小鼠尿囊的分离与外植体培养 体外 尿囊附着分析

摘要

我们描述了一种 体外 建立绒毛尿囊附着（胎盘形成的首个步骤）的实验模型。该方案展示了将小鼠尿囊在固定化的α4β1整合素上进行解剖及外植体培养的操作流程。通过显微镜在预设的时间点评估尿囊的附着情况。

摘要

胎盘对于哺乳动物胚胎的生长和发育至关重要。正因如此，许多遗传改变以及可能存在的多种环境有害因素若干扰胎盘的发育或功能，均可能导致小鼠和人类早期妊娠失败。然而，目前仍缺乏简单 体外 用于筛选对胎盘形成潜在影响的检测方法尚付阙如。本文重点在于模拟胎盘形成的第一步及关键步骤，即尿囊与绒毛膜的附着过程。我们描述了一种快速评估尿囊外植体在固定化α4β1整合素（作为模拟绒毛膜的基质）上附着能力的方法。 体外 该方法能够对多个尿囊外植体在不同连续时间点的附着和铺展行为进行定性评估。该实验方案可用于研究靶向小鼠突变、药物或各种与妊娠并发症或胎儿丢失相关的环境因素对尿囊附着的影响。 离体.

引言

胎盘对于胚胎在子宫环境中的生长和发育至关重要。它构成了胎儿与母体循环之间进行氧气、代谢物和营养物质交换的界面，同时还具有内分泌和免疫器官的功能。任何损害胎盘发育的内源性或外源性因素，均可能导致小鼠和人类出现宫内生长受限、胎儿丢失或妊娠并发症¹尽管导致胎盘生理异常的靶向小鼠突变数量持续增加²，目前小鼠基因组信息学（Mouse Genome Informatics, MGI）网站（http://www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0010038）列出了219种基因型，其中许多表型在机制层面上尚未被充分理解。除遗传改变外，小分子药物、单克隆抗体、毒素、病原体、过量代谢物或各种环境因素均可能影响胎盘的发育与功能^3,4,5,6,7。然而，简单的 体外 模拟胎盘发育关键步骤的检测方法十分有限。

小鼠胎盘发育始于妊娠中期早期，此时尿囊（脐带的发育前体）从胚胎后端以芽状结构向外延伸，并朝向绒毛膜生长

方案

小鼠繁育工作已获得下弗兰肯行政区的批准，所有分析均严格遵守德国及欧洲联盟关于实验动物护理与使用的各项法律法规。

1. 使用 α4β1 整合素包被微量滴定板 子宫外 尿囊外植体培养

1. 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将冻干的小鼠 α4β1 整合素重悬至 200 µg/mL。再用预热（37 °C）的 PBS 稀释至终浓度为 10 µg/mL。向微孔板所需数量的孔中每孔加入 20 µL 稀释后的 α4β1 整合素溶液（每孔 1 个尿囊）。
   注意：包被微孔板孔壁时应避免产生气泡。
2. 将微孔板置于湿润的组织培养孵育箱中，在 37 °C 下孵育 60 分钟。
3. 用移液器小心吸除上清液。采用轻柔的负压，并倾斜微孔板，避免移液器吸头接触孔底。加入 50 µL 预热（37 °C）的培养基（如 Dulbecco 改良 Eagle 培养基，DMEM）洗涤孔两次，每次均通过轻柔负压去除洗涤液。
4. 关键步骤：每孔加入 50 µL 含 0.1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的 DMEM 溶液，以封闭非特异性结合位点，并将微孔板置于湿润的组织培养孵育箱中，在 37 °C 下孵育 ≥ 30 分钟。
   注意：在含血清条件下，尿囊外植体可附着于多种表面。因此，在用整合素包被孔板后、加入分离的尿囊进行外植体培养前（见步骤 4.4），必须封闭非特异性结合位点。
5. 将包被后的孔板保留....

结果

本方案描述了一种分离和外植小鼠尿囊的方法 离体，并详细描述了尿囊与α4β1整合素结合的定性评估，这是发育过程中的关键步骤 体内 绒毛尿囊融合。所示的代表性结果见于 图1A-H 展示从妊娠子宫开始的尿囊分离的各个连续步骤。包围子宫角的母体组织，如脂肪组织和血管（图1A) 被移除后，通过逐层切开肌性子宫壁，将胚胎从子宫内膜中逐步分离出来图1B-E）。随后，去除其他母体组织，如壁层卵黄囊和外周胎盘锥体（图1E，F). 图 1G-H<.......

讨论

在含有血清的情况下，血清是纤连蛋白等促黏附细胞外基质分子的丰富来源，尿囊外植体将易于附着于各种塑料、玻璃或滤膜表面^9,16因此，如果所进行的实验旨在特异性地研究基因修饰或任何其他处理对尿囊绒毛膜在固定化α4β1上附着的影响，则必须阻断非特异性结合位点例如，用整合素包被表面后、在与含血清培养基孵育前，加入含牛血清白蛋白的溶液。

所有尿囊外植体与固定的 α4β1 整合素之间的初始黏附对移动非常敏感，因此在评估尿囊黏附之前，应使组织培养板保持静止一段预设的时间（例如，12 小时）。请注意，与基质形成稳定接触所需的时间可能因分析的小鼠品系或固定的 α4β1 整合素浓度不同而有所差异。

细胞间VCAM-1/α4β1相互作用对成功实现绒毛尿囊融合的必要性已得到充分证实^11,12

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6J野生型小鼠	杰克逊实验室	货号： 000664
70 % (v/v) 乙醇	VWR International	930031006
标准型镊子	精细科学工具	11000-12	用于打开腹腔的镊子。
显微解剖镊	Fine Science Tools	11254-20	杜蒙特 #5 医学生物学镊子，尖端精细且锋利。
精细剪刀	Fine Science Tools	14094-11	直刃刀片
弹簧剪	精细科学工具	15012-12	用于子宫芽解剖的14毫米刀片Noyes弹簧剪。
微勺	卡尔·罗斯	AT18.1	5 mm 勺子直径。
微量滴定板	ibidi	81501	我们使用未包被的无菌血管生成载玻片（内体积 50 µL）带有疏水表面且未经组织培养处理，以减少非特异性结合α4β1介导的与塑料的结合
10 cm 培养皿	Nunc	150350	无菌组织培养皿
3.5 cm 培养皿	Nunc	150288	无菌组织培养皿
大孔径移液器吸头	Biozym	VT0140X	低吸附移液器吸头，200 µL.
α4β1整合素	R&D Systems	6054-A4	小鼠 α4β从中国仓鼠卵巢细胞系中重组表达并纯化的1整合素。
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma Aldrich	D8537	无钙2+ 和 Mg2+.
杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）	PAN Biotech	P04-03600	该培养基配方含有 4.5 g/L 葡萄糖、110 mg/L 丙酮酸钠和 3.7 g/L NaHCO₃3 但不含L-谷氨酰胺，L-谷氨酰胺需单独添加。
青霉素/链霉素	Gibco（ThermoFisher Scientific）	15140-122	100 ×（10,000 U/mL 青霉素和 10,000 µg/mL 链霉素）储备液。 在 -20 ℃ 下分装并储存 aliquots °C，以避免冻融。
L-谷氨酰胺	PAN Biotech	P04-80100	100 × (200 mM) 储存液。配制后分装，于 -20 ℃ 保存 °C，以避免冻融。
胎牛血清	Biochrom	S 0115	我们使用热灭活的FBS（加热至56℃） °37°C 下孵育 30 分钟并混匀，以灭活补体。
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma Aldrich	A7030	我们使用无蛋白酶和无脂肪酸的白蛋白。用DMEM配制0.1%（w/v）的溶液。使用一次性细胞培养滤器（孔径0.22 μm）对溶液进行无菌过滤。 µm 孔径和低蛋白结合膜，分装后于 -20 保存 °C.
para-甲醛	卡尔·罗斯	0335.2	在 PBS 中配制甲醛溶液，称取 para在通风橱中将甲醛粉末加入预热至约 60 ℃ 的 PBS 中 °将溶液置于烧杯中，放在搅拌器上搅拌。逐滴加入1 N NaOH，直至溶液变澄清。让溶液冷却至室温，然后通过0.22 mm滤膜注射器过滤。用稀释的HCl调节pH至约6.9，并用PBS定容。我们将该溶液分装后冷冻保存，但也可在4℃储存 °约四周。
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	使用宽孔径移液器吸头操作未稀释的Triton X-100。
正常山羊血清	Sigma Aldrich	G9023	用于阻断免疫荧光分析中抗体的非特异性结合。
α抗-CD31 抗体	BD 生物科学	550274	纯化的抗小鼠单克隆抗体（大鼠源），克隆株 MEC 13.3
二抗山羊抗大鼠抗体	赛默飞世尔科技	A-11006	山羊抗大鼠IgG（重链和轻链），经交叉吸附，用Alexa Fluor 488荧光标记。也可使用其他荧光标记。
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	细胞化学用封片介质。分子量约 31,000
Labovert	Leitz	Labovert	配备4倍和10倍物镜的倒置相差显微镜，用于体节对数计数。其他相差显微镜（例如常规用于组织培养的显微镜）也同样适用。
M80	徕卡显微系统	M80	具有8:1变焦范围（放大倍数为7.5×至60×）的体视显微镜，用于胚胎和尿囊的解剖。
DM4000B	徕卡显微系统	DM4000B	用于组织学的LED照明显微镜系统。我们使用HCX PL FLUOTAR 5×/0.15和HC PL FLUOTAR 10×/0.30物镜。其他配备相差和荧光光学系统的显微镜也可用于评估尿囊附着情况。
数码相机	JVC	KY-F75U	配备3-CCD数字成像相机的DM4000B LED显微镜。我们使用Diskus软件（Hilgers）控制显微镜和相机。
共聚焦显微镜	徕卡显微系统	SP5	用于对尿囊外植体血管丛中内皮细胞进行高分辨率成像的共聚焦显微镜。免疫荧光图像使用40倍物镜拍摄。