方法文章

利用系统发育分析研究真核生物基因的起源

DOI：

10.3791/56684

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2018年8月14日

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1Key Laboratory of Three Gorges Regional Plant Genetics and Germplasm Enhancement (CTGU)/Biotechnology Research Center, China Three Gorges University, 2The Institute of Bioinformatics, College of Life Sciences, Anhui Normal University, 3Department of Plant Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4College of Resources & Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文描述了一种基于真核生物SWEET蛋白与原核生物SemiSWEET蛋白序列同源性构建系统发育树的方法。系统发育分析是揭示不同生物类群间同源蛋白或基因进化关系的有力工具。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

系统发育分析利用核苷酸或氨基酸序列或其他参数（如结构域序列和三维结构）构建系统发育树，以展示不同分类单元（分类单位）在分子水平上的进化关系。系统发育分析还可用于研究单个分类单元内部的结构域关系，尤其适用于那些在形态学和生理学上发生显著变化但缺乏化石证据的生物体，这可能是因为这些生物具有漫长的进化历史或化石保存极为稀少。

本文详细描述了一种使用系统发育方法的实验方案，包括利用 Clustal Omega 进行氨基酸序列比对，以及随后采用分子进化遗传学分析软件（MEGA）的最大似然法（ML）和通过 MrBayes 实现的贝叶斯推断法构建系统发育树。为探究真核生物Sugars Will Eventually be Exported Transporters（SWEET）基因的起源，共分析了228个SWEET蛋白，其中包括来自单细胞真核生物的35个SWEET蛋白和来自原核生物的57个SemiSWEET蛋白。有趣的是，SemiSWEET仅存在于原核生物中，而SWEET则存在于真核生物中。采用理论上不同的两种方法构建的系统发育树均一致 表明，首个真核生物SWEET基因可能起源于细菌SemiSWEET基因与古菌SemiSWEET基因的融合。 值得注意的是，尽管系统发育分析有助于解释不同分类单元之间难以甚至无法通过实验手段揭示的内在关系，但在仅基于系统发育分析时应谨慎得出结论。

引言

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DNA 或 RNA 序列携带了决定表型的遗传信息，这些信息可通过生理学和生物化学方法进行分析，或通过形态学及化石证据加以观察。从某种意义上说，遗传信息比评估外部表型更为可靠，因为前者是后者的根本基础。在进化研究中，化石证据非常直接且具有说服力。然而，许多生物体（如微生物）在漫长的地质年代中极难形成化石。因此，来自现存相关生物的分子信息，例如核苷酸序列和氨基酸序列，在探索进化关系方面具有重要价值1。本研究为需要自行构建系统发育树的新手提供了基础系统发育学知识的简要介绍以及易于掌握的操作流程。

DNA（核苷酸）序列和蛋白质（氨基酸）序列均可用于推断同源基因、细胞器甚至生物体之间的系统发育关系2。在进化过程中，DNA序列更易发生改变。相比之下，由于核苷酸序列中的同义突变不会导致氨基酸序列的改变，因此氨基酸序列更为稳定。因此，DNA序列适用于亲缘关系较近的生物体之间同源基因的比较，而氨基酸序列则适用于亲缘关系较远的生物体之间同源基因的比较3。

系统发育分析始于氨基酸或核苷酸序列的比对4 从注释基因组测序数据库中获取5 以 FASTA 格式列出， 即，推定或已表达的蛋....

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方案

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1. 序列比对

  1. 分别在独立文档中收集真核生物SWEET和原核生物SemiSWEET的氨基酸序列，并以FASTA格式列出。通过使用基本局部比对搜索工具（BLAST）在国家生物技术信息中心（NCBI）、欧洲分子生物学实验室（EMBL）和日本DNA数据库（DDBJ）中进行相似性搜索，下载相关序列。
    1. 在示例文件中，收集228条推测的真核生物SWEET蛋白序列（每条包含两个MtN3/saliva结构域，共7个跨膜螺旋）以及57条推测的原核生物SemiSWEET蛋白序列（每条包含一个MtN3/saliva结构域，共3个跨膜螺旋）13。
    2. 为简化流程，从228条推测的SWEET序列中选取35条来自单细胞真核生物的候选SWEET蛋白用于构建系统发育树。这些序列已附上，供读者使用真实数据集进行练习。
  2. 将35条SWEET序列输入Clustal Omega（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）进行比对。
    1. 将FASTA格式的蛋白序列复制粘贴至输入框，或上传FASTA格式的序列文件。在“STEP 1”部分的下拉菜单中点击图标，指定其为 氨基酸序列。
    2. 如有需要，在“STEP 2”部分设置输出格式及其他参数。本研究中，将输出格式设为....

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结果

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系统发育树显示，35个SWEET序列的全部第一个MtN3/唾液酸域聚为一个分支，而SWEET序列的第二个MtN3/唾液酸域则聚为另一个分支。此外，SWEET与SemiSWEET序列的比对结果表明，来自α-变形菌纲（α-Proteobacteria）的一些SemiSWEET与SWEET序列的第一个MtN3/唾液酸域对齐，而来自甲烷杆菌纲（Methanobacteria，古菌）的SemiSWEET则与SWEET序列的第二个MtN3/唾液酸域对齐。这些结果共同提示，含有两个MtN3/唾液酸域的SWEET蛋白可能起源于一种细菌SemiSWEET与一种古菌SemiSWEET在进化过程中的融合事件14。

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讨论

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在生物学研究中，基于核苷酸或氨基酸 序列构建系统发育树的方法正变得越来越普遍8。通常，该过程包括三个关键步骤：序列比对、采用合适的方法或算法对比对后的序列进行评估，以及将计算结果以系统发育树的形式进行可视化。在本研究中，共进行了三轮序列比对：首先，对SWEET蛋白序列（包含第一和第二MtN3/saliva结构域）进行比对；其次，将SWEET蛋白中各个独立的MtN3/saliva结构域序列作为独立分类单元进行收集并联合比对；最后，将SemiSWEET序列与SWEET序列共同进行联合比对。通常情况下，构建系统发育树仅需进行一轮序列比对即可。

在初步阶段，可以从NCBI或其他数据库下载同源序列。如果这些下载的序列注释不完整，可能需要进行筛选。在第一和第二阶段，如果序列格式不正确，则无法启动比对和计算。例如，Clustal Omega将拒绝任何不符合FASTA格式的序列文件。在计算阶段，需注意在使用MEGA进行评估之前，序列长度（包括氨基酸或核苷酸以及连字符）必须相等。

尽管现.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本工作得到国家自然科学基金（31371596）、三峡大学生物技术研究中心（2016KBC04）和中国江苏省自然科学基金（BK20151424）的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Adobe Illustrator由 Adobe Systems Software Ireland Ltd. 开发的图形工具。版权所有 © 2017
BioEdit为 Windows 95/98/NT/2000/XP/7 系统编写的生物序列比对编辑器。版权所有 © Tom Hall
Clustal Omega用于进行氨基酸或核苷酸序列多序列比对的软件包。  http://www.clustal.org/
CorelDRAW一款图形设计软件。版权所有 © 2017 Corel Corporation
FigTree由爱丁堡大学设计的系统发育树图形可视化工具
MEGA分子进化遗传学分析软件 6.0 版 http://www.megasoftware.net/home
MrBayes一种基于贝叶斯推断的系统发育分析工具
NVIDIA一家为游戏和专业市场设计图形处理器（GPU）的公司。版权所有 © 2017 Corporation
PAUP基于最大简约法的系统发育分析软件。David Swofford 开发的程序在多种核苷酸模型下实现了最大似然法
Photoshop由 Adobe Systems Software Ireland Ltd. 开发和发布的位图图形编辑器。版权所有 © 2017
RHYTHM一种基于知识的六螺旋接触预测工具。Charité Berlin – 蛋白质信息学小组 - 版权所有 2007-2009
TMHMM一种用于预测蛋白质中跨膜螺旋的工具。http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
计算机4 GB 内存，Core 2 或更高版本的 CPU，Windows 7 或 Windows 10 操作系统

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nei, M., Kumar, S. Molecular Evolution and Phylogenetics. , Oxford University Press. Oxford. (2000).
  2. Foth, B. J. Phylogenetic analysis to uncover organellar origins of nuclear-encoded genes. Methods Mol Biol. 390, 467-488 (2007).
  3. Baldauf, S. L.

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标签

SWEET Clustal Omega MEGA MrBayes SemiSWEET

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