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方法文章

二维凝胶电泳联合质谱法分析人类垂体腺瘤组织蛋白质组

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DOI：

10.3791/56739

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2018年4月2日

 ,  , 
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4The State Key Laboratory of Medical Genetics, Central South University

本文内容

摘要

本文介绍了一种二维凝胶电泳（2DE）结合质谱法（MS）的技术，用于分离和鉴定人类垂体腺瘤组织的蛋白质组，该方法可获得良好且可重复的2DE图谱。在利用高灵敏度质谱分析复杂的癌症蛋白质组时，每个2DE斑点中均可检测到多种蛋白质。

摘要

人垂体腺瘤（PA）是一种发生在下丘脑-垂体-靶器官轴系统中垂体腺内的常见肿瘤，根据临床表现可分为功能性垂体腺瘤和非功能性垂体腺瘤（FPA 和 NFPA）。由于与功能性垂体腺瘤相比，非功能性垂体腺瘤（NFPA）在血液中几乎不引起激素水平升高，因此其早期诊断和治疗较为困难。我们的长期目标是利用蛋白质组学方法发现可靠的生物标志物，以阐明垂体腺瘤的分子机制，并识别有效的诊断、预后标志物及治疗靶点。本文介绍了结合质谱（MS）技术的有效二维凝胶电泳（2DE）方法，用于分析人垂体腺瘤的蛋白质组，包括样品制备、二维凝胶电泳、蛋白质显色、图像分析、凝胶内胰蛋白酶消化、肽质量指纹图谱（PMF）以及串联质谱（MS/MS）。二维凝胶电泳-基质辅助激光解吸/电离质谱肽质量指纹图谱（2DE-MALDI MS PMF）、2DE-MALDI MS/MS 和 2DE-液相色谱（LC）MS/MS 方法已成功应用于非功能性垂体腺瘤蛋白质组的分析。通过使用高灵敏度质谱仪，在对复杂的垂体腺瘤组织进行分析时，利用 2DE-LC-MS/MS 方法可在每个二维凝胶斑点中鉴定出大量蛋白质，从而最大限度地覆盖人垂体腺瘤的蛋白质组。

引言

垂体腺瘤（PA）是一种常见的肿瘤，发生于下丘脑-垂体-靶器官轴系统中的垂体，该系统在人体内分泌系统中发挥重要作用。PA 包括临床上有功能的和无功能的垂体腺瘤（FPA 和 NFPA）1,2。由于与 FPA 相比，NFPA 患者血液中激素水平仅轻微升高（例如，LH 和 FSH），而 FPA 患者血液中相应激素水平显著升高，因此 NFPA 在早期诊断和治疗上较为困难3,4,5。阐明其分子机制并发现有效的生物标志物，对于 NFPA 的诊断、治疗及预后具有重要的临床意义。我们的长期目标是开发并应用蛋白质组学方法研究 NFPA，以发现可靠的生物标志物，阐明其分子机制，并识别有效的治疗靶点以及诊断和预后标志物。在我们长期开展的人类 PA 蛋白质组研究项目中，已广泛使用双向电泳（2-DE）结合质谱（MS）的方法1,2,6,7，包括建立蛋白质组参考图谱3,8、差异表达蛋白谱分析9,10,11,12,13、激素变异体研究14,15、翻译后修饰分析，如磷酸化14和酪氨酸硝基化16,17,18、侵袭性与非侵袭性 NFPA 的蛋白质组差异19，以及 NFPA 亚型间的蛋白质组异质性13，这些研究揭示了在 NFPA 中发生改变的多个重要通路网络（线粒体功能障碍、细胞周期失调、氧化应激及 MAPK 信号系统异常）13,19,20。

双向电泳（2DE）根据蛋白质的等电点（pI）（等电聚焦，IEF）和分子量（通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-PAGE）对其进行分离1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23。自1995年提出蛋白质组和蛋白质组学概念以来，该技术已成为蛋白质组学领域中一种常见且经典的分离方法24。质谱（MS）是鉴定经2DE分离的蛋白质身份的关键技术，包括肽质量指纹图谱（PMF）和串联质谱（MS/MS）策略。质谱仪器的快速发展，尤其是在检测灵敏度和分辨率方面的提升，结合液相色谱（LC）系统的改进，显著提高了对蛋白质组中低丰度或极低丰度蛋白质的鉴定能力，从而最大限度地扩展了蛋白质组的覆盖范围。这一进展也挑战了我们传统的观念，即在复杂的人体组织蛋白质组分析中，每个二维凝胶斑点仅含有一个或两个蛋白质；同时为在复杂人体组织蛋白质组分析中鉴定单个二维凝胶斑点内的多种蛋白质提供了机会，并有助于最大限度地扩展NFPA蛋白质组的覆盖范围。

本文详细描述了二维电泳-基质辅助激光解吸/电离质谱肽质量指纹图谱（2DE-MALDI MS PMF）、二维电泳-基质辅助激光解吸/电离串联质谱（2DE-MALDI MS/MS）以及二维电泳-液相色谱-串联质谱（2DE-LC-MS/MS）的技术流程，这些方法已成功应用于人类无功能性垂体腺瘤（NFPA）蛋白质组的分析。本实验方案包括样品制备、第一维分离（等电聚焦，IEF）、第二维分离（SDS-PAGE）、蛋白质显色（银染和考马斯亮蓝染色）、二维凝胶图像分析、胶内胰蛋白酶消化、胰酶消化肽段的纯化、肽质量指纹图谱分析（PMF）、串联质谱分析（MS/MS）以及数据库搜索3,8,25,26。此外，该技术流程可便捷地推广应用于其他人组织蛋白质组的分析。

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方案

本方案遵循中国中南大学湘雅医院医学伦理委员会的指导原则。整个实验过程中应佩戴头套和手套，以避免皮肤和头发中的角蛋白污染8。

1. 样品制备

  1. 从神经外科部门收集垂体腺瘤（PA）组织（0.2 - 0.5 mg），立即在液氮中速冻，随后转移至 -80 °C 保存。
  2. 在去离子蒸馏水（ddH2O）中加入 2 mL 0.9% NaCl 溶液，用于轻轻冲洗组织表面的血液（重复 3 次）。
    注意： 本实验方案中全程使用电导率为 18.2 MΩ/cm 的 ddH2O。在冲洗组织表面血液时，可能会损失部分组织。
  3. 每 0.5 - 0.6 g 组织加入 10 mL（4 °C）含 2 M 乙酸和 0.1%（v/v）β-巯基乙醇的溶液，使用组织匀浆器匀浆（1 分钟，13,000 rpm，4 °C，重复 10 次），将匀浆液超声处理 20 秒，冻干后于 −80 °C 保存。
  4. 使用二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒测定冻干匀浆样品的蛋白含量。
    注意： BCA 定量并非绝对定量，测定结果会因操作人员和实验试剂的不同而有所变化。不同实验应使用固定浓度的样品作为标准。因此，每块二维凝胶上样蛋白量的最终确定应依据预实验中银染或考马斯亮蓝染色后获得的高分辨率图像。
    1. 将约 300 µg 冻干匀浆样品加入一体积（282 µL）蛋白提取缓冲液（8 M 尿素和 4% CHAPS）中，室温静置 2 小时，水浴超声 5 分钟，旋转混匀 1 小时，再次水浴超声 5 分钟，再次旋转 1 小时，最后在 15,000 × g 离心 20 分钟。
    2. 使用商品化的 BSA 标准品（2 mg/mL）配制浓度分别为 0、25、125、250、500、750、1,500、2,000 µg/mL 的 BSA 标准溶液。
    3. 使用前将 BCA 试剂 A 与 B 按比例（A:B = 50:1）混合，配制成 BCA 工作液。
    4. 在微量离心管中，向 2 mL BCA 工作液中加入 0.1 mL 样品或标准溶液，混匀后于 37 °C 孵育 30 分钟，最后在室温冷却 10 分钟，测定 A562 nm 吸光度值。
    5. 绘制标准曲线（A562 nm 对 BSA 浓度），获得回归方程，用于根据样品的 A562 nm 值计算其蛋白含量。
  5. 对于 18 cm 非线性（NL）pH 3-10 的固定化 pH 梯度（IPG）胶条，银染使用相当于 150 µg 蛋白的冻干样品，考马斯亮蓝染色使用 500 µg 蛋白。
    注意： IPG 干胶条厚度为 0.5 mm，宽度为 3 mm，长度包括 7、11、13、18 和 24 cm，pH 范围包括 pH 4-5、4-7、6-9 和 3-10，可为线性或非线性 pH 梯度。所用 IPG 缓冲液必须与胶条匹配27,28。
  6. 向样品中加入 250 µL 提取缓冲液（7 M 尿素、2 M 硫脲、4%（w/v）CHAPS、100 mM DTT（使用前加入）、0.5% v/v Pharmalyte（使用前加入）以及微量溴酚蓝）。
  7. 保持溶液温度低于 30 °C，随后涡旋振荡 5 分钟，超声处理 5 分钟，旋转混匀 50 分钟。
  8. 加入 110 µL 重泡缓冲液（7 M 尿素、2 M 硫脲、4%（w/v）CHAPS、60 mM DTT（使用前加入）、0.5% v/v IPG 缓冲液（使用前加入）以及微量溴酚蓝），超声处理 5 分钟，然后旋转 50 分钟，涡旋 5 分钟，最后在 15,000 × g 离心 20 分钟。
  9. 收集上清液（350 µL）作为蛋白样品溶液8。

2. 二维凝胶电泳

  1. 等电聚焦（第一维）：按照以下说明，在等电聚焦系统中进行等电聚焦。
    1. 在18厘米IPG胶条槽的加样孔中加入350 µL蛋白质样品溶液。
    2. 将18 cm IPG胶条胶面朝下放入蛋白样品溶液中（避免产生气泡）。
    3. 加入3-4 mL矿物油以覆盖IPG胶条。
    4. 将IPG胶条支架安装到等电聚焦系统中，尖端朝向背面（+）板，方形端朝向前面（−）板。
    5. 室温下复水过夜（约18小时）。
    6. 设置IEF参数：每根胶条最大电流30 µA，20 °C；250 V，1 h，125 Vh，升压模式；1,000 V，1 h，500 Vh，梯度模式；8,000 V，1 h，4,000 Vh，梯度模式；8,000 V，4 h，32,000 Vh，升压模式；500 V，0.5 h，250 Vh，升压模式。总运行时间至7.5 h，累计36,875 Vh。
    7. 等电聚焦（IEF）完成后，取出每条IPG胶条，用不溶性纸巾擦去多余的矿物油。随后将胶条用塑料膜包裹，于−80 °C保存。
      注意： IPG胶条槽支架应用IPG胶条槽支架清洗液和蒸馏水清洗。
  2. SDS-PAGE（第二维）：在垂直电泳系统中进行SDS-PAGE
    注意： 每块SDS-PAGE凝胶的尺寸应为255 × 190 × 1 mm。
    1. 使用多胶灌注装置制备12% PAGE分离胶。制备12% PAGE胶时，执行以下步骤。
      1. 加入 270 mL ddH₂O2将150 mL 1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）、180 mL 40%（w/v）丙烯酰胺/双丙烯酰胺贮存液（29:1，40% w/v 丙烯酰胺和1.38% w/v N,N'-亚甲基双丙烯酰胺）、3 mL 10% 过硫酸铵和150 µL TEMED加入烧杯中配制凝胶溶液。轻轻混匀，避免产生气泡。
      2. 将凝胶溶液轻轻倒入多用制胶室中，直至达到预期的凝胶高度（19 cm）。
      3. 立即加入约 3 mL ddH₂O2在每块分离胶上加入O以覆盖凝胶。让凝胶聚合约1小时。
    2. 配制 20 L 电泳缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘油，0.1% SDS）。用该缓冲液填充电泳分离装置的缓冲液槽。
    3. 从冰箱中取出聚焦好的IPG胶条，放入4 mL还原性平衡缓冲液（375 mM Tris-HCl (pH 8.8)、6 M尿素、2% (w/v) SDS、20% (v/v)甘油、2% (w/v) DTT（使用前加入）和少量溴酚蓝）中，室温下轻轻振荡平衡10分钟。
    4. 在4 mL烷基化平衡缓冲液（375 mM Tris-HCl (pH 8.8)、6 M尿素、2% (w/v) SDS、20% (v/v)甘油、2.5% (w/v)碘乙酰胺（使用前加入）及少量溴酚蓝）中，将还原后的IPG胶条轻轻振荡平衡10分钟。
    5. 在凝胶平衡期间，拆卸多用制胶室，取出已制备的分离胶板。用ddH₂O冲洗3次。2O. 去除多余的 ddH₂O2用不溶性纸巾吸干，放入凝胶支架中。
    6. 用电泳缓冲液冲洗已平衡的IPG胶条，并用无屑纸巾吸去IPG胶条表面多余的液体。
    7. 将IPG胶条放置于分离SDS-PAGE凝胶上，使IPG胶条的塑料面接触较长的玻璃板，尖端朝向左侧。
    8. 快速将3-4 mL约80 °C的含1%琼脂糖的SDS电泳缓冲液倒入每个SDS-PAGE凝胶顶部，以密封IPG胶条；将IPG胶条的上侧朝下置于较短玻璃板的顶部，避免产生气泡，然后聚合10分钟。
    9. 将组装好的凝胶板垂直插入垂直电泳系统的塑料垫片之间。将带有IPG胶条的凝胶顶端靠近阴极（−）放置。
    10. 调节电泳缓冲液的液面高度，使其浸没胶板。
    11. 连接电源/控制单元并将其设置为恒压模式，在监测染料的同时以 200 V 运行约 370 分钟。
    12. 电泳结束后，从电泳系统中取出凝胶盒，小心地将凝胶从凝胶盒中取出，避免撕裂凝胶，随后对双向电泳分离的蛋白质进行染色。
  3. 双向电泳分离蛋白质的染色
    1. 银染
      1. 用双手将凝胶轻轻转移至含有250 mL固定液（50%甲醇（v/v）和5%乙酸（v/v））的托盘中，轻轻振荡20分钟。
      2. 弃去溶液，向托盘中加入250 mL体积分数为50%的甲醇，轻轻振荡10分钟。
      3. 弃去甲醇，加入 250 mL ddH₂O2在托盘中加入O。轻轻振荡10分钟。
      4. 在含有0.02%（w/v）硫代硫酸钠的250 mL敏化缓冲液中轻轻振荡凝胶1分钟，然后弃去液体。
      5. 轻轻摇动凝胶于250 mL ddH₂O中2O，1 分钟（重复一次）。每步结束后弃去液体。
      6. 轻轻振荡凝胶，置于250 mL银染反应液（使用前加入200 µL 37% (v/v) 甲醛的0.1% (w/v) 硝酸银溶液）中，持续20分钟。
      7. 轻轻摇动凝胶于250 mL ddH₂O中2O，1 分钟（重复一次）。每步后弃去液体。
      8. 轻轻摇动凝胶，置于250 mL显影液（使用前加入100 µL 37% (v/v)甲醛的3% (w/v)碳酸钠溶液）中，直至达到理想的染色强度（通常为1–3分钟），然后弃去液体。
      9. 轻轻振荡凝胶，置于250 mL终止液（5% (v/v) 乙酸）中10分钟，然后弃去液体。
      10. 轻轻振荡5分钟，加入250 mL ddH₂O2O，并弃去液体。
      11. 将凝胶保存在 250 mL 含 8.8% 甘油的储存溶液中，置于 4 °C 条件下。
    2. 考马斯亮蓝染色
      1. 将0.3 g考马斯亮蓝G250、25 g硫酸铵和25 mL磷酸溶解于ddH₂O中，配制考马斯亮蓝染色液2O，并加至总体积200 mL。使用前加入甲醇50 mL。
      2. 向凝胶中加入250 mL考马斯亮蓝染色液，室温下轻轻摇动，直至清晰的蛋白质条带出现（约2–4小时）。弃去液体。
      3. 加入250 mL ddH₂O2O，缓慢振荡5分钟，然后重复两次。弃去液体。
      4. 加入250 mL脱色液（20% (v/v) 乙醇），缓慢振荡直至背景颜色几乎无色，然后弃去液体。
      5. 当旧的脱色液变深时，更换为新鲜的脱色液，并弃去废液。
      6. 加入 250 mL ddH₂O2O，缓慢振荡5分钟。弃去液体。
      7. 加入250 mL保存液（8.8%甘油），于4 °C保存。
  4. 二维凝胶电泳图像分析
    1. 使用平板扫描仪对染色后的凝胶进行数字化成像。
    2. 将图像输入二维凝胶图像分析系统。
    3. 使用二维凝胶图像分析软件，按照制造商的说明书检测并量化每个蛋白点。
    4. 匹配不同凝胶之间的条带。

3. 利用质谱法鉴定双向电泳分离的蛋白质

  1. 胰蛋白酶肽段混合物的制备
    注意：应使用硅化或低吸附管及移液器吸头，以避免蛋白质或肽段的任何损失。
    1. 银染胶脱色
      1. 将凝胶斑点切下并放入一个1.5 mL硅化管中，用500 µL ddH2O洗涤6次。
      2. 将洗涤后的凝胶转移至一个新的1.5 mL硅化管中，切成许多小块（0.5–1 mm3）。
      3. 使用脱色液对凝胶小块进行脱色，脱色液为使用前等体积混合的30 mM铁氰化钾和100 mM硫代硫酸钠（1:1），加入20 µL，直至棕褐色消失（通常为1–2分钟）。弃去液体。
      4. 用20 µL ddH2O洗涤凝胶小块5–6次，直至黄色消失。每步操作后均弃去液体。
      5. 向凝胶小块中加入20 µL 200 mM碳酸氢铵，静置20分钟。再用ddH2O（20 µL，1次）洗涤凝胶小块。弃去液体。
      6. 用30 µL乙腈至少脱水两次，使凝胶小块变为不透明的白色，然后真空离心干燥30分钟。
    2. 考马斯亮蓝染色凝胶脱色
      1. 将凝胶斑点切下并放入一个1.5 mL硅化管中，用500 µL ddH2O至少洗涤3次。
      2. 将洗涤后的凝胶转移至一个新的1.5 mL硅化管中，用移液器吸头将其切成若干小块（0.5–1 mm3）。
      3. 根据凝胶体积，加入50–100 µL脱色液（200 mM NH4HCO3与乙腈按1:1 v/v混合），在37 °C水浴中孵育。重复操作并更换新鲜脱色液，直至颜色完全消失（约1小时）。每步操作后均弃去液体。
      4. 用20 µL ddH2O洗涤凝胶小块一次。
      5. 用100 µL乙腈（至少两次）脱水，使凝胶小块变为不透明的白色。
      6. 真空干燥30分钟。
    3. 干燥凝胶小块中蛋白质的原位胰蛋白酶消化
      1. 将20 µg（833 pmol）冻干胰蛋白酶粉末溶于100 µL 50 mM乙酸中。
      2. 取20 µL胰蛋白酶溶液（200 ng/µL），用230 µL 50 mM碳酸氢铵稀释至16 ng/µL。
      3. 向每个含有干燥凝胶小块的管中加入20–30 µL（0.32–0.48 µg）稀释后的胰蛋白酶溶液，在37 °C水浴中孵育18–20小时。然后在4 °C静置30分钟。
      4. 轻轻离心10秒。在30 °C水浴中超声5–6分钟，随后在12,000 × g离心2分钟。
      5. 将含有胰蛋白酶肽段混合物的上清液收集至一个0.5 mL硅化管中。
    4. 使用C18微柱纯化胰蛋白酶肽段混合物
      1. 用乙腈（10 µL，5次）洗涤每个C18柱，然后用50%乙腈（10 µL，5次）洗涤。
      2. 用0.1%三氟乙酸（TFA）（10 µL，5次）平衡。
      3. 将样品通过已准备好的C18柱反复吹打15次。
      4. 用10 µL 0.1% TFA洗涤样品2次。
        注意：纯化的胰蛋白酶肽段保留在C18柱中。
      5. 在洁净的0.5 mL硅化管中加入6 µL洗脱液（85% v/v乙腈/0.1% v/v甲酸），缓慢轻柔地将该溶液在肽段-C18填料中反复吹打10次，以将结合的肽段洗脱至溶液中，空气干燥后储存于−20 °C用于质谱分析。
  2. 质谱分析
    1. MALDI-MS肽质量指纹图谱（PMF）分析
      1. 加入4 µL 85% v/v乙腈/0.1% v/v TFA溶解纯化的胰蛋白酶肽段混合物。取2 µL溶解后的肽段混合物点样至MALDI靶板，立即加入2 µL含10 g/L α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）的溶液（溶剂为500 mL/L乙腈和1 mL/L TFA），然后空气干燥。
      2. 将点有胰蛋白酶肽段混合物的MALDI靶板装入MALDI-MS质谱仪。
        注意：仪器参数设置为反射模式，加速电压20 kV，正离子模式，延迟提取时间160 ns。在使用标准肽段质量进行外部校准后，每个质谱图采集200次激光信号，质荷比（m/z）范围为1,000至4,000。
      3. 使用质谱图处理软件对每个质谱图进行处理，包括基线校正、去噪（5%）和同位素峰去卷积。
      4. 通过去除胰蛋白酶、基质、角蛋白及其他来自空白凝胶实验中的污染峰，校正每个质谱图得到的质荷比列表。
      5. 将校正后的质荷比列表输入基于肽质量指纹图谱（PMF）的蛋白质搜索软件，在Swiss-Prot蛋白质数据库中进行搜索，搜索参数如下：PMF搜索类型，物种为人类，胰蛋白酶酶切允许最多1个漏切位点，半胱氨酸固定羧氨甲基化修饰，甲硫氨酸可变氧化修饰，单一同位素质量，肽段质量容差50 ppm，肽段电荷态（1+），信噪比（S/N）5.0。
      6. 根据具有统计学显著性的蛋白得分鉴定蛋白质，其中蛋白得分 = -10 × log(p)，p为观测到的匹配为随机事件的概率。
    2. MALDI-MS/MS分析
      1. 加入4 µL 50% v/v乙腈/0.1% v/v TFA溶解纯化的胰蛋白酶肽段混合物。取0.5 µL纯化后的肽段混合物点样于384孔MALDI靶板，立即在其上叠加0.5 µL饱和CHCA基质溶液（溶于50%乙腈/0.1% TFA），然后空气干燥。
      2. 让MALDI-TOF-TOF MS/MS系统自动运行，使用100次激光采集一张MS1谱图，并累积6次重复的MS1谱图生成一张合成MS1谱图。
      3. 从每张合成MS1谱图中选择4个最强的前体离子进行MS/MS分析。对每个前体离子使用100次激光采集一张MS/MS谱图，并累积4次重复的MS/MS谱图生成一张合成MS/MS谱图。
      4. 使用合成的MS/MS数据，通过基于MS/MS的蛋白质搜索软件进行数据库搜索，参数包括：MS/MS离子搜索，Swiss-Prot人类数据库，胰蛋白酶酶切允许最多1个漏切位点，半胱氨酸固定羧氨甲基化修饰（C），甲硫氨酸可变氧化修饰（M），单一同位素质量，肽段质量容差±100 ppm，碎片离子质量容差±0.7 Da。
      5. 根据Mowse得分的统计学显著性鉴定蛋白质，其中离子得分 = -10 × Log(P)，p为观测到的匹配为随机事件的概率。
    3. LC-ESI-MS/MS分析
      1. 加入6 µL 5% v/v乙腈/0.1% v/v甲酸溶解纯化的胰蛋白酶肽段混合物。
      2. 使用与电喷雾电离（ESI）-MS/MS质谱仪在线联用的高效液相色谱（HPLC）系统，并通过MS/MS数据采集管理软件控制整个操作流程。
      3. 使用C18捕获柱（内径300 µm × 长度5 mm）和反相C18分析柱（内径75 µm × 长度15 cm），采用以下梯度进行分离：98%溶剂A（0.1%甲酸）和2%溶剂B（100%乙腈含0.1%甲酸）维持2分钟，2%至40%溶剂B持续45分钟，40%至95%溶剂B持续5分钟，95%溶剂B维持10分钟（总运行时间65分钟，流速300 nL/min）。
      4. 设置正离子模式和数据依赖的自动扫描模式以采集MS和MS/MS谱图，并设置碰撞诱导解离（CID）用于离子碎裂。
      5. 设置每次MS扫描的质荷比范围为m/z 350–1,800，分辨率在m/z 400处为100,000。对MS扫描中强度最高的7个离子进行MS/MS扫描。
      6. 使用基于MS/MS的蛋白质搜索软件I进行数据库搜索以鉴定蛋白质。
        1. 选择人类蛋白质数据库。
        2. 选择胰蛋白酶酶切，允许最多1个漏切位点。
        3. 设置肽段质量容差（±10 ppm），碎片离子质量容差（±0.8 Da），肽段电荷态（2+、3+和4+），半胱氨酸固定羧氨甲基化修饰，甲硫氨酸可变氧化修饰。
        4. 设置错误发现率（FDR）<1%，仅接受排名为1的肽段。
        5. 鉴定满足PSM≥1（PSM：该蛋白质鉴定出的肽段序列总数，包括重复鉴定）且每个蛋白质至少含有两个唯一肽段的蛋白质。
      7. 同时使用基于MS/MS的蛋白质搜索软件II进行数据库搜索以鉴定蛋白质。
        1. 将原始质谱文件转换为.mgf格式文件。
        2. 选择人类蛋白质数据库（uniprothuman_20161031.fasta，包含70940条序列和23897047个残基）。
        3. 选择胰蛋白酶酶切，允许最多2个漏切位点。
        4. 设置半胱氨酸固定羧氨甲基化修饰（C），天冬酰胺/谷氨酰胺可变脱酰胺修饰（NQ）和甲硫氨酸可变氧化修饰（M），前体离子质量容差10 ppm，子离子质量容差0.8 Da，单一同位素峰。
        5. 鉴定具有显著性阈值0.05且至少含有2个唯一肽段的蛋白质。

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结果

1. 双向电泳-基质辅助激光解吸电离质谱肽质量指纹图谱（2DE-MALDI MS PMF）： 根据上述实验步骤，从表达FSH的无功能性垂体腺瘤（NFPA）组织（女性，50岁，ACTH（-）、GH（-）、PRL（-）、LH（-）、FSH（+）、TSH（-））中提取出总共150 µg蛋白质，使用18 cm IPG胶条（pH 3-10 NL）和大尺寸SDS-PAGE凝胶进行分离，并通过银染显色。我们获得了可重复且清晰的NFPA组织蛋白质组双向电泳图谱（图1），其在等电聚焦（IEF）方向上的平均位置偏差为1.98 ± 0.75 mm，在SDS-PAGE方向上的平均位置偏差为1.62 ± 0.68 mm；在2DE凝胶图谱中检测到约1,200个蛋白点，主要分布于pH 4-8、分子量15-150 kDa的区域3。共切取337个凝胶斑点，进行脱色、胰蛋白酶消化、胰酶肽段纯化及MALDI-TOF-MS PMF分析。利用PMF数据通过MASCO...

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讨论

二维电泳（2DE）联用质谱技术，包括2DE-MS肽质量指纹图谱（PMF）和2DE-MS/MS，已在我们长期开展的项目中成功应用——即利用蛋白质组学研究人类无功能性垂体腺瘤（NFPA）的蛋白质组变异及分子网络变化，以阐明其分子机制并发现有效的生物标志物。基于2DE的比较蛋白质组学具有良好的重复性，在鉴定NFPA蛋白质组变异方面发挥着重要作用9,10,11,12,13,19；而2DE与抗体方法联用，则在检测特定蛋白质的翻译后修饰及其变异体方面展现出优势，例如酪氨酸硝化修饰16,17,

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作由国家自然科学基金（项目编号 81572278 和 81272798，授予 XZ）、中国"863" 计划项目（项目编号 2014AA020610-1，授予 XZ）、中南大学湘雅医院人才引进基金（授予 XZ）以及中国湖南省自然科学基金（项目编号 14JJ7008，授予 XZ）资助。作者还感谢田纳西大学健康科学中心 Dominic M. Desiderio 博士在科学方面的贡献。X.Z. 自 2001 年起持续发展并应用 2DE-MS 技术分析垂体腺瘤蛋白质组，提出了本文稿的研究构想，撰写并修改了文稿，协调了相关工作，并负责经费支持与通讯事务。Y.L. 参与了文稿的修改。Y.H. 参与了参考文献的收集以及文稿的修改。所有作者均批准了最终文稿。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Ettan IPGphor 3 GE Healthcare等电聚焦系统。
Ettan DALTsix 多胶铸造仪Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II 系统Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA垂直电泳系统
Ettan IPGphor 胶条支架Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix 多胶铸造仪Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA多胶铸造仪
Voyager DE STR MALDI-TOF MS ABI, Foster City,CAMALDI-MS 肽质量指纹图谱分析
MALDI-TOF-TOFAutoflex III, BrukerMALDI-MS/MS 质谱仪
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETDThermo Scientific, Waltham, MA, USAESI-MS/MS 质谱仪
EASY-nano LC 系统 Proxeon Biosystems, Odense, Denmark高效液相色谱系统
PepMap C18 捕获柱 300 μm 内径 × 5 mm 长度；Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 柱75 μm 内径，15 cm 长度；Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipeKimvipe 不溶性纸巾
水PURELAB flex 仪器制备
Polytron Model P710/35 匀浆器Brinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuestBio-Rad,  Hercules, CA二维凝胶图像分析软件
SEQUEST Thermo Proteome Discoverer 1.3（版本号 1.3.0.339）
DataExplore（版本 4.0.0.0）软件质谱图处理软件
Mascot 软件基于肽质量指纹图谱的蛋白质搜索软件  
Mascot 软件基于 MS/MS 的蛋白质搜索软件
Proteome Discoverer 软件 v.1.3 betaThermo Scientific
Xcalibur 软件 v.2.1MS/MS 数据采集管理软件 
Uniprot 版本 201410.1_HUMAN.fasta人蛋白质数据库
SEQUEST（版本号 1.3.0.339） 基于 MS/MS 的蛋白质搜索软件 I
MASCOT（版本 2.3.02） 基于 MS/MS 的蛋白质搜索软件 II
C18 ZipTip 微柱Millipore
PeptideMass 标准试剂盒 Perspective Biosystems
Pierce BCA 蛋白质定量试剂盒 Thermo Fisher Scientific23227
2-D Quant 试剂盒GE Healthcare80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDEAMRESCO0172
ACRYLAMIDEAMRESCO0341
DTTSigma-AldrichD0632
硫脲Sigma-AldrichT8656
尿素VETECV900119
SDSAMRESCO0227
CHAPSAMRESCO0465
TEMEDAMRESCOM146
过硫酸铵AMRESCOM133
胰蛋白酶Promega, Madison, WI, USAV5111
IPG 缓冲液 pH 3-10, NLGE Healthcare17-6000-87
Immobiline 干胶条 pH 3-10NL, 18cmGE Healthcare17-1235-01

参考文献

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