在昆虫细胞（sf9）中瞬时表达外源基因用于蛋白质功能检测

摘要

本方案描述了一种热激诱导的蛋白表达系统（pDHsp/V5-His/sf9细胞系统），可用于在昆虫细胞中表达外源蛋白，或评估外源蛋白及其截短氨基酸序列的抗凋亡活性。

摘要

瞬时基因表达系统是利用杆状病毒进行蛋白质功能分析的最重要技术之一 体外 细胞培养系统。该系统被开发用于在杆状病毒启动子控制下，在瞬时表达质粒中表达外源基因。此外，该系统还可应用于杆状病毒本身或外源蛋白的功能分析。目前最广泛使用且商业化程度最高的瞬时基因表达系统是基于杆状病毒早期立即基因（IE）启动子构建的。 Orgyia pseudotsugata 多角体病毒（OpMNPV）。然而，外源基因在昆虫细胞中的表达水平较低。因此，构建了一种瞬时基因表达系统以提高蛋白表达水平。在该系统中，重组质粒被构建为包含由特定启动子调控的目标序列 果蝇 热激70（Dhsp70）启动子。本方案介绍了基于热激的pDHsp/V5-His（V5表位含6个组氨酸）的应用。草地贪夜蛾 细胞（sf9细胞）系统；该系统不仅可用于基因表达，还可用于评估候选蛋白在昆虫细胞中的抗凋亡活性。此外，该系统既可在昆虫细胞中转染单个重组质粒，也可共转染两个可能具有功能拮抗作用的重组质粒。本方案展示了该系统的高效性，并提供了该技术的实际应用案例。

引言

目前常用于蛋白质表达的两种系统分别为原核蛋白表达系统（Escherichia coli 基因表达系统）和真核蛋白表达系统。其中一种广泛应用的真核蛋白表达系统是杆状病毒表达载体系统（BEVS）¹。杆状病毒最初被用作全球农业和林业害虫的生物防治制剂。在过去的几十年中，杆状病毒也被开发为用于蛋白质表达的生物技术工具。杆状病毒的基因组由双链环状DNA和包膜核衣壳组成²。迄今为止，已有超过七十八种杆状病毒分离株完成测序³。根据杆状病毒在宿主昆虫细胞中基因表达的时间级联特征，其基因转录可分为四个时序阶段，即即时早期、延迟早期、晚期和极晚期基因⁴。

BEVS被设计为利用极晚期基因启动子（即，多面体或p10启动子）驱动目标基因的表达，而重组杆状病毒则通过同源重组方法构建。利用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达外源蛋白，在翻译后修饰方面与哺乳动物细胞类似（适用于糖蛋白的生产）。因此，杆状病毒系统已被广泛应用^5,6,7然而，一个局限在于昆虫细胞中存在不同的N-糖基化途径⁷.

因此，开发了一种新的杆状病毒表达系统——瞬时基因表达系统。该系统利用杆状病毒早期立即启动子（ie-1 启动子）在昆虫细胞中驱动外源基因的表达。通过该系统，目标蛋白可在 ie-1 启动子的调控下迅速表达，同时对昆虫细胞中的 N-糖基化途径进行改造，从而获得更优的 N-连接寡糖⁷。此外，杆状病毒早期立即基因由宿主细胞的 RNA 聚合酶 II 转录，无需任何病毒因子即可激活⁴，因此外源蛋白可在短时间内于昆虫细胞中实现表达。迄今为止，瞬时基因表达系统已成为在杆状病毒 体外 细胞培养体系中进行蛋白功能分析的最重要技术之一。该系统可用于分析杆状病毒蛋白或外源蛋白的功能。目前市面上一种可获得的瞬时基因表达系统，基于舞毒蛾多角体核型多角体病毒（Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus, OpMNPV）的早期立即基因（IE）启动子（OpIE2 和 OpIE1 启动子）构建而成。

然而，当使用基于OpIE启动子的瞬时基因表达系统时，外源基因在昆虫细胞中的表达水平较低仍然是一个问题^8,9,10因此，基于该启动子构建了另一种瞬时基因表达系统 果蝇 热休克蛋白70（hsp70）基因^8,9热休克诱导下，hsp70 启动子在昆虫细胞中的工作效率高于杆状病毒 IE 启动子¹⁰在此系统中，目标基因在驱动作用下表达 果蝇 热休克70（Dhsp70）启动子。通过基于PCR的克隆方法，可将外源基因轻松克隆至该瞬时表达质粒中。此外，可通过热休克诱导实现对基因表达时间的控制。

在本报告中，我们采用热激介导的瞬时蛋白表达系统，表达杆状病毒基因（Lymantria xylina 核多角体病毒的凋亡抑制因子3（iap3））的三种不同截短形式，并将所表达的蛋白进一步用于抗凋亡活性分析。该系统不仅能够快速表达外源蛋白，还可用于sf9细胞中蛋白抗凋亡活性的评估，同时具备应用于其他蛋白活性检测的潜力。

方案

1. 准备工作

1. 昆虫细胞培养
   1. 准备 50 mL 细胞培养基。向无血清细胞培养基（不含 FBS 或抗生素）中加入 500 µL 抗生素（两性霉素 B = 0.25 µg/mL，青霉素 = 100 单位/mL，链霉素 = 100 µg/mL）和 5 mL 热灭活胎牛血清。
      注意：使用前将胎牛血清在 65 °C 水浴中加热 30 分钟。
   2. 维持斜纹夜蛾（Spodoptera frugiperda，鳞翅目：夜蛾科）sf9 昆虫细胞。通过轻轻摇动 25 cm² 细胞培养瓶使约 80% 的细胞脱落，并在光学显微镜下观察。然后将 50% 的细胞悬液转移至新的 25 cm² 细胞培养瓶中，在室温下静置 15 分钟使细胞贴壁。更换为 5 mL 新鲜细胞培养基，并在 28 °C 培养箱中培养。根据细胞生长情况，每 2 至 3 天传代一次。
2. 细胞转染用质粒的制备
   1. 采用基于 PCR 的克隆方法¹¹，将目标 DNA 片段（例如，Lymantria xylina 多角体病毒（LyxyMNPV）iap3 基因及其缺失突变体）插入 pDHsp/V5-His 载体中。使用 PCR Master Mix（2X）和 pDhsp-F2/Op-IE2R 引物组通过菌落 PCR 检测转化菌落的生长情况。通过商业测序服务确认质粒序列。
      注意：表 1 列出了用于 PCR 的引物及其对应的构建体。
   2. 分别将含有上述质粒构建体（步骤 1.2）的单个测序正确的细菌菌落接种于 200 mL 含相应抗生素（50 µg/mL）的 LB 培养基中进行培养。
   3. 按照制造商说明书¹²，使用 Midi 质粒提取试剂盒从培养的 E. coli 中提取质粒。
3. 通过将 1.5 mL 细胞培养基与 8.5 mL 无血清细胞培养基混合，制备铺板培养基。
4. 向 10 mL 细胞培养基中加入 1.5 µL 放线菌素 D（ActD）储备液（1 mg/mL），配制放线菌素 D（ActD）细胞培养基（终浓度 = 150 ng/mL）。4 °C 保存。

2. 蛋白质瞬时表达

1. 细胞接种
   1. 通过振摇培养瓶收获sf9细胞，将细胞悬液倒入50 mL离心管中，用P10移液器取10 µL转移至血细胞计数板。在光学显微镜下计数细胞数量。
   2. 接种 3 × 10⁵ 将sf9细胞接种至24孔板的每孔中，室温孵育15分钟。弃去原培养基，更换为0.5 mL铺板培养基。
2. 质粒转染
   1. 稀释细胞转染试剂：将8 µL细胞转染试剂加入100 µL无血清细胞培养基中，涡旋混匀1分钟 s.
   2. 加入2 µg质粒DNA（pDHsp70-Ac-P35/V5-His或pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His或pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His或pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-His）至100 µL无血清细胞培养基中，涡旋混匀1秒图2).
   3. 将稀释的质粒DNA与稀释的细胞转染试剂（210 µL）混合，涡旋振荡1秒以充分混匀，室温孵育30分钟。
   4. 用 P1000 移液器将 210 µL DNA 转染试剂混合物逐滴加入细胞中。在 28 °C 下孵育 5 小时。
   5. 使用P1000移液器将铺板培养基更换为0.5 mL细胞培养基。用封口膜密封24孔板，于28 °C孵育细胞16 h。
3. 热激转染后的细胞：将培养板置于42 °C水浴中（漂浮于水面），热激30分钟，然后将24孔板放回28 °C培养箱中。
4. 蛋白表达检测
   1. 热激1小时或5小时后，用0.5 mL 1x缓冲液洗涤细胞 用 PBS 缓冲液短暂洗涤三次。
      注意：将10倍浓缩液稀释 将1 mL 10x PBS缓冲液加入适量水中，稀释至1x PBS缓冲液 PBS 缓冲液至 9 mL 灭菌 ddH₂O₂O
   2. 用40 µL的1x裂解细胞 通过上下吹打混匀SDS上样缓冲液。
      注意：将4倍浓缩液稀释 SDS上样缓冲液，通过混合30 µL的1x PBS缓冲液和10 µL的4x SDS上样缓冲液
   3. 将蛋白质样品在98 °C的加热块中加热10分钟，离心1分钟，然后置于冰上，用于Western blot检测。
   4. Western blot 实验
      按照 Eslami 和 Lujan 的 Western blot 实验步骤进行操作¹³运行SDS-PAGE凝胶¹⁴：一块凝胶进行考马斯亮蓝染色（作为上样对照，用于检测各泳道中蛋白样品上样量是否相等），另一块进行Western blot检测，依据Eslami和Lujan的方法¹³.
   5. 使用兔抗V5抗体（5 mg/mL）（按1:5000比例稀释于TBST缓冲液中，工作浓度为1 µg/mL）和辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（0.8 mg/mL）（按1:10000比例稀释于TBST缓冲液中，工作浓度为0.08 µg/mL）检测V5标签融合蛋白。
      注意： 将聚丙烯酰胺的百分比调整为17.5%，当目标蛋白分子量为 <17 kDa

3. 抗凋亡活性检测

1. 基因诱导细胞凋亡：重复步骤2.1至2.3的操作。共转染1 µg含凋亡诱导基因的pDHsp/D-rpr/FLAG-His质粒DNA与1 µg质粒DNA [分别为pDHsp70/V5-His载体（阴性对照）、pDHsp70-Ac-P35/V5-His（阳性对照）、pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His、pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His或pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-His]。热激处理5小时后，进行细胞活力检测图2).
2. 化学诱导细胞凋亡：重复上述2.1至2.3步骤。在步骤2.1.2中，接种1 × 10⁵个细胞/孔⁶ 将sf9细胞接种至6孔板的每个孔中。每孔转染4 µg质粒DNA [分别为pDHsp70/V5-His载体（阴性对照）、pDHsp70-Ac-P35/V5-His（阳性对照）、pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His、pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His或pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-His]。热激后5 h，用2 mL放线菌素D细胞培养液处理sf9细胞，持续16 h，随后进行细胞活力检测。图2).
   注意： 覆盖一个所需的最小体积  6孔板每孔的体积为1 mL。
3. 重复进行上述抗凋亡活性检测实验，包括3.1和3.2步骤，每组设三个重复。

4. 细胞活力检测

1. 用移液管加入 1 mL 1× PBS 缓冲液洗涤处理后的细胞，每次 1 分钟，共洗涤 3 次。用移液管吹打重悬细胞于 1 mL 含 0.04% 台盼蓝的 1× PBS 缓冲液中，室温染色 3 分钟。将细胞悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。
   注意：通过将 9 mL 1× PBS 缓冲液与 1 mL 0.4% 台盼蓝溶液混合，稀释得到 0.04% 台盼蓝工作液。
2. 用 P10 移液器将 10 µL 台盼蓝染色的细胞悬液转移至血细胞计数板，在光学显微镜下计数有活力的完整细胞。
3. 统计分析
   1. 对记录的数据进行计算，并以所有计数结果的平均值 ± 标准差（S.D.）表示。
   2. 使用 Microsoft Excel 软件进行 Student 双尾 t 检验分析数据。将统计学显著性定义为 P 值 <0.05。

结果

基于热激诱导的pDHsp/V5-His/Spodoptera frugiperda细胞（sf9细胞）表达系统，在sf9细胞中过表达了来自LyxyMNPV的Ly-IAP3全长蛋白及其另外两种截短形式（BIR结构域和RING结构域）。pDHsp/V5-His载体包含一个来自Drosophila的热激蛋白启动子，该启动子在42 °C条件下利用细胞内的转录因子和翻译系统驱动下游基因的表达（图1）^8,9,11。完整的实验技术流程见图2。在热激处理1小时或5小时后，收集细胞并用蛋白样品缓冲液裂解，进行Western印迹分析以确认蛋白表达情况。结果表明，在转染后的细胞中，无论是在热激后1小时还是5小时，均可检测到全长蛋白AC-P35、Ly-IAP3...

讨论

基于热激的pDHsp/V5-His/sf9细胞系统概念最初由Clem提出 等 1994年⁸. 杆状病毒基因启动子的比较（IE1）和 果蝇 hsp70 表明 hsp70 在蚊虫细胞中具有更高的效率¹⁰此外，由于采用热激诱导，可在热激处理后精确控制蛋白的表达时间。该系统随后被应用于虾和核型多角体病毒（NPV）IAP蛋白的功能分析。^9,11在本实验方案中，共使用了6种质粒构建体：其中三种（pDHsp/V5-His、pDHsp/Ac-p35/V5-His 和 pDHsp/D-rpr/FLAG-His）由 Jian-Horng Leu 提供⁹，另外三个构建体（pDHsp-iap3/V5-His、pDHsp-iap3-BIR/V5-His 和 pDHsp-iap3-RING/V5-His）由 Nai 构建 等

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗生素-抗真菌素，100X	Gibco	15240-062	用于昆虫细胞培养
认证胎牛血清	Bioind	04-001-1A
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher	10902096	无血清细胞培养基
Sf9 细胞	ATCC	CRL-1711
25 cm² 细胞培养瓶	Nunc, Thermo Fisher	156340
倒置光学显微镜	WHITED	WHITED WI-400
RBC HIT 感受态细胞	Bioman	RH618-J80	Escherichia coli (DH5α)
LB 肉汤（Miller 配方）	Bioman	LBL407
细菌级琼脂	Bioman	AGR001
Zeocin	Invitrogen	ant-zn-1	筛选抗生素
PCR Master Mix (2X)	ThermoFisher	K0171
Geneaid 中量质粒提取试剂盒（无内毒素）	Geneaid	PIE25
放线菌素 D	SIGMA	A9415
Corning 50 mL 离心管	SIGMA	CLS430829-500EA	50 mL 管
血细胞计数板	Gizmo Supply Co	B-CNT-SLDE-V2
24 孔多孔板	Nunc, Thermo Fisher	142475	24 孔板
Cellfectin II 试剂	Thermo Fisher	10362100	细胞转染试剂
PBS-磷酸盐缓冲液 (10X) pH 7.4	Thermo Fisher	AM9624
4×SDS 上样缓冲液	Bioman	P1001
Immobilon-P（PVDF 印迹膜）	Merck Milipore	IPVH00010	PVDF 膜
Mini Trans-Blot 转印系统	BIO-RED	1703930	印迹装置
丽春红 S 溶液	SIGMA	6226-79-5
Anti-V5	SIGMA	V8137	兔抗 V5 抗体
辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG	Jackson	111-035-003
Tween 20	Merck	817072
6 孔多孔板	Nunc, Thermo Fisher	145380
0.4% 台盼蓝溶液	AMRESCO	K940-100ML
P10 移液器	Gilson	F144802
P1000 移液器	Gilson	F123602
封口膜	Symbio	PPS7	24 孔板封口膜 (19 mm×36 M)