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下腔静脉狭窄：一种深静脉血栓的小鼠模型

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DOI：

10.3791/56697

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2017年12月22日

 , 
1Institute of Cardiovascular Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham

本文内容

摘要

本文描述了下腔静脉狭窄作为深静脉血栓形成的小鼠模型。该模型可重现血流受限这一人类静脉血栓形成的主要诱因之一。

摘要

深静脉血栓形成（DVT）及其严重的并发症肺栓塞是一种具有高死亡率的严重健康问题。静脉中血栓形成的机制仍不明确。缺乏活动（例如，术后或长途飞行后）是导致DVT的主要因素之一。缺乏活动所引起的病理生理后果是静脉瓣膜处的血流停滞。本文描述了一种模拟此类血流紊乱作为促血栓形成因素的模型。在该模型中，通过在下腔静脉（IVC）造成部分血流受限（狭窄）来实现。将IVC管腔闭塞约90%并维持48小时，可诱导形成在结构上与人类血栓相似的血栓。其相似性包括：i）血栓大部分呈红色，即主要由红细胞和纤维蛋白组成；ii）存在白色部分（Zahn线）；iii）内皮单层未剥脱；iv）血浆D-二聚体水平升高；v）可使用低分子量肝素预防血栓形成。该模型的局限性包括血栓大小存在变异性，以及一定比例的野生型小鼠（0–35%）可能不形成血栓。除了肉眼观察和测量外，还可采用超声成像等非侵入性技术对血栓进行可视化，从而监测血栓发展的动态过程。在较短时间点（1–6小时），可应用活体显微技术直接观察血栓形成前的事件（例如，细胞向血管壁的募集）。全球多个研究团队已使用该方法，揭示了DVT起始的基本机制，并鉴定了可能有助于其预防的潜在靶点。

引言

深静脉血栓形成（DVT）是指深静脉内血栓的形成，通常（但不仅限于）发生在下肢。深静脉血栓形成与肺栓塞（PE）合称为静脉血栓栓塞症（VTE），在美国每年约有90万人发病，是一种严重的健康问题和经济负担1,2。肺栓塞是深静脉血栓形成的一种并发症，当血栓从原发部位脱落并到达肺部时发生，可能导致呼吸功能不全甚至死亡。静脉血栓栓塞症导致的死亡人数超过艾滋病、乳腺癌和交通事故死亡人数的总和3。

除已知原因（如癌症或创伤）外，导致深静脉血栓形成（DVT）的主要因素是缺乏活动能力 4,5这可能由手术（尤其是骨科手术）、瘫痪、长途飞行或其他原因引起。静脉中的血流依赖于肌肉泵的作用，因此肢体固定会导致静脉瓣膜处血流停滞，进而引发血栓形成。本文所述方法的目的在于模拟此类血流紊乱情况6,7下腔静脉（IVC）的部分血流受限可模拟人体静脉瓣膜所形成的条件，并导致生成在结构上与人体血栓相似的血栓6血栓的大部分呈红色，由红细胞、纤维蛋白以及掺入的血小板组成。血栓具有较小的部分 "白色部分" 富含血小板的（图1），其形态类似于 "Zahn线" 在人体静脉血栓中已有描述。血栓的两部分均含有中性粒细胞8，是首批被募集到未来血栓形成部位的细胞之一6,9红区的中性粒细胞释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），而白区的中性粒细胞似乎缺乏NETs8与人类深静脉血栓形成（DVT）类似，小鼠血栓形成也伴有血浆D-二聚体水平升高（图2）。低分子量肝素（依诺肝素）在患者中用于预防深静脉血栓形成，同样也可在小鼠中预防血栓形成。该方法的一个重要优势在于无需内皮剥脱9，这是人类深静脉血栓形成（DVT）的特征10这一特点使得下腔静脉狭窄模型相较于三氯化铁诱导血栓形成模型在临床上更具相关性，因为后者会引起内皮剥脱，且形成的血栓主要由血小板构成。11,12,13多个研究团队更倾向于采用下腔静脉完全阻断的模型14,15,16与狭窄不同，狭窄时血管内仍维持一定的残余血流，而停滞的施加则完全阻断血流，从而限制了全身给药物质到达血栓部位的可及性。此外，由狭窄和停滞所诱发血栓形成的潜在机制似乎也不同：狭窄会导致局部炎症反应（内皮细胞活化、Weibel-Palade小体内容物释放、免疫细胞和血小板募集至血管壁），进而引起 "免疫性血栓形成"6,9,17而淤滞似乎主要通过组织因子及其他与凝血和纤溶相关机制诱导血栓形成18,19,20因此，尽管狭窄模型和血流停滞模型的机制可能存在一定重叠，二者仍反映了静脉血栓形成过程中略有不同的方面。深静脉血栓的电解损伤下腔静脉模型（EIM）21,22 仅部分阻塞血管壁的血栓形成。因此，该模型适用于检测不同药物全身给药对血栓生长的影响。然而，该模型需破坏下腔静脉（IVC）壁的完整性（通过针头插入）并利用电流诱导血栓形成，其病理生理学相关性至少存在争议。

方案

所有动物实验程序均经动物福利伦理审查委员会和英国英国内政部（英国，项目许可证 40/3745）批准。实验使用 C57BL/6 背景的小鼠，年龄为 8 至 12 周，体重为 19 至 25 克，雌雄均有。

1. 动物麻醉

  1. 将小鼠放入诱导室，使用5%异氟烷与100%氧气的混合气体诱导麻醉，氧流量设为0.5 L/min。待小鼠完全停止活动且呼吸频率显著减慢后进行下一步。
  2. 将小鼠从诱导室中取出，使用电动剃毛器剃除腹部毛发。应尽可能彻底清除腹部毛发，以避免腹腔受到污染。
  3. 将小鼠置于仰卧位，将其鼻部置入连接麻醉系统的鼻锥中。将异氟烷浓度下调至2–3%（具体浓度可能因个体差异略有不同）。确保动物处于睡眠状态，呼吸频率低于正常水平，但避免出现喘息。若出现喘息，应将异氟烷浓度降低0.5%。
    1. 检查趾反射以确认麻醉效果，仅在反射呈阴性时开始手术。在小鼠眼部涂抹兽用眼膏 ，以防角膜干燥。
  4. 在小鼠腹部涂抹抗菌溶液（1% 洗必泰），使用无菌棉签以避免手术区域再次污染的方式擦拭（例如，由内向外作环形擦拭）。重复操作3次。

2. 下腔静脉狭窄的应用及小鼠恢复

注意：所有仪器以及材料（棉签、纱布、生理盐水） 等等。) 任何接触手术区域的物品必须无菌。操作者在手术前必须刷手消毒，并在手术过程中佩戴无菌手套和无菌手术衣。显微镜手柄应用无菌铝箔包裹。

  1. 在手术前及整个实验期间，对小鼠进行镇痛处理。例如，在手术前30分钟皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡，之后每12小时给药一次，直至动物被实施安乐死。由于该方法中血栓形成过程类似于无菌性炎症，应避免使用抗炎药物作为术前用药。
  2. 用无菌手术巾覆盖小鼠，并在手术部位处剪开一小孔。使用剪刀沿腹中线自胸骨下方1.5 cm处向下做切口。用棉签将肠管推向小鼠左侧，并用浸有温热（37 °C）生理盐水的无菌纱布覆盖，以防干燥。
  3. 从小鼠下腔静脉（IVC）与左肾静脉汇合处向尾侧方向辨认下腔静脉及其侧支（可能有0、1或2条）。使用7-0惰性Prolene缝线，尽可能靠近下腔静脉结扎所有可见的侧支血管。
    1. 尽量不要直接用镊子夹持侧支血管，而应一手用镊子夹住其周围脂肪组织将其提起，另一手用镊子在血管下方分离出一个通道。不要闭合回流支。
  4. 用镊子夹住周围组织，将下腔静脉向上并向左牵拉，使下腔静脉与主动脉之间在下腔静脉与左肾静脉夹角处产生张力。需注意，即使在该位置下方2–3 mm处（向尾侧方向），也几乎无法将主动脉与下腔静脉完全分离。
  5. 用右手镊子尖端做分离动作，在主动脉与下腔静脉之间制造一个小孔。需注意，操作次数越多，损伤血管的风险越高。理想情况下，应将操作次数控制在3–5次以内。
  6. 准备一段长约2 cm的7-0惰性Prolene缝线，将其放置于小鼠腹腔内操作者左手侧靠近下腔静脉的位置。
  7. 再次将下腔静脉向上并向左牵拉。将右手镊子尖端插入主动脉与下腔静脉之间的小孔，使镊尖从下腔静脉另一侧穿出。取缝线并将其从孔中拉回（图3A）。
  8. 用缝线打一个临时结，但暂不收紧。将一根弯成钩状的30G针头（"间隔物"）置入结中，然后收紧结扎（图3B）。
  9. 取出间隔物（图3C）。
  10. 用棉签将肠管复位回腹腔，并在腹腔内均匀分布。
  11. 使用6-0薇乔缝线连续缝合腹膜，首尾两端均以打结方式闭合。
  12. 使用金属钉皮钉闭合皮肤。
  13. 皮下注射0.5 mL温热（37 °C）葡萄糖生理盐水，以恢复机体液体平衡。
  14. 将小鼠放入单独的笼子中，置于温暖（25 °C）的环境或温控室，并在笼内提供食物和凝胶水。观察直至小鼠完全恢复（通常约1小时）。

结果

本文描述了一种通过下腔静脉（IVC）血流紊乱诱导深静脉血栓（DVT）的动物模型。在下腔静脉诱导狭窄可引发血流紊乱和淤滞，一段时间后（本实验为48小时）导致血栓形成，其结构与人类DVT血栓相似（图1A）。下腔静脉内血栓的存在可通过肉眼轻易观察到（图1B）。该模型与人类DVT的一个重要相似之处在于血浆D-二聚体水平升高（图2）。D-二聚体是纤维蛋白降解的产物，其在血液中的存在提示正在进行的血栓形成过程。

该模型在图3A-C中逐步展示。首先仔细暴露下腔静脉（IVC），在下腔静脉与主动脉之间打一个小孔，并将一根缝线（Prolene 7-0）从小孔中穿过下腔静脉下方。然后在支撑物（30G针头，图3D）上用缝线结扎下腔静脉，之后移除支撑物。该操作可实现下腔静脉管腔约90%的闭合，保留10%的通畅部分。这可确保血流停滞，最终导致血栓形成。

图4展示了该模型的主要缺点，即血栓大小的变异性。所有这些血栓均来自同一实验，该实验使用来源、年龄和体重相近的野生型雄性小鼠进行。尽管所有小鼠均形成了血栓（血栓形成发生率为100%），但其血栓大小存在明显差异，变化范围较广。

红肌与白肌组织对比；标本A和B的解剖片段；解剖示意图。
图1： 限制/狭窄48小时后的代表性血栓。 (A) 下腔静脉（IVC）狭窄48小时后的典型血栓。注意红色部分（富含红细胞）和白色部分（富含血小板）。(B) 有（左侧）或无（右侧）血栓的下腔静脉（IVC）。比例尺 = 2 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

术后D-二聚体水平，折线图，时间与浓度，术后趋势分析。
图 2：应用下腔静脉狭窄术后血浆D-二聚体水平升高。对小鼠实施下腔静脉（IVC）狭窄手术。在指定时间点采集血液样本，按1:9比例加入3.8%枸橼酸钠稳定抗凝，经离心（2,300 × g，5分钟）制备血浆，并根据试剂盒说明书使用ELISA试剂盒测定D-二聚体水平。圆形符号代表假手术小鼠，叉形符号代表下腔静脉狭窄小鼠。请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠模型血管闭塞实验；IVC、LRV可视化；血栓形成位置。
图 3： 小鼠深静脉血栓形成（DVT）模型中下腔静脉（IVC）的血流受限/狭窄。 展示了模型的连续阶段。（A）在 IVC 与主动脉之间打孔，并将缝线穿过该孔围绕 IVC 缠绕。（B）在支撑物（30 G 针头）上打结。（C）移除支撑物：在关闭腹腔前外科医生所见的最终视野。虚线黄线标示 IVC 的位置。LRV 表示左肾静脉。比例尺 = 0.2 mm。（D）支撑物（30 G 针头）。比例尺 = 2 mm。 请点击此处查看该图的高清版本。

DNA→RNA 翻译；样本分析；实验样本、组织形态学观察。
图 4．血栓大小的变异性。
小鼠接受 48 小时下腔静脉（IVC）狭窄处理。图中显示的是同一实验中获得的血栓。比例尺为 2 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍了一种下腔静脉（IVC）狭窄模型的实验方案，该模型可模拟深静脉血栓形成（DVT）的主要诱发因素——血流紊乱。在C57BL/6小鼠中，IVC狭窄可在48小时内诱导65–100%的小鼠形成血栓，或在2–6小时内诱导25–50%的小鼠形成血栓6,8,23（Brill A，未发表数据，2016年）。该方法的一个主要局限性是血栓大小存在变异性24（图4），这种变异性在短期（6小时）和长期（48小时）IVC狭窄后均可观察到。尽管实验条件（如间隔物、麻醉等）保持一致，但造成这种变异性的原因尚不明确，可能与小鼠个体间的解剖学差异（如下腔静脉宽度、侧支和背支的数量及位置）有关。由于血栓大小的变异性，血栓形成发生率（形成血栓的小鼠百分比）成为主要的观察指标。血栓形成发生率可通过列联表和Fisher精确检验进行比较。其中一项实验为例外情况：在注射抗podoplanin抑制性抗体后，观察到血栓形成发生率相同但血栓体积减小的现象7。

该方法在研究静脉血栓形成起始过程时尤为有用，可用于探究血管壁内的早期事件，例如细胞募集，这些最终将导致血栓形成。利用该模型可评估药物的促血栓或抗血栓效应，其中血栓发生率是主要的观测指标。若需揭示抗血栓表型，可采用48小时的狭窄处理；若预期出现促血栓表型，则可使用6小时的狭窄处理。此外，还可对血栓及周围下腔静脉壁进行组织学分析。

关于是否应结扎侧支血管还是保持其通畅，目前仍无定论。有研究显示，结扎侧支血管并不会增加血栓的大小，且当侧支血管距离下腔静脉结扎部位小于1.5 mm时，血栓的形成会受到显著抑制25。关闭侧支血管可能引起其内皮损伤，并延长手术时间26。在我们的实验中，若不关闭侧支血管，血栓形成的发生率会显著降低（在狭窄48小时后降至10–30%；Brill，未发表），因此我们对所有可见的侧支血管均进行结扎。

理想情况下，应使用同窝出生的小鼠作为对照，因为即使背景相同但来源不同的小鼠，其血栓形成的发生率也可能存在轻微差异。如果研究深静脉血栓（DVT）本身对任何参数（例如生化指标）的影响，应使用假手术动物作为对照。假手术小鼠接受相同的手术操作，但下腔静脉周围的结扎线松扎并保留在原位，不造成狭窄。

本方案中最常见的错误（关键步骤）是在分离主动脉和下腔静脉时，未精确位于血管之间的夹角处，而是略偏低，这通常会导致出血。当发生大出血时，小鼠很难良好恢复，建议停止实验并对动物实施安乐死。正常情况下，小鼠恢复良好，能在笼内活动，且体重无明显下降。我们建议使用体重超过20 g的雄性和雌性小鼠，并在手术后将动物（尤其是雄性）单独饲养至实验结束，以避免打斗和受伤。已有文献报道，在另一种（电解损伤）深静脉血栓（DVT）模型中，雄性小鼠形成的血栓大于雌性小鼠27。然而，我们对数据的分析并未发现雄性和雌性小鼠在血栓形成率方面存在显著差异（Brill，未发表）。因此，鼓励研究人员在两种性别的小鼠中均开展下腔静脉狭窄模型实验。

在较长时间的实验（一周或更长）中，缝线或钉合处的松脱无法完全排除。因此，应每天至少检查小鼠两次，特别注意缝合部位的完整性，并密切观察笼内垫料上是否出现血迹。

需要注意的是，与其他动物模型一样，下腔静脉狭窄在向人类转化方面也存在一定的局限性。例如，小鼠的下腔静脉没有瓣膜，而人类的深静脉血栓（DVT）通常在静脉瓣内形成。此外，人类为直立脊柱方向，肌肉泵是促进静脉血流的重要机制；相比之下，小鼠为水平脊柱方向，肌肉泵在促进血液回流至心脏过程中不起作用。在将小鼠实验数据转化为人类疾病研究时，应充分考虑这些局限性。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由英国心脏基金会 (PG/13/60/30406) 和伯明翰大学资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
C57BL/6小鼠查尔斯河实验室8至10周龄，两性均有
剪刀WPI15922
剪刀WPI14003
Dumont 5/45 镊子FST11251-35
7-0 Prolene 缝线EthiconW8725
6-0 Vicryl 缝线EthiconW9981
棉签Spar
Millswabs 无菌棉签 米尔普莱奇兽医 611950
铺巾克鲁斯141765
葡萄糖盐水-Aqupharm3动物护理XVD589
透明 H20 HydroGel 98% 无菌水 Clearh2o
布托啡诺国家兽医用品公司
异氟烷蒸发器全身麻醉服务
IsoFlo 100% W/W 吸入用蒸气，液体国家兽医用品公司
灭菌器 Steri350Inotech
显微镜 Olympus SZX10奥林巴斯

参考文献

  1. Heit, J. A. The epidemiology of venous thromboembolism in the community. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (3), 370-372 (2008).
  2. Huang, W., Goldberg, R. J., Anderson, F. A., Kiefe, C. I., Spencer, F. A. Secular trends in occurrence of acute venous thromboembolism: the Worcester VTE study (1985-2009). Am J Med. 127 (9), 829-839 (2014).
  3. House of Commons Health Care Committee. The Prevention of Venous Thromboembolism in Hospitalised patients. The House of Commons. , (2005).
  4. Kuipers, S., et al. Travel and venous thrombosis: a systematic review. J Intern Med. 262 (6), 615-634 (2007).
  5. Lopez, J. A., Chen, J. Pathophysiology of venous thrombosis. Thromb Res. 123, Suppl 4 30-34 (2009).
  6. Brill, A., et al. von Willebrand factor-mediated platelet adhesion is critical for deep vein thrombosis in mouse models. Blood. 117 (4), 1400-1407 (2011).
  7. Payne, H., Ponomaryov, T., Watson, S. P., Brill, A. Mice with a deficiency in CLEC-2 are protected against deep vein thrombosis. Blood. 129 (14), 2013-2020 (2017).
  8. Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
  9. von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
  10. Sevitt, S. The structure and growth of valve-pocket thrombi in femoral veins. J Clin Pathol. 27 (7), 517-528 (1974).
  11. Witsch, T., et al. A novel hollow and perforated flexible wire allows the safe and effective local application of thrombolytic therapy in a mouse model of deep vein thrombosis. J Thromb Thrombolysis. 37 (4), 450-454 (2014).
  12. Shaya, S. A., et al. Comparison of the effect of dabigatran and dalteparin on thrombus stability in a murine model of venous thromboembolism. J Thromb Haemost. 14 (1), 143-152 (2016).
  13. Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. J Clin Invest. 106 (3), 385-392 (2000).
  14. Wrobleski, S. K., Farris, D. M., Diaz, J. A., Myers, D. D., Wakefield, T. W. Mouse complete stasis model of inferior vena cava thrombosis. J Vis Exp. (52), (2011).
  15. Diaz, J. A., Farris, D. M., Wrobleski, S. K., Myers, D. D., Wakefield, T. W. Inferior vena cava branch variations in C57BL/6 mice have an impact on thrombus size in an IVC ligation (stasis) model. J Thromb Haemost. 13 (4), 660-664 (2015).
  16. Siefert, S. A., et al. Enhanced venous thrombus resolution in plasminogen activator inhibitor type-2 deficient mice. J Thromb Haemost. 12 (10), 1706-1716 (2014).
  17. Schulz, C., Engelmann, B., Massberg, S. Crossroads of coagulation and innate immunity: the case of deep vein thrombosis. J Thromb Haemost. 11, Suppl 1 233-241 (2013).
  18. Day, S. M., et al. Macrovascular thrombosis is driven by tissue factor derived primarily from the blood vessel wall. Blood. 105 (1), 192-198 (2005).
  19. Diaz, J. A., et al. Impaired fibrinolytic system in ApoE gene-deleted mice with hyperlipidemia augments deep vein thrombosis. J Vasc Surg. 55 (3), 815-822 (2012).
  20. Zhou, J., May, L., Liao, P., Gross, P. L., Weitz, J. I. Inferior vena cava ligation rapidly induces tissue factor expression and venous thrombosis in rats. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (6), 863-869 (2009).
  21. Diaz, J. A., et al. Electrolytic inferior vena cava model (EIM) of venous thrombosis. J Vis Exp. (53), e2737(2011).
  22. Diaz, J. A., et al. The electrolytic inferior vena cava model (EIM) to study thrombogenesis and thrombus resolution with continuous blood flow in the mouse. Thromb Haemost. 109 (6), 1158-1169 (2013).
  23. Brill, A., et al. Extrahepatic high-density lipoprotein receptor SR-BI and apoA-I protect against deep vein thrombosis in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (8), 1841-1847 (2012).
  24. Diaz, J. A., et al. Critical review of mouse models of venous thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 556-562 (2012).
  25. Brandt, M., et al. Deep vein thrombus formation induced by flow reduction in mice is determined by venous side branches. Clin Hemorheol Microcirc. 56 (2), 145-152 (2014).
  26. Geddings, J., et al. Strengths and weaknesses of a new mouse model of thrombosis induced by inferior vena cava stenosis: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost. 12 (4), 571-573 (2014).
  27. Alvarado, C. M., et al. Male mice have increased thrombotic potential: sex differences in a mouse model of venous thrombosis. Thromb Res. 127 (5), 478-486 (2011).

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