成年小鼠背根神经节外植体与分离细胞模型用于研究神经可塑性及对包括病毒感染在内的环境损伤的反应

摘要

本报告重点介绍了利用小鼠背根神经节的器官型培养和分离的原代培养体系，以研究与神经元-胶质细胞相互作用、神经可塑性、神经炎症以及对病毒感染反应相关的多种机制。

摘要

本方案描述了一种 离体 小鼠背根神经节（DRG）外植体模型 体外 背根神经节来源的感觉神经元与卫星胶质细胞共培养模型。该模型是研究外周神经系统（PNS）在生理与病理条件下多种生物学反应的有用且多功能的工具，涵盖神经元-胶质细胞相互作用、神经可塑性、神经炎症以及病毒感染等研究领域。相较于简化的单细胞模型，背根神经节（DRG）组织块培养在科学上具有多重优势。例如，作为一种保留组织结构特征的培养系统，DRG组织块培养能够 离体 包括对所有神经元和胶质细胞功能起重要作用的细胞外微环境在内的完整神经网络的转移。此外，背根神经节（DRG）外植体也可被维持 离体 数天，且可根据需要调整培养条件。此外，收获的DRG可进一步解离为单个细胞 体外 背根神经节外植体系统可实现初级感觉神经元与卫星胶质细胞的共培养，用于研究神经元-胶质细胞相互作用、神经突发生、轴突生长锥与细胞外微环境的相互作用，以及更广泛的与神经元代谢相关的各类过程。因此，该系统具有高度灵活性，能够以较低成本研究多种与生物学、生理学及病理学状态相关的事件。

引言

在本文中，我们报告了一种获取源自小鼠背根神经节（DRG）的器官型ex vivo模型系统的方法，该模型可保留类似组织的微环境，用于研究周围神经系统（PNS）损伤后多种生物学反应，包括神经元-胶质细胞相互作用、神经可塑性、炎症标志物以及病毒感染等。此外，我们进一步开发了一种建立原代共培养体系的方案，即由DRG来源的单个感觉神经元与卫星细胞共同培养。

背根神经节（DRG）是位于中枢神经系统（CNS）之外、沿脊神经背侧根分布的卫星状灰质结构。DRG 位于椎间孔附近，内含假单极感觉神经元和卫星胶质细胞。这些假单极神经元具有一条单一的神经突，该神经突分为外周突和中枢突：外周突将来自外周靶组织的躯体和内脏感觉信号传递至胞体，而中枢突则将感觉信息从胞体传入中枢神经系统。一层结缔组织被膜将这群位于外周的神经元和胶质细胞与中枢神经系统分隔开来。迄今为止，尚未发现有任何出生后细胞迁移进入或离开 DRG 的现象，其局部的干细胞微环境负责维持终生持续发生的神经发生事件¹。因此，该模型特别适用于研究成年神经发生、轴突发育、创伤性损伤后的反应以及细胞死亡过程^2,3,4,5,

方案

所有实验操作，包括动物的使用，均已获得机构审查委员会批准的方案（IACUC- Midwestern University）的许可。

1. 从小鼠胚胎中分离背根神经节

1. 采用窒息法（CO₂）处死成年小鼠，随后进行断头。立即开始手术切除脊柱。
   1. 使用精细剪刀沿背部切开皮肤层，暴露脊柱。在脊柱两侧切断肋骨，并切断骶骨，将脊柱与动物其他部分分离，从而游离脊柱。
   2. 用针或固定针将脊柱腹侧朝上固定于手术垫上。
2. 使用精细剪刀在椎体两侧进行双侧切割，以暴露椎管的腹侧。
3. 在手术显微镜下（放大倍数设为4倍），用剪刀轻轻将脊髓向一侧移动，以暴露对侧背根神经，并沿周围神经的背根定位背根神经节（DRG）。每个神经节部分隐藏在椎间孔内。
4. 为收获DRG，用一把镊子夹住背根（位于脊髓与DRG之间），轻轻将DRG从椎间孔中拉出。
5. 将第二把镊子置于DRG外周的脊神经上，连同脊神经和背根一起牵拉DRG。
6. 将收集的DRG置于含有3 mL冰浴无血清培养基（SFM）³⁴的35 mm培养皿中。
7. 将每个单独的DRG转移至干燥的玻璃培养皿中，在手术显微镜下，使用刀片清除并修剪仍附着在DRG上的多余纤维和结缔组织。D....

结果

利用背根神经节（DRG）及其单细胞分离培养模型，可研究神经可塑性及神经元与环境相互作用的多个方面。我们首先按照图1所示的示意图，分离出DRG组织块及来源于DRG的单细胞。无论是组织模型还是单细胞模型，均可根据实验设计和研究目的，采用多种分子生物学技术进行分析，如免疫荧光、蛋白质印迹（Western blot）、基因组检测及其他分析技术。首先，我们使用DRG组织块模型研究了生化信号对轴突生长的影响（图2）。在双标或三标免疫荧光染色中，确认了波形蛋白（peripherin）（图2A、B；红色）和β-微管蛋白（β-tubulin）（图2A、B；绿色）在神经元胞体及周围神经突起中的差异性表达。细胞核通过Hoechst染色标记（图2A；蓝色）。在使用4%多聚甲醛固定并进行切片处理后，我们进一步在完整的DRG组织块中分析了上述标志物的表达情况（

讨论

这 离体 DRG 模型对于研究多种事件极为有用，例如神经元-胶质细胞相互作用，以及微环境对神经元和胶质细胞代谢的影响³⁷此外，通过建立体外模型，DRG模型可作为一种经济高效的工具，用于研究发病机制及相关标志物的关键科学问题。 体内 可用于感染的急性期、慢性期和潜伏期，或特定疾病的研究。此外，利用背根神经节外植体构建的小分子筛选文库可借助该外植体模型进行药物开发。 体外 模型，尤其是单细胞系统，往往过于简化，难以与生理学上相关事件建立关联；而 体内 模型难以进行精确操控，部分原因在于损伤后的免疫反应、胶质瘢痕形成、周围细胞外基质（ECM）的复杂性以及高昂的经济成本。相比之下，背根神经节（DRG）外植体是一种能够保留组织原有结构的器官型培养系统，可允许 离体 包含神经元网络及其在神经元和胶质细胞功能中起重要作用的细胞外微环境在内的完整器官移植。然而，一种 离体 模型只能模拟但无法完全再现所发现的全部条件 体内使用该模型时需注意两个重要局限性：一是时间因素，二是缺乏系统性.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
成年小鼠 NIH/Swiss	Harlan Laboratories
35 mm 培养皿	Cell Treat	229635
Matrigel 胞外基质	Sigma-Aldrich	E1270	明胶状蛋白混合物
F12 培养基	Gibco	11765-054	*SFM 培养基组分
IV 型胶原酶	Sigma-Aldrich	C5138
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	25200-056
胎牛血清（FBS）	Sigma-Aldrich	F6178
0.22 µm 滤器	BD Falcon	352350
Neurobasal 培养基	Gibco	10888-022
B27 添加剂	Gibco	17504-044	神经元培养添加剂
PSN 抗生素	Gibco	15640-055	*SFM 培养基组分 抗生素混合物
L-谷氨酸	Sigma-Aldrich	G7513	*SFM 培养基组分
神经生长因子（NGF）	Alomone Labs	N-100	神经生长因子
层粘连蛋白包被盖玻片	Neuvitro	GG-14-Laminin
ONPG 底物	Pierce	34055
X-gal	Invitrogen	15520034
抗 β-微管蛋白抗体	Sigma-Aldrich	T8328	1:2000 稀释
抗周围蛋白抗体	Millipore	AB1530	1:1000 稀释
Hoechst 染料	Thermo Fisher	62249	终浓度 1.5 µM
抗硫酸乙酰肝素抗体	US Biological	H1890-10	0.180555556
抗 gD 抗体	Virostat	196	1:10 稀释
BSA	Sigma-Aldrich	A2153-100G	*SFM 培养基组分
β-巯基乙醇（BME）	Gibco	21010-046	*SFM 培养基组分
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021-1KG	*SFM 培养基组分
KIT（胰岛素-转铁蛋白-硒-A）	Gibco	51300-044	*SFM 培养基组分
维生素 C	Sigma-Aldrich	A4403	*SFM 培养基组分
腐胺	Sigma-Aldrich	P7505	*SFM 培养基组分
488（山羊抗小鼠）	Life Technologies	A11029
Cy3（山羊抗兔）	Jackson Immunoresearch Laboratories	111-165-003
正常山羊血清	Vector	S-1000
福尔马林溶液	Sigma-Aldrich	HT5014-120ML
PBS	Gibco	10010-031
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
VectaShield	Vector	H-1500	荧光封片剂
钻石白玻璃盖玻片	Globe Scientific	1380-20