一种用于研究术后认知功能障碍与组织再生的骨科手术小鼠模型

摘要

本方案描述了一种用于研究术后神经炎症和行为变化机制的骨科手术小鼠模型，当与连体共生技术结合时，还可用于研究衰老过程中的组织再生。

摘要

手术常用于改善和维持生活质量。然而，对于老年等脆弱人群，术后可能出现并发症，显著影响治疗效果。事实上，在接受常规骨科手术治疗骨折后，高达50%的老年患者会出现谵妄等神经系统并发症。此外，随着年龄增长，术后组织愈合与再生能力下降，可能影响骨折修复质量，甚至影响植入物的骨整合。因此，深入理解驱动这些年龄相关变化的机制，有助于确定可干预的关键靶点，以降低并发症风险并优化治疗结局。本文介绍一种具有临床相关性的胫骨骨折小鼠模型。这些小鼠术后的变化模拟了人类接受常规骨科手术后常见的部分认知功能障碍。简言之，在严格无菌条件下对小鼠右后肢进行切口，分离肌肉组织，将一根直径0.38 mm的不锈钢针插入胫骨上嵴的髓腔内。随后进行截骨操作，并用缝合钉关闭伤口。我们已利用该模型研究手术创伤对术后神经炎症及行为学改变的影响。通过将该骨折模型与连体共生（parabiosis）技术结合——一种将两只小鼠外科吻合的模型——我们研究了在损伤后能够系统性地恢复器官功能和组织再生的细胞及分泌因子。遵循本逐步操作方案，可高保真地复制这些模型，并可用于探究手术创伤所影响的多种生物学通路。

引言

外科手术已彻底改变了医疗保健体系，并持续推动前沿技术的发展，提升安全性，并维持患者的生活质量。然而，手术也会引发一系列病理生理反应，可能导致术后并发症，包括伤口感染、神经功能损伤，甚至死亡，尤其是在老年患者中^1,2。骨科手术在临床上常规开展，尤其在老年人群中，旨在改善生活质量并修复常见的骨骼损伤。但是，65岁及以上的骨科手术患者中，高达50%会出现术后神经功能损伤，例如术后谵妄。这种情况始终与不良预后相关，i.e.，术后6个月死亡风险增加5倍、持续性功能衰退、每位患者所需的护理时间增加、住院时间延长以及入住护理机构的比例升高^3,4,5。尽管已识别出一些危险因素（如高龄），但目前对手术后神经功能损伤的潜在机制仍知之甚少。

由于骨折在老年人群中极为常见，我们建立了一种胫骨骨折小鼠模型，以确定外周创伤对术后恢复的影响，包括神经炎症和脑健康（认知功能）^6,7。该模型最初由Harry et al.⁸描述，包括在全身麻醉和镇痛条件下进行髓内钉固定和胫骨骨折，从而模拟人类常见长骨骨折及修复过程中伴随的皮肤损伤、肌肉创伤和骨修复过程。术后，小鼠表现出与人类相似的炎症标志物变化^9,10，以及海马区小胶质细胞的活化，后者与陈述性记忆缺陷和海马神经可塑性下降相关^6,7,11。我们此前将该骨折模型与连体共生（parabiosis）技术结合使用。连体共生是一种外科模型，通过将两只小鼠进行吻合，使其共享一个循环系统。该模型在理解循环细胞和体液因子在年龄和疾病背景下对器官功能的调控作用方面取得了突破性进展^12,13,14。利用该方法，我们近期发现了与年龄依赖性骨折愈合相关的系统性因子¹²。

本文介绍了一种将胫骨骨折模型与连体共生（parabiosis）技术相结合的实验方案，用于研究与再生医学和神经免疫学相关的骨-脑年龄依赖性机制。方案1A描述了连体共生手术操作，方案1B详细说明了胫骨骨折建模步骤（图1A）。根据研究目的的不同，这两个方案可独立进行，也可联合使用。

方案

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行，并经机构动物护理 & 杜克大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）。

1. 实验动物

1. 将小鼠饲养在具有12小时光照/12小时黑暗循环的空调环境中，并确保其能正常获取标准食物和饮水。每笼饲养不超过5只同窝小鼠，并避免可能诱发打斗的条件。
2. 使用3月龄（年轻）或18月龄（老年）的雌性C57BL6/J小鼠。
3. 进行异种共生手术前，需将两只小鼠共同适应至少两周 。小鼠品系为野生型C57BL6/J或eGFP+。
4. 每天检查小鼠的身体状况和整体外观。

2. 连体手术和骨科手术的术前准备

1. 称量2只小鼠。
2. 通过麻醉系统以0.2 L/min的恒定O₂流速进行全身麻醉。在诱导室中使用5%异氟烷进行诱导。
   注意：可通过夹捏脚趾反应确认麻醉深度。
3. 将小鼠仰卧置于加热垫上。在整个手术过程中使用直肠探头监测体温。
4. 为维持麻醉，通过面罩将吸入的异氟烷浓度降低至2.0%（氧气流速0.2 L/min），并持续监测以确保足够的麻醉深度。
5. 使用脉搏血氧仪无创监测生理参数（呼吸频率、血氧饱和度和心率）（可选）。

3. 连体手术（方案1A）

1. 给予镇痛剂（布托啡诺，SR/缓释剂型） 皮下注射0.1 mg/kg剂量的药物，在诱导后、手术操作前给药。在切开前，于侧腹部注射布比卡因（0.25%）。使用眼用润滑剂。
   注意：联体共生手术方案可独立于胫骨骨折手术进行。
2. 所有体内缝合均使用4-0聚二氧杂环己酮缝线材料，所有体表缝合均使用4-0聚丙烯缝线材料。
3. 用剃毛器沿肘部、侧腹和膝部的连续线条剃除待连接侧的2只小鼠的毛发。用碘伏和70%酒精进行皮肤消毒，交替循环3次，为切口做准备。 
   使用已灭菌的仪器，并保持无菌区域。
   注意：将野生型小鼠置于 eGFP 小鼠的右侧，并准备对野生型小鼠的左侧 flank 和 eGFP 小鼠的右侧 flank 进行手术（图1).
4. 在每只小鼠上使用剪刀 沿侧腹壁做皮肤切口，范围从膝关节近端至肘关节近端，注意勿损伤皮肤下方的肌肉组织。
5. 用2针间断缝合连接动物的三头肌。
6. 沿侧腹壁进行7到9针的连续缝合，将腹壁组织缝合在一起。
7. 用两条间断缝线缝合动物的股四头肌。
8. 用间断缝线缝合2只连体小鼠的皮肤。
9. 让小鼠在常温空气中苏醒。
10. 为确保本方案成功实施，必须维持配对动物的健康状态：每天监测配对动物状况，每周进行两次体况评分，并每周称重两次。
    注意：每对个体单独饲养。
    注意：若使用普通布托啡诺（即非缓释型），则需在每只小鼠皮下注射0.1 mg/kg剂量，溶于1 mL生理盐水中，每日两次，持续3天。
11. 给予4周恢复时间，以确保在进行胫骨骨折手术时联体小鼠间建立共同血液循环。

4. 胫骨骨折手术（方案1B）

1. 诱导后、手术操作前给予镇痛药（皮下注射布托啡诺，0.1 mg/kg）。在切开前，于膝关节近端手术部位注射布比卡因（0.25%）。使用眼用润滑剂。 
2. 剃除小鼠右侧后肢内侧的毛发以暴露手术区域，并使用碘伏加70%酒精进行皮肤消毒，交替重复3个循环。 整个手术过程中保持无菌操作区域。为减少污染，使用经高压灭菌的器械和手套；在解剖显微镜下完成手术（可选）；并使用加热垫维持小鼠体温。
   注意：若该方案用于连体小鼠模型，则每对连体小鼠中仅对其中一只进行骨折处理（右侧小鼠的右胫骨）。连体小鼠骨折示意图参见 图1B 。
3. 使用剪刀沿右侧小鼠右侧后肢内侧、自膝关节近端向下至胫骨中段处做皮肤切口。
4. 暴露胫骨中段，肉眼定位骨干区域。屈曲膝关节，以髌股韧带作为解剖标志，观察胫骨平台。
5. 观察髌腱；用拇指和食指手动旋转25号针头，在髓腔内钻出一个直径0.5 mm的孔。
   注意：钻孔方向应与胫骨平行，从胫骨平台进入。
6. 将一根直径0.38 mm的不锈钢针插入孔中，深入髓腔约15 mm，直至遇到阻力，然后使用断线钳将其与胫骨平台齐平剪断（参见补充视频1中的三维重建图像）。
7. 使用直头Bonn剪刀在胫骨中段（骨干）处造成骨折。骨折示意图参见图1C。
8. 肉眼观察骨折部位及周围组织，检查骨折部位是否已稳定固定。
9. 使用皮肤钉合器闭合切口。
10. 将小鼠置于加热垫上恢复意识，之后放回清洁的饲养笼中。每只小鼠皮下注射1 mL预热至37 °C的生理盐水以补充液体。
11. 每日检查小鼠是否出现跛行、感染或出血等异常表现。
    注意：若使用常规布托啡诺（非缓释型），则需每日皮下注射0.1 mg/kg，溶于1 mL生理盐水中，连续给药3天。

结果

在无菌条件下进行横断截骨术，稳定插入钢针并正确缝合后，小鼠术后左后肢未出现跛行、感染或出血等迹象。通过放射学分析和番红O染色后的组织形态学测量评估骨科愈合情况（图2）。胫骨中段骨折的X线影像显示，年轻小鼠骨折愈合组织中的组织沉积多于老年小鼠。将骨折愈合组织脱钙后包埋于石蜡中，用于组织学分析。切片经番红O染色，并通过组织形态学分析对组织沉积进行定量。年轻小鼠的骨折愈合组织中骨组织含量更多，纤维化组织更少，而老年小鼠的骨折愈合组织则相反。

胫骨骨折会引发全身性和中枢性炎症^6,7,11,15,16。事实上，在小鼠和人类中，骨科手术后外周促炎性细胞因子和损伤相关分子模式（DAMPs）的水平迅速升高^7,17,18。这通过涉及体液、细胞和神经通路的多种信号机制，促进脑内小胶质细胞的活化^{7,15,19,20,21}。手术后，内皮功能障碍、血脑屏障开放以及外周巨噬细胞浸润可导致野生型及Ccr2^RFP/+ Cx3cr1^GFP/+成年小鼠急性海马神经炎症^15,19，并与随后出现的记忆功能障碍相关，该功能障碍类似于人类的谵妄和术后认知功能障碍^15,19,22。在老年动物中，这种神经炎症反应加剧，并伴有小胶质细胞形态的显著改变，可通过IBA-1免疫染色检测到（图3）。

利用此处描述的胫骨骨折模型，我们还发现海马神经发生出现短暂性受损，表现为齿状回中双皮质素（DCX）免疫染色减少²⁰。对长时程增强（LTP）——记忆功能的替代指标——进行的电生理测量显示，术后神经可塑性出现时间依赖性破坏¹¹。术后小鼠也表现出海马依赖性记忆功能障碍，例如通过恐惧条件反射行为评估可观察到该现象（图4）。在恐惧条件反射实验中，将小鼠置于一个实验舱内，先给予听觉刺激，随后给予厌恶刺激（即，足底电击）。胫骨手术三天后，将小鼠再次放入条件反射舱中，但此次不给予任何听觉或厌恶刺激，记录其僵直行为作为记忆的指标（详细实验方案见²³）。

高龄是记忆衰退的关键风险因素。然而，随着年龄增长，组织修复与再生能力也会下降，尽管这些机制目前仍不甚清楚。因此，我们采用本文所述的方案进行异时性联体共生（将年轻与年老动物配对），并评估了老年小鼠的骨折愈合情况（详细的联体共生方案参见²⁴）。已确认联体配对动物之间实现了血液共享，且共享程度相等¹²。暴露于年轻循环系统可促进骨修复，表现为更早愈合、骨沉积增加以及纤维化减少（图5）¹²。这种骨再生的 rejuvenation（恢复活力）效应并不依赖于内源性的骨钙素阳性成骨细胞（图5，棕色细胞），而是依赖于从年轻联体伙伴迁移而来的CD45阳性细胞（图5，蓝色细胞）。这些结果表明，CD45阳性的造血细胞分泌出一种年轻而健康的微环境，能够向衰老的成骨细胞发出信号，诱导其活性增强。

图1：异种共生与胫骨骨折手术的示意图。（A）进行异种共生联合胫骨骨折（方案1A）或仅进行胫骨骨折（方案1B）的时间线。（B）20月龄小鼠在同龄（isochronic）或异龄（heterochronic）异种共生配对中的胫骨骨折情况（右侧小鼠的右后肢发生骨折，以X标记）。灰色小鼠代表野生型小鼠，绿色小鼠代表eGFP标记小鼠。（C）采用髓内钉固定的胫骨中段骨折模型示意图。另请参见补充视频1，查看后肢及胫骨钉固定的三维重建视频。请点击此处查看该图的高清版本。

图 2：年轻与老年小鼠模型中的胫骨骨折愈合情况。 对年轻或老年小鼠的胫骨进行骨折处理，并在损伤后21天检测骨折愈合组织。(A) 采用放射影像学和组织学染色（番红O染色）评估骨折后21天的骨折愈合组织。染色结果显示胶原组织呈蓝色，软骨中所含的蛋白聚糖呈红色。虚线表示骨折愈合组织的大致位置。(B) 通过组织形态计量学分析评估骨折后21天骨折愈合组织中骨组织、软骨及纤维化组织的沉积量。数据以均值 ± 95% 置信区间表示，*P<0.05，差异具有统计学意义（单因素方差分析，Dunnett 检验）；比例尺代表 2 mm；图像使用显微镜以 1.25 倍物镜获取。每组样本数 n = 9。请点击此处查看该图的高清版本。

图3：手术诱导海马区小胶质细胞的年龄依赖性活化。 与4月龄C57BL6/J小鼠相比，胫骨骨折手术在老年小鼠（20月龄）中诱导出更强的海马神经炎症反应。术后24小时，通过小胶质细胞标志物IBA-1对脑切片进行染色，显示手术组中小胶质细胞阳性细胞数量增多，并出现形态学改变。图像使用100倍放大的落射荧光显微镜获取；比例尺为10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：胫骨骨折手术后神经发生、长时程增强效应和记忆功能受损。（A）DCX 是神经发生的定量标志物，在术后 24 小时海马齿状回中的表达显著降低。图像使用 10 倍放大倍数的共聚焦激光扫描显微镜物镜获取；比例尺代表 10 µm。（B）对照组或术后 24 小时小鼠海马脑片的电生理记录。长时程增强效应（LTP）通过高频刺激（HFS）诱导，并持续记录 1 小时。场兴奋性突触后电位（fEPSPs）使用充满常规人工脑脊液的细胞外记录电极从 CA1 区辐射层记录。与对照组小鼠相比，术后 24 小时 LTP 的诱导显著降低。数据以均值 ± 标准误表示，n = 3，* p < 0.05，单因素方差分析。（C）依赖海马的记忆功能（通过痕迹恐惧条件反射测定的僵直百分比）在术后小鼠中较对照组及仅接受麻醉的小鼠明显受损。数据以均值 ± 标准误表示，n = 9–10，* p < 0.05，单因素方差分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：异种共生手术可促进骨折愈合的年轻化、血液共享及供体细胞的植入。 建立同龄和异龄异种共生配对模型，并对每对中的老龄小鼠进行骨折处理，评估其骨愈合情况。(A) 采用放射影像学方法检测骨折愈合组织。虚线表示骨折愈合组织的大致位置。(B) 在骨髓中确认了eGFP+细胞的植入。(C) 通过免疫组织化学方法鉴定骨折愈合组织中来自共生体的eGFP⁺供体细胞（蓝色）和骨钙素⁺成骨细胞（棕色）。比例尺为50 µm，图像使用40倍物镜获取。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充视频 1：后肢的三维重建及胫骨固定。 请点击此处下载该文件。

讨论

骨折是一种常见的临床问题，尤其在快速增长的老年群体中，仍是导致发病的主要原因之一。本文介绍了一种胫骨骨折小鼠模型的逐步操作方案，用于研究术后神经炎症和认知功能障碍的相关机制。该模型可与连体共生手术相结合，以研究神经-免疫相互作用、组织再生及其他信号传导过程。深入了解这些机制将为降低术后并发症风险和优化治疗效果提供战略性干预靶点。

已开发出多种骨科模型用于研究啮齿类动物的骨修复过程²⁵。我们采用并改进了Harry et al.⁸最初描述的胫骨骨折手术，以研究骨科手术对脑功能的影响。我们还曾将该骨折模型与我们的连体共生模型结合使用，以探究负责骨愈合及年龄依赖性组织再生的相关因素。在挥发性全身麻醉下进行时，该胫骨骨折手术每只动物仅需约15分钟，死亡率极低甚至为零（具体取决于小鼠年龄及潜在的遗传易感性），并能重现长骨骨折和骨科手术创伤所常见的损伤特征。因此，该模型非常适合用于探究生物学通路及进行纵向评估。然而，关键在于截骨和内固定操作必须具有可重复性，且软组织损伤需保持一致。软组织损伤程度可通过例如剥离骨膜及夹捏周围肌肉等方式进行调节，从而使手术更具创伤性。由非固定钝性损伤或三点弯曲诱导的创伤性骨折模型则无法提供如此一致性和精确性。这些操作常导致再损伤，从而引发持续较久的炎症反应。相反，采用刚性固定的骨折模型所引起的炎症较轻，无法充分模拟骨科手术相关的组织损伤^26,27。

已有其他采用钛合金钉固定的模型被开发出来，可更紧密地模拟人类关节置换术，可能更适用于在小鼠中研究假体不稳、骨溶解及假体相关并发症^28,29。钻孔模型（如本文所述）可提供足够的稳定性，且小鼠可在行为学实验范式中进行测试，不会出现明显功能缺陷，从而避免对恐惧条件反射或旷场运动/焦虑测试等任务造成干扰^{6,7,11,15,19,20}。然而，若固定未完全锁牢，可能发生旋转畸形。部分模型采用外固定架，虽可提供更优的稳定性，但在小鼠胫骨中实施较为困难，尽管其在小鼠股骨中可成功应用²⁷。

认知功能障碍，包括谵妄和术后认知功能障碍，是骨折修复骨科手术后常见的并发症，尤其在老年和体弱患者中更为普遍³⁰。这种具有临床相关性的胫骨骨折手术小鼠模型表明，术后全身性细胞因子释放^6,7,17、血脑屏障功能受损^15,19以及小胶质细胞形态改变^16,22均会导致记忆障碍，并可能代表许多患者在骨科手术后出现的神经系统并发症的关键特征。需要注意的是，已有其他手术方法被用于建立小鼠术后认知功能障碍模型，包括腹部^31,32,33和血管³⁴手术，以及浅表创伤^35,36。联体共生技术适用于所有这些模型，因为它们具有相似的终点指标，包括炎症反应、胶质细胞活化和行为缺陷，这些可能由共同的机制介导。

包含异种共生（parabiosis）的研究揭示了循环因子在影响老年动物认知功能、神经炎症及组织再生方面的新作用^{37,38,39,40,41,42}。我们已证明，异种共生可成功结合本文所述的胫骨骨折模型，用于探究再生通路以及研究影响愈合与骨折修复的血液传播因子相关机制¹²。在此，我们证明了当老年动物与年轻动物进行血管吻合后，其骨折修复能力可被 rejuvenated（恢复活力）。这种年龄逆转现象的根源在于造血细胞在骨折部位的植入。有趣的是，通过将年轻小鼠的骨髓移植至老年小鼠体内，也可实现类似的 rejuvenation（恢复活力）效果。在这方面，骨髓移植可被视为一种比异种共生更直接且更简便的替代方法。然而，异种共生是研究循环细胞和因子功能的更为稳健的模型。我们预期，异种共生与骨科手术模型的结合将在解答围手术期护理和衰老生物学中的关键问题方面发挥重要作用。

综上所述，我们介绍了一种用于研究骨科手术后术后神经炎症及认知功能障碍机制的胫骨骨折小鼠模型的逐步操作方案。该模型可与连体共生（parabiosis）手术相结合，用于研究神经-免疫相互作用、组织再生及其他相关通路。明确这些机制将为降低术后并发症风险并优化临床预后提供战略性干预靶点。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷	Piramal Healthcare	NDC 66794-017-25	也可使用其他挥发性麻醉剂或注射麻醉剂
布托啡诺	Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals	NDC 12496-6757-1	可选，具体取决于各机构动物护理和使用委员会的建议
乙醇	Fisher Scientific	04-355-451	70% 消毒用皮肤处理及清洁溶液
10% 聚维酮碘	Dynarex		用于皮肤的消毒处理
SomnoSuite	Kent Scientific	SS-01	低流速  麻醉系统
MouseSTAT	Kent Scientific	PS1161	脉搏血氧仪 &和心率监测器
沙弗	Wahl	9854L
体视显微镜	Leica	MZ6
手术刀柄	精细科学工具	10003-12
手术刀片 - #11	精细科学工具	10011-00
Adson 镊子	精细科学工具	11006-12	用于剥离骨膜
虹膜镊	精细科学工具	11066-07	有用（1x2 齿）以引起局部肌肉/软组织损伤
波恩剪刀（直型）	精细科学工具	14084-08	适用于截骨，注意定期更换，以免变钝
精细剪刀	精细科学工具	14058-09	用于剪断缝线的锐利剪刀
22G × 3.5 英寸 Quincke  脊髓穿刺针	BD	405181	使用内杆进行固定
持针器	精细科学工具	12001-13
缝合	观察	1079B
C57BL/6J	杰克逊实验室	货号 000664
eGFP+（泛素性表达增强型绿色荧光蛋白）	杰克逊实验室	货号 003291