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方法文章

用于分析神经元内细胞内运输的 Caenorhabditis elegans 固定方法

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DOI：

10.3791/56690

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2017年10月18日

1Frontier Research Institute for Interdisciplinary Sciences and Graduate School of Life Sciences, Tohoku University

本文内容

摘要

秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫是一种研究轴突和细胞内运输的良好模型。在此，我描述了一种实验方案 体内 轴突内运输与鞭毛内运输的记录与分析 秀丽隐杆线虫.

摘要

轴突运输和纤毛内运输（IFT）对轴突和纤毛的形态发生及功能至关重要。驱动蛋白超家族蛋白和动力蛋白分别为介导顺向和逆向运输的分子马达。这些马达以微管网络作为运输轨道。 秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫是一种研究轴突运输和IFT的有力模式生物 体内. 本文描述了一种在活体中观察轴突运输和纤毛内运输（IFT）的实验方案 秀丽隐杆线虫通过使用绿色荧光蛋白（GFP）等荧光蛋白标记货物蛋白，可实现运输中货物的可视化观察。 秀丽隐杆线虫 是透明的，且可在细胞特异性启动子驱动下于特定细胞中表达GFP标记的货物蛋白。活体线虫可通过微珠固定在10%琼脂糖凝胶上，无需杀死或麻醉线虫。在此条件下，可直接在活体线虫的轴突和纤毛中观察货物蛋白的运输过程 秀丽隐杆线虫 无需解剖。通过改造目标蛋白和/或其表达的细胞，该方法可应用于在任何细胞中观察任何货物分子。参与轴突运输和IFT的大多数基本蛋白，例如分子马达和衔接蛋白，在进化上是保守的 秀丽隐杆线虫与其他模式生物相比，突变体在其中更易于获得和维持 秀丽隐杆线虫. 将该方法与多种 秀丽隐杆线虫 突变体有助于阐明轴突运输和纤毛内运输的分子机制。

引言

活细胞成像技术是分析细胞内运输过程的重要工具。在神经细胞生物学中，利用活细胞成像对轴突运输进行分析，对于理解神经元功能和形态发生至关重要1。轴突运输的缺陷与多种神经退行性疾病密切相关2。驱动蛋白超家族蛋白和动力蛋白分别负责轴突运输的顺向（anterograde）和逆向（retrograde）运输1,2。

纤毛是微管网络和运输机制高度发达的另一类细胞区室3蛋白质合成机制并不存在于纤毛内，这意味着纤毛蛋白必须从细胞质运输至纤毛顶端。一种纤毛特异性的驱动蛋白和动力蛋白，分别称为kinesin-2和细胞质dynein-2，负责运输纤毛的组成成分4，这一现象称为鞭毛内运输（intraflagellar transport, IFT）5. IFT功能受损会导致一组称为纤毛病的疾病6因此，通过活细胞成像分析IFT机制对于理解纤毛形成的基本机制及疾病发生过程至关重要。

Caenorhabditis elegans（C. elegans）是研究轴突运输和IFT7,8,9的良好模型。Chlamydomonas 作为模式生物已被广泛用于观察IFT5,6。但由于Chlamydomonas是单细胞生物，难以分析IFT与衰老、神经元功能及行为之间的关系。此外，CRISPR/Cas9等关键的遗传学技术尚未应用于Chlamydomonas。在小鼠和Drosophila等高等模式生物中，轴突运输和IFT的破坏通常会导致致死表型，因为轴突运输和IFT对动物的形态发生和稳态至关重要10,11。以小鼠为例，通常需要进行细胞培养和转染来观察轴突运输和IFT，这需要大量技术经验和较长时间12,13。此外，培养的细胞和细胞系可能会丢失许多重要的生理背景。由于神经系统对线虫的生存并非必需，因此在C. elegans中破坏轴突运输或IFT的突变体通常不会致死7,9,14。由于C. elegans具有透明性，无需解剖即可在活体（in vivo）直接观察轴突运输和IFT，因此很容易观察GFP标记的示踪分子。

有多种方案可用于固定 秀丽隐杆线虫，例如使用微流控装置15，含麻醉剂的琼脂糖垫16，或微珠17麻醉剂的加入可能会抑制神经元中的转运事件15微流控装置方法的一个明显缺点是制备微流控装置并不总是容易的。相比之下，利用琼脂糖垫和微珠进行固定是一种方便且简单的方法，可用于延时成像 秀丽隐杆线虫在此，我描述了这种固定化的基本方案 秀丽隐杆线虫 并可视化轴突运输和IFT 体内 在 秀丽隐杆线虫 与其他方法相比，此处所述方法无需特殊设备，成本更低且操作更为简便。

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方案

1. 样品制备

  1. 使用转基因方法生成感兴趣的 C. elegans 转基因品系18。或者，从 Caenorhabditis 遗传学中心（CGC）获取合适的品系。为观察突触小泡前体的轴突运输，使用转基因品系 wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3]7。为观察纤毛内运输（IFT），获取转基因品系 mnIs17 [osm-6::gfp]19。本方案中将使用这些品系。
    注意：可采用染色体外阵列、基因组整合，甚至 GFP 基因敲入的方式。为降低背景信号，建议使用细胞特异性启动子，而非泛神经元启动子。
    注意：线虫的培养方法在其他方案中有详细描述20。品系在含有 Escherichia coli OP50 食物菌的线虫生长培养基（NGM）平板上（1.7% (w/v) 琼脂糖，50 mM NaCl，0.25% (w/v) 蛋白胨，1 mM CaCl2，5 mg/mL 胆固醇，25 mM KH2PO4，1 mM MgSO4，置于直径 60 mm 的塑料培养皿中）于 20 °C 下维持培养。
  2. 将线虫在 20 °C 的 NGM 平板上培养至任意生命周期阶段。
    注意：可在任意发育阶段观察轴突运输和 IFT。晚 L4 至年轻成虫阶段是良好的阳性对照，因为已有大量文献在这些阶段成功观察到运输事件14,21,22,23。

2. 10% 琼脂糖的制备

注意：许多供应商提供类似产品，如琼脂、琼脂粉和琼脂糖。请使用电泳级琼脂糖（凝胶强度 >1200 g/cm2）。廉价的琼脂粉不适用，因为其形成的凝胶强度不足，无法固定线虫。

  1. 在玻璃管（1.5 cm × 10.5 cm）中将 0.4 g 琼脂糖与 4 mL 蒸馏水（DW）混合。盖上管盖以防止蒸发。
  2. 将玻璃管置于 95 °C 金属浴中加热 90 分钟。同时，另准备一支玻璃管（1.5 cm × 10.5 cm），装满蒸馏水（DW），并保持在 95 °C。将一支巴斯德吸管放入 95 °C 的蒸馏水中（图 1A）。琼脂糖管中会出现大量小气泡，溶液呈浑浊状态。继续加热直至溶液变澄清，然后通过上下吹打混匀，直至琼脂糖溶液均匀透明。
    注意：使用蒸馏水和琼脂糖配制 10% 琼脂糖溶液时，不可使用微波炉加热。微波产生的小气泡会阻碍琼脂糖完全融化。然而，已凝固的 10% 琼脂糖凝胶可方便地通过微波炉重新融化。含有 10% 琼脂糖凝胶的玻璃管可预先配制，并在 4 °C 下保存至少 6 个月。若采用此方式，使用时可用微波炉将储备胶融化，并从本实验方案的第 3 步开始操作。
    注意：琼脂糖若长时间在 95 °C 下孵育，或经历多次凝固与融化循环，其凝固能力会逐渐下降。若出现此情况，应重新配制新的 10% 琼脂糖溶液。

3. 琼脂糖垫的制备

  1. 使用步骤 2.2 中预热好的巴斯德吸管，将 2 滴 10% 琼脂糖置于一块 76 × 22 mm 的载玻片上。
  2. 在琼脂糖液滴凝固前，迅速用另一块 76 × 22 mm2 的载玻片覆盖，如图 1B 所示，并轻压上层载玻片以展平琼脂糖溶液，厚度应为 0.5–1 mm。
  3. 迅速用 95 °C 的去离子水反复吹吸巴斯德吸管，冲洗残留琼脂糖，直至管内溶液完全清除，防止琼脂糖凝胶堵塞吸管。随后将吸管竖直放置于 95 °C 的去离子水中备用。
  4. 静置 1 分钟，待琼脂糖垫形成并变浑浊后，用手将两块载玻片缓慢滑动分离（图 1C）。

4. 线虫的封片

注意：即使微小的线虫运动也会妨碍良好观察。传统上使用左旋咪唑（Levamisole）来抑制线虫在琼脂糖垫上的运动24,25。然而，左旋咪唑会抑制秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的神经元受体，因此可能影响神经元内的运输过程15。使用本文所述的聚苯乙烯微珠是一种良好的替代方法17。

  1. 在配备可滑动镜面透射照明的体视显微镜下，使用铂金丝挑针将约30条表达适当标记物的转基因线虫转移至不含细菌的新NGM平板上。
    注意：铂金丝挑针由铂金丝和巴斯德移液管（5英寸）制成，铂金丝尖端已被压平。铂金丝挑针的制备方法及线虫操作技术详见Wormbook（http://www.wormbook.org）。
  2. 将平板静置1分钟。当线虫在无菌NGM琼脂糖凝胶上移动时，其体表的细菌会自动被清除。
  3. 在琼脂垫上滴加0.5–1.0 µL含2.6%、直径100 nm的聚苯乙烯微球水溶液（图1D）。将10–20条来自无菌NGM平板的线虫转移至微球液滴中，使用铂金丝挑针轻轻滴落并分散线虫，避免虫体相互重叠（图1E）。
  4. 盖上22 × 40 mm2的盖玻片（图1F）。轻轻按压以排除气泡，但避免压碎线虫。样品现已准备好进行成像。
    注意：由于未使用麻醉剂，线虫仅依靠琼脂垫、聚苯乙烯微球和盖玻片之间产生的摩擦力固定。17 若存在喂养细菌和/或过多液体，将削弱摩擦力。
    注意：不同尺寸的盖玻片（例如，22 × 22 mm2、18 × 18 mm2）均可使用。然而，较大的盖玻片可在观察过程中防止浸油或浸水从物镜渗入样品。

5. 观察

注意：适当的成像参数（激光功率、增益、像素合并、 等等。）因显微镜系统和相机的不同而有所差异。此处使用配备旋转盘共聚焦扫描仪和数字CCD相机的宽场显微镜。

  1. 将载物台温度控制设置为 20 °C，或调节室温至 20 °C。
  2. 将样品载玻片置于显微镜载物台上。使用 100 倍物镜（数值孔径 = 1.3 或更高）。
  3. 寻找 图 2A 中所示区域（用于 wyIs251 和轴突运输）或 图 2B 中所示区域（用于 mnIs17 和 IFT）作为阳性对照。其他区域也可进行分析22。
  4. 设置参数（CCD 增益 = 200，像素合并 = 1 或 2，488 nm 激光功率 = 1.0–1.3 mW）。以每秒 4 帧的速度进行延时记录，持续时间最长为 1 分钟。将文件保存为多页 TIFF 格式。
    注意：如果 GFP 信号消失，难以持续观察 GFP::RAB-3 或 OSM-6::GFP 达 30 秒，则说明激光功率过强，应降低激光功率；反之，若未记录到囊泡运动，则说明激光功率过弱，应提高激光功率。
  5. 观察另一条线虫，并重复步骤 5.3 和 5.4。观察时间最长可达 20 分钟，但每条线虫仅应记录一次，以避免光损伤的影响。
    注意：已有研究对线虫进行了至少 20 分钟的观察，未发现显著缺陷7,27,28。更长时间的观察可能可行，但尚未经过测试。神经元死亡的明显标志是神经元形态的改变，例如神经突肿胀。由于在 wyIs251 和 mnIs17 中轴突和树突内均可观察到较弱的 GFP 信号，因此只需观察轴突或树突即可轻松检查神经突形态。神经元形态见 图 2。
  6. 生成视频文件。
    1. 使用 Fiji 软件打开多页 TIFF 文件。进入 文件>打开，然后选择步骤 5.4 中保存的多页 TIFF 文件。
      注意：Fiji 可在 jttps://fiji.sc 下载。ImageJ 及其插件也可用于生成明戈图（kymograph）。若使用此类工具，请遵循所选插件的相关说明。 
    2. 点击 "矩形选择" 按钮（图 3A，箭头），用鼠标绘制矩形以选定感兴趣区域（图 3A 中的黄色矩形）。进入 图像>堆栈>工具>生成子堆栈，并选择包含在视频中的切片编号。子堆栈将被生成。
    3. 通过点击激活子堆栈窗口，进入 图像>调整>亮度/对比度。将弹出用于调整亮度和对比度的窗口。在该窗口中，将顶部滑块（最小值）向右滑动，使背景信号消失；将第二滑块（最大值）向左滑动，使运动的囊泡和颗粒相对于背景清晰可见。
    4. 进入 图像>堆栈>时间戳。由于步骤 5.4 中视频以每秒 4 帧的速度记录，时间间隔为 0.25 秒。因此，在“间隔”栏中输入 "0.25"。
    5. 从文件菜单中选择 另存为>AVI 来生成视频文件（视频 1 和 2）。
      注意：通过使用适当的插件，可将文件保存为其他格式，例如 "mpeg4" 或 "mov" 文件。
  7. 生成明戈图（kymograph）。
    1. 再次使用 FIji 软件打开原始视频文件，并重复步骤 5.6.2 和 5.6.3 以调整亮度和对比度。
    2. 点击 "分段线"（图 3B，箭头）。使用鼠标沿纤毛或轴突绘制分段线（图 3B 中的黄色线）。
    3. 进入 分析>多明戈图>多明戈图（图 3C）。将弹出线宽设置窗口（图 3D）。在线宽窗口中输入 "3"，然后点击确定（图 3D）。
    4. 明戈图窗口将被创建。将图像保存为 TIFF 或 JPEG 格式。

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结果

DA9神经元中的轴突运输
使用 wyIs251 在一条线上，可以同时记录DA9运动神经元中GFP::RAB-3的顺向和逆向轴突运输。DA9神经元近端背侧轴突中顺向和逆向运输的平均速度约为1.8和 2.6 μm/s分别22移动囊泡的数量约为每0.03和0.018个 μm 每秒轴突数量。因此，对于30秒的观察 10 μm 使用100倍镜观察DA9轴突时，可在轴突中观察到约9个和5个移动的囊泡图4 和 视频 1）。如果无法观察到囊泡运动，可能是激光功率过弱。除了长距离运行外，还可以记录囊泡池的短距离运动（视频 1一些囊泡停留在这些囊泡池中，而另一些则从其中解离7,23这些参数可用于监测并分析突变体表型。

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讨论

现有方法的局限性
本文所述方法经过优化，适用于观察轴突运输和纤毛内转运（IFT）等快速事件。因此，固定效果优先于长时间孵育。尽管我们已能够在无明显干扰的情况下持续观察至少20分钟的运输过程，但该方法并不总是适用于需要更长时间观察的缓慢事件，例如轴突伸长和细胞迁移。对于更长时间的观察，需通过降低琼脂糖浓度（即增加含水量以避免干燥，并减少可能造成损伤的压力）来优化实验条件。或者，可采用上述微流控装置15，或使用琼脂糖垫结合麻醉剂固定线虫的方法可能更为合适16，但应仔细评估其潜在的副作用。

方案中的关键步骤
为了实现充分的观察，标记物至关重要。标记物需要被整合到囊泡或颗粒中，并具有足够的亮度。可使用染色体外阵列或整合品系。在DA9神经元中观察突触囊泡前体的轴突运输时，wyIs251品系非常有用7,<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者衷心感谢东北大学的Asako Sugimoto博士提供的有益讨论。wyIs251由斯坦福大学的Kang Shen博士慷慨惠赠。mnIs17由CGC提供，CGC由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助。本研究得到了日本学术振兴会科研费（#17H05010和#16H06536）、第一三共基金会、脑科学基金会以及内藤基金会的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
载玻片（76  x 26 mmMatsunamiS1111
盖玻片（22  x 40 mmMatsunamiC024401
琼脂糖和光318-01195
0.1 微米聚苯乙烯微珠Polysciences#00876
加热块TAITEC0063288-000CTU-mini
显微镜奥林巴斯IX-71宽场显微镜
旋转盘扫描仪横河CSU-X1转盘共聚焦扫描仪 
数码CCD相机滨松光子学C10600-10BORCA-R2 数字CCD相机
物镜（×100，NA 1.4）OlympusUPLSAPO 100XO
巴斯德吸管（5 英寸）IWAKIIK-PAS-5P
玻璃管（直径 1.5 cm × 长 10.5 cm）IWAKI9820TST15-105NP
TV9211: wyIs251Kang Shen 实验室N/A
OTL11 mnIs17参考文献 27，29N/ASP2101 与野生型回交 6 次
体视显微镜卡尔·蔡司435064-9000-000STEMI 508 
镜面透照装置卡尔·蔡司435425-9010-000
铂丝（0.2 mm）Nilaco Corporationm78483501
60 mm 塑料培养皿Falcon#351007
FijiN/AN/Ahttps://fiji.sc/
线虫生长培养基（NGM）  1.7% (w/v) 琼脂糖，50 mM NaCl，0.25% (w/v) 蛋白胨，1 mM CaCl₂，5 mg/mL 胆固醇，25 mM KH₂PO₄，1 mM MgSO₄ 

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