这种新开发的基于荧光的技术能够对自由活动小鼠的视交叉上核（SCN）中昼夜节律钟基因的转录进行长期、实时且高时间分辨率的监测。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
该技术结合了光纤介导的荧光记录与基于重组腺相关病毒的基因报告系统的精确递送。这一新颖且易于使用的方法 体内 开发了荧光监测系统以记录钟控基因的转录节律， Cry1，位于自由活动小鼠的视交叉上核（SCN）中。为此，需进行以下操作： Cry1 转录荧光报告系统被设计并包装至腺相关病毒中。纯化浓缩后的病毒被注射到小鼠视交叉上核（SCN），随后植入光纤并固定于脑表面。动物被放回其原饲养笼中，并给予1个月的术后恢复期，以确保报告基因充分表达。随后通过光纤在自由活动的小鼠中记录荧光信号 体内 我们机构构建的监测系统。对于 体内 记录系统采用488 nm激光器，并耦合一个1×4光束分束器，将光均分为四束功率相等的激光激发输出。该装置使我们能够同时记录四只动物的信号。每一路发射的荧光信号均通过光电倍增管和数据采集卡进行收集。与先前的生物发光相比 在体 昼夜节律时钟记录技术，这种荧光 体内 记录系统可记录光周期期间昼夜节律钟基因的表达。
引言
在哺乳动物中，视交叉上核（SCN）调控全身的昼夜节律，以协调个体对体外环境变化的反应例如光照、温度、胁迫 等等。)1核心生物钟组分包括 Per1-3, Cry1-2, 时钟，以及 Bmal1，并在调控每个细胞的昼夜节律钟中发挥核心作用。SCN中的每个细胞都含有转录激活因子CLOCK/BMAL1，该因子以异源二聚体形式发挥作用，诱导PER和CRY的表达。随后，PER/CRY复合物抑制CLOCK/BMAL1的功能，形成一个约需24小时完成的转录-翻译负反馈环路。2,3.
以往关于视交叉上核（SCN）的研究主要采用ex vivo SCN脑片培养方法4,5,6。尽管该方法提供了有价值的信息，但其局限性阻碍了我们获取有关其他脑核对SCN影响的数据，以及外源性刺激（例如，光）对位于这一关键区域细胞的作用。2001年，Hitoshi Okamura的研究团队首次利用生物发光系统在自由活动的小鼠中对SC....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本方案中的所有操作均经北京生命科学研究所机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并符合中国政府的相关法规。
1. Cry1 荧光报告系统的构建
注意：以往利用生物发光系统进行的昼夜节律研究2,12,13，通常将昼夜节律启动子与不稳定的luciferase（dLuc）融合，以诱导dLuc的节律性表达。为了开发一种荧光报告系统，本研究将不稳定的luciferase替换为不稳定的荧光蛋白（dVenus），以实现dVenus的节律性表达。下文将描述P(Cry1)-dVenus报告系统的构建过程，该载体目前正在提交至Addgene，即将对学术研究开放使用。
- 扩增小鼠功能性的 Cry1 启动子（Cry1 基因的 +328 至 -1208 bp 区域，转录起始位点定义为“-1”）。使用 PCR 酶（KOD Plus Neo）、引物 F1 和 R1（见表 2）、小鼠基因组作为模板，并按照制造商的 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
Cry1 荧光报告系统的设计如图1A所示。采用上述方法，将500 nL的rAAV-P(Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2成功注射到成年小鼠的视交叉上核（SCN）中，并观察到强烈的Venus表达信号（图1B、1C）。在12小时光照/12小时黑暗（LD）和持续黑暗（DD）条件下记录的荧光信号（图2）均显示出显著的昼夜节律。最后，在长光周期和短光周期条件下也记录了荧光信号（图3）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
与……相比 离体 方法，例如脑片培养4,5，逆转录聚合酶链式反应16，以及 原位 杂交17，这需要杀死动物， 体内 记录方法使研究者能够在活体动物中研究昼夜节律基因的表达。因此，该技术能够评估不同物理扰动的影响（例如睡眠剥夺、压力、食物摄入 等等。) 对神经昼夜节律钟的影响。与之相反， 体内 生物发光7,8,10 只能在恒定黑暗条件下起作用的方法，其荧光 体内 记录方法可在光照条件下应用——这一技术优势在于光照信号能够重新同步SCN昼夜节律钟18尽管通过该方法能够检测到相.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢张实验室成员提供的富有启发性的讨论，以及詹实验室成员提供的技术支持。本研究得到了国家自然科学基金（NSFC）资助项目31500860（资助对象：C.Z.）、中国科技部973计划项目2012CB837700（资助对象：E.E.Z. 和 C.Z.）以及北京市政府资金的支持。E.E.Z. 受到中国“海外高层次青年人才引进计划”"Recruitment Program of Global Youth Experts"的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | 试剂 |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | 质粒 |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | 质粒 |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | 质粒 |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | 试剂 |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | 试剂 |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | 试剂 |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | 试剂 |
| 注射器滤器 | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap 肝素柱 | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 离心滤管 | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| 苯甲酸核酸酶 | Sigma-Aldrich | E1014 | 试剂 |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | D5670 | 每批次需新鲜配制 |
| 小鼠立体定位仪 | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | 设备 |
| 戊巴比妥 | SigmaAldrich | #1507002 | 试剂 |
| 小鼠立体定位仪 | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | 设备 |
| 过氧化氢溶液 | SigmaAldrich | #216763 | 试剂 |
| 光纤 | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA，Ø200 µm |
| 微量注射泵 | Nanoliter 2000 Injector, WPI | 设备 | |
| 陶瓷套管 | Shanghai Fiblaser | 230 μm 内径，2.5 mm 外径 | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | 设备 |
参考文献
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).
- Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nature Revie....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
