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方法文章

建立患者来源软组织肉瘤的原代培养

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DOI：

10.3791/56767

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2018年4月11日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Pathology Unit, Morgagni-Pierantoni Hospital, 3Unit of Surgery and Advanced Oncologic Therapies, Morgagni-Pierantoni Hospital

本文内容

摘要

以下实验方案重点介绍建立患者来源的软组织肉瘤（STS）原代培养的方法。该模型有助于我们更深入地理解这些罕见恶性肿瘤的分子基础和药物反应特征，并可为后续改善STS治疗策略的研究提供起点。

摘要

软组织肉瘤（STS）是一类具有高度异质性的恶性肿瘤，其诊断、分类和治疗均较为困难。迄今为止，已鉴定出超过 50 种此类罕见实体瘤的组织学亚型。由于其极度的多样性及较低的发病率，目前对这类肿瘤生物学特性的认识仍然有限。来源于患者的细胞培养模型是研究 STS 病理生理学和药理学的理想平台。因此，我们建立了一种人源性 STS 临床前模型，起始于接受手术切除的患者肿瘤组织标本。通过胶原酶消化并结合过滤法，从手术标本中获得患者来源的 STS 细胞培养物。细胞经计数后接种，在标准单层培养条件下培养 14 天，随后进行后续分析。在开展分子或药物学分析之前，通过评估细胞形态学特征以及在条件允许时结合免疫组织化学标志物，确认 STS 原代培养的成功建立。该方法提供了一种有效工具：1）用于研究这些尚未充分探索的恶性肿瘤的自然发展过程；2）用于测试不同药物的作用效果，以进一步了解其作用机制。

引言

软组织肉瘤（STS）是一类起源于间叶组织的异质性病变，占所有实体瘤的1%1,2，根据最新的世界卫生组织分类，已确认存在50多种不同的亚型3。其中最常见的组织学类型是脂肪细胞肉瘤（即脂肪肉瘤）和平滑肌肉瘤，分别占成人STS的15%和11%4,5。尽管STS可发生于身体的不同部位，但最常见的是四肢和腹膜后，分别占病例的60%和20%6。

局部病变的治疗基石是广泛性外科切除，而辅助化疗和新辅助化疗的益处尚不明确，仅在部分特定病例中予以考虑7。在转移性情况下，化疗是标准治疗方案，但疗效有限8。深入理解软组织肉瘤（STS）的分子生物学机制，将有助于改进现有的鉴别诊断、优化现有治疗方案，并发现新的治疗靶点。

在此背景下，研究人员多年来一直利用永生化细胞系开展癌症相关研究9这些实验模型通常在标准的单层培养支持物中培养，或植入免疫缺陷型啮齿类动物体内以建立 体内 异种移植模型10永生化细胞系是一种易于操作和保存的材料，可用于开展大量科研实验。事实上，它们是临床前研究中最经济且应用最广泛的工具。11.

然而，基于细胞系的癌症模型也存在一些局限性， 例如 在单层培养体系中长期培养并随着传代次数的增加，会导致细胞出现表型和遗传漂变，使其难以重现肿瘤的关键特征。此外，细胞系培养无法模拟细胞间的相互作用以及信号分子之间的交互对话，而这些正是肿瘤生物学行为和肿瘤微环境的重要特征。上述问题构成了临床前研究与临床结果之间存在差异的基础。12.

鉴于上述情况，人们对患者来源的原代培养物的兴趣日益增加13确实，切除恶性组织和正常组织可降低癌细胞表型和异质性丢失的风险，从而提供更能代表肿瘤微环境的起始材料。此外，利用接受手术切除的患者所提供的新鲜肿瘤标本，使我们能够研究单个肿瘤，并比较来自患者体内相同部位的不同病灶。14因此，来源于组织的细胞培养物为研究肿瘤的病理生理学和药理学提供了宝贵的材料15,16,17，尤其是在STS中，可获得的商用肉瘤细胞系十分有限18因此，我们优化了一种从手术切除的肿瘤组织中建立患者来源的软组织肉瘤原代细胞培养的方法。13,19,20我们的方法包括将肿瘤标本分解为小的组织碎片，随后进行过夜酶消化以获得单细胞悬液。次日，通过添加新鲜培养基终止酶消化反应，并将所得悬液过滤，以去除组织碎片、细胞聚集体以及过量的基质成分或碎片。最后，取部分分离的肿瘤细胞通过细胞离心涂片法接种于玻片上，固定后保存，用于后续分析，以通过细胞形态学、免疫组织化学及分子细胞遗传学评估确认软组织肉瘤原代培养的建立例如 FISH 分析 MDM2 扩增是用于区分高分化脂肪肉瘤与去分化脂肪肉瘤的标准鉴别诊断方法4将剩余细胞接种至标准的单层培养体系中，用于基因表达谱分析和药理学研究。所有实验均采用低传代次数的原代培养细胞，以避免特定癌亚克隆的选择性生长，并由经验丰富的肉瘤病理学家进行分析。由此，我们建立了完全来源于人类的STS模型。 离体 模型13,19,20这种高度通用且易于操作的模型可为多种类型的临床前研究提供一种有用的工具， 例如 以识别用于诊断和预后的新型分子标志物，或更深入地理解在软组织肉瘤（STS）治疗中所使用的常规及新型药物的活性与作用机制。

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方案

STS 细胞是从接受手术切除的 STS 患者肿瘤组织中分离得到的。该方案已获得当地伦理委员会批准，并依据《良好临床实践指南》和《赫尔辛基宣言》进行。所有患者均签署书面知情同意书，自愿参与本研究。手术标本由经验丰富的肉瘤病理学家进行分析，并在手术后 3 小时内进行处理。

1. 肿瘤标本的采集与处理：

  1. 在肉瘤病理学家的协助下，将肿瘤标本采集至含有50 mL DMEM低糖培养基的100 mL无菌尿液容器中，并用石蜡膜密封。
  2. 将样本在肿瘤切除后于4 °C下保存，时间不超过3小时。
  3. 所有以下步骤均须在无菌细胞培养罩内进行。
    1. 用70%乙醇对超净台进行消毒，并佩戴无菌手套。
    2. 用70%乙醇对不锈钢镊子进行灭菌（使用无菌纱布）。
    3. 移除尿液容器上的石蜡膜并丢弃。
    4. 用70%乙醇擦拭尿液容器外表面。
    5. 打开一个方形培养皿。
    6. 打开尿液容器，使用灭菌的不锈钢镊子将肿瘤标本转移至方形培养皿中。
  4. 用 PBS 清洗肿瘤样本两次。
  5. 打开一把无菌手术刀。
    1. 将肿瘤标本精细剪碎成 1 - 2 mm3 片
    2. 在2 mL离心管中收集总样本的四分之一。
    3. 向离心管中加入1 mL Trizol试剂（购自供应商），立即在-80 °C下冷冻（该样品将用于后续的STS基因表达分析）。
  6. 将剩余的细碎肿瘤组织收集到一个15 mL离心管中。
    1. 加入4 mL I型胶原酶溶液（I型胶原酶溶于PBS中，浓度为4 µg/mL）。
    2. 将 I 型胶原酶溶液用 4 mL DMEM 高糖培养基稀释（I 型胶原酶的终浓度为 2 µg/mL）。
    3. 关闭15 mL离心管并用石蜡膜密封。
    4. 将15 mL离心管置于37 °C培养箱中的滚轴摇床上，振荡条件下孵育15分钟，以激活消化反应。
    5. 15 分钟后，将试管置于滚轴摇床中，室温下搅拌过夜。
  7. 次日将15 mL离心管置于无菌操作台内。
  8. 将细胞悬液轻轻通过连接在50 mL管顶部的100 µm无菌滤网过滤。
  9. 用添加了10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基洗涤滤膜。
  10. 弃去100 µm无菌滤器，盖紧50 mL离心管，于室温下以225 × g离心5分钟。
  11. 将试管倒置，弃去上清液。
  12. 用含10%胎牛血清和1%谷氨酰胺的1–2 mL DMEM高糖培养基重悬细胞， 1% 青霉素/链霉素
    注意： 体积取决于所处理肿瘤样本的量。
  13. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
    1. 将样品用台盼蓝按1:2比例稀释，取10 µL稀释液进行细胞计数。
    2. 至少重复计数两次，计算复孔的平均值，以确定收集的细胞总数。
  14. 以每平方厘米80,000个细胞的密度将细胞接种于标准单层培养体系中2.
    注意： 实验中务必设置对照组。每种条件至少进行3次技术重复，至少进行2次生物学重复。对于临床前药理学、基因表达和蛋白质表达分析，实验应在细胞接种后30至45天内、低代次培养条件下进行，以避免癌细胞表型丢失。
  15. 细胞学样本制备
    1. 收集100,000个细胞于200 µL含10%胎牛血清和1%谷氨酰胺的DMEM高糖培养基中， 1% 青霉素/链霉素
    2. 将溶液（使用200 µL移液器）移入装有滤膜并固定在玻璃片上的一次性漏斗中。
    3. 打开细胞离心机并插入样品。
    4. 以18.6 × g离心20分钟。
    5. 丢弃装有滤膜的漏斗。
    6. 将载玻片在丙酮中固定10分钟，随后在氯仿中固定5分钟。
    7. 将载玻片置于 -20 °C 保存。
      注意： 在染色前解冻并水化样本，并按照制造商说明书进行染色。至少准备3个技术重复样本。

2. STS 细胞培养：

  1. 每周更换一次培养基（DMEM高糖培养基，添加10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素）。
    1. 使用200 - 1,000 µL移液器弃去培养基。
    2. 使用200 - 1,000 µL移液器加入新鲜培养基。
    3. 细胞传代：
      1. 当细胞融合度达到约90%时进行细胞消化：
        注意： STS细胞的扩增培养应根据培养条件每周进行一次。
      2. 弃去培养基，用PBS洗涤，并加入2-3 mL含1x胰蛋白酶的PBS
        注意： 胰蛋白酶的使用体积取决于所获得的培养细胞量。
      3. 在37 °C下孵育3 - 5分钟。
      4. 使用200 - 1,000 µL移液器从培养板中收集已脱落的细胞。
      5. 将收集的细胞移入15 mL离心管中，并加入4 mL DMEM高糖培养基（添加10%胎牛血清、1%谷氨酰胺 和1%青霉素/链霉素）以终止酶反应。
      6. 在室温下以225 × g离心5分钟。
      7. 弃去上清液。
      8. 加入1 mL DMEM高糖培养基（添加10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素）重悬细胞沉淀。
      9. 根据制造商说明，将细胞接种至新的培养板或培养瓶中，调整终体积。
        注意： 细胞传代比例不得超过1:3。

3. 下游分析：

注意： 可使用此模型开展多种不同的实验（见下文）。因此，在研究设计阶段必须确定将要进行哪些分析，以便准备足够数量的样本和重复实验。

  1. 增殖实验，如 MTT 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐实验
  2. 凋亡检测实验，如末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）实验
  3. 免疫组织化学分析
  4. 基因表达分析
  5. 蛋白质印迹分析（Western blot）
  6. 酶联免疫吸附实验（ELISA）
  7. 荧光激活细胞分选（FACS）分析
  8. 体内异种移植模型

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结果

我们设计了一种简单的方法，用于建立患者来源的软组织肉瘤原代培养，并在此报告针对一种特定STS组织学亚型所获得结果的示例13。该方案已用于建立多种STS组织学亚型的原代培养，包括高分化脂肪肉瘤、去分化脂肪肉瘤、黏液样脂肪肉瘤、多形性脂肪肉瘤、黏液纤维肉瘤、未分化多形性肉瘤、胃肠道间质瘤（GIST）以及硬纤维瘤样纤维瘤病。

接受化疗、放疗或未接受治疗的患者来源手术标本的原代培养建立成功率为54%（24例软组织肉瘤手术样本中获得13例原代培养）。相比之下，仅来自未经治疗患者的手术样本的成功率为72%（18例软组织肉瘤手术样本中获得13例原代培养）。

肿瘤细胞取自一位54岁患者手术切除的高分化/去分化脂肪肉瘤（ALT/DDLPS）。对该样本进行的MDM2基因扩增分析结果为阳性，该分析目前作为A...

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讨论

需要明确定义的临床前模型，以阐明肿瘤的分子基础、预测不良预后，并为癌症患者开发新的治疗策略。这对于组织形态、侵袭潜力和临床行为高度异质的罕见肿瘤（如软组织肉瘤，STS）尤为重要，因为这种异质性挑战着我们对STS生物学特性及患者管理的理解21。此外，目前可用的商业化肉瘤细胞系较少，限制了对这类间叶源性肿瘤的临床前研究18。ex vivo模型因此成为STS研究的重要资源。我们建立了一种完全来源于人源手术切除肿瘤组织的in vitro STS模型（图3）。在方法优化过程中，我们识别并解决了若干关键问题。第一个问题是手术治疗与样本处理之间的时间间隔。最初，当肿瘤标本在术后一段时间送达我们的生物科学实验室后，会于4 °C保存过夜，并在次日进行处理。从这些样本中分离出的STS细胞在标准单层培养条件下表现出较低的增殖活性和较差的存活率。部分原因可能是整个肿瘤标本在处理前长时间存放在尿液容器中。因此，我们将样本处理的起始时间调整为术后最多3小时内，以确保原代培养细胞在标准单层培养中持续增殖...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢Gráinne Tierney提供的编辑协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM 高糖EuroCloneECB7501L
胎牛血清EuroCloneECS0180D
谷氨酰胺Gibco25030-024
4% 甲醛水溶液，电镜级Electron Microscopy Sciences157-4-100
青霉素-链霉素Gibco15140122
Triazol 试剂Ambion Life-Technologies15596018
胰蛋白酶EuroCloneECB3052D

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