段。截骨间隙的大小应在 0.3–0.5 mm 之间。如果截骨间隙大小与上述数值差异较大，则应将该小鼠排除在后续分析之外。

其次，在同一动物体内对骨折愈合过程中进行的纵向扫描可提供有关骨痂组织发育的信息。若小鼠在术后第10、14和21天进行扫描（见图3示例），软骨组织在第10天（软骨相对面积 = 30.8%）和第14天（软骨相对面积 = 29.0%）可见于骨折骨痂中央区域，并持续减少至第21天（软骨相对面积 = 10.5%）（图3）。骨组织在第10天可见于骨痂周边区域（骨组织相对面积 = 7.2%），至第14天增加（骨组织相对面积 = 15.6%），至第21天形成骨性连接（骨组织相对面积.......

讨论

修改与故障排除：

本研究的主要目的是描述一种在小鼠股骨截骨术中使用磁共振成像兼容的外固定架的实验方案，该方案能够在软骨内骨折愈合过程中纵向监测骨痂组织的发育情况。自行设计的外固定架植入用安装装置可确保在多次扫描过程中保持标准化的位置。半自动组织分割技术可用于分析骨折骨痂中纤维组织、软骨组织和骨组织的含量。此外，磁共振图像的三维重建可实现对每只小鼠软骨内骨折愈合过程的可视化观察。

方案中的关键步骤：

使用磁共振成像兼容的外固定架进行手术时，最关键的步骤包括：（1）手术过程中避免损伤坐骨神经，否则小鼠在截骨术后5天内将无法负重，必须从后续分析中剔除。（2）安装固定架时避免对固定架施加张力、压力或剪切应力，否则截骨间隙将无法保持标准化的大小和形状。此外，务必确保固定架与股骨的长轴平行，以实现截骨端的稳定固定。（3）若使用吉列丝锯，应避免产生金属碎屑，因为这些碎屑会干扰磁共振成像扫描过程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉管	FMI, Seeheim, Germany	ZUA-82-ANA-TUB-Mouse
麻醉机	FMI, Seeheim, Germany	ZUA-82-GME-MA
动脉钳	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BH104R
高压灭菌器	Systec, Wettenberg, Germany	DX-150
高压灭菌包装材料	Stericlin, Feuchtwangen, Germany	2301-04/06/10/12/16
Avizo 软件	FEI, Burlington, USA	-	版本 8.0.1
BioSpec 117/16 磁共振成像系统	Bruker Biospin, Ettlingen, Germany	117/16
动脉瘤夹	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BH 021R
碳钢手术刀片 11/15 号	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BA211/215
陶瓷固定针 0.45 mm	RISystem, Davos, Switzerland	HS691490
克林霉素 (300 mg / 2ml)	Ratiopharm, Ulm, Germany	-
敷料钳 115 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD210R
敷料钳 130 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD025R
涂层钻头 0.45 mm	RISystem, Davos, Switzerland	HS820420
防滑持针器 125 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BM024R
手术铺巾 Foliodrape	Hartmann, Heidenheim, Germany	2513026
Frekaderm	Fresenius, Bad Homburg, Germany	4928211
吉列锯 0.44 mm	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.590.110.25
手动钻	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.390.130-01
加热板	FMI, Seeheim, Germany	IOW-3704
Hygonorm 手套	Hygi, Telgte, Germany	2706
异氟烷	Abbot, London, UK	Forene
显微镊 155 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD343R
显微剪 120 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	FD013R
小鼠固定针 FixEx L 0.7 mm	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.611.300-10
钻头用针套	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BL911R
持针器	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB078R
Octenisept	Schülke, Norderstedt, Germany	121403
Osirix 软件	Pixmeo SARL, Bernex, Switzerland	-	版本 4.0
医用级氧气	MTI, Ulm, Germany	-
Resolon 5/0	Resorba, Nürnberg, Germany	88143
0.9% 生理盐水	Braun, Melsungen, Germany	3570350
手术刀柄 125 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB073R
剪刀 150 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BC006R
高压灭菌包装封口机	Hawo GmbH, Obrigheim, Germany	HM500
Sterican 27 G	Braun, Melsungen, Germany	4657705
无菌手术刀片 11/15 号	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB511/515
外科手套	Hartmann, Heidenheim, Germany	Peha-micron 9425712
手术无影灯	Maquet SA, Ardon, France	Blue line 80
5 ml 注射器	Braun, Melsungen, Germany	Injekt 4606051V
组织镊 80 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	OC091R
曲马多 25 mg/l	Grünenthal, Aachen, Germany	100mg/ml
Vasofix 安全型留置针	Braun, Melsungen, Germany	4268113S-01
Vicryl 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	V30371
Visdisic 眼膏	Bausch & Lomb, Berlin, Germany	3099559