方法文章

一种改进的麻醉小鼠脑脊液采集方法

DOI：

10.3791/56774

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2018年3月19日

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1Shanghai Advanced Research Institute, University of Chinese Academy of Sciences, Chinese Academy of Science, 2Shanghai Institute of Materia Medica, University of Chinese Academy of Sciences, Chinese Academy of Science, 3Center of Functionally Integrative Neuroscience, Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 4Sino-Danish Center for Education and Research (SDC), 5Department of Neurology, Xinhua Hospital Chongming Branch Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 6Department of Nuclear Medicine and PET-centre, Aarhus University Hospital

本文内容

摘要

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本协议描述了一种改进的技术, 用于丰富的脑脊液 (CSF), 不污染血液。随着样品的收集和纯度的增加, 可以通过脑脊液进行更多的分析, 进一步了解影响大脑和脊髓的疾病。

摘要

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脑脊液 (CSF) 是一种有价值的体液, 用于分析神经科学研究。它是最接近中枢神经系统的液体之一, 因此可以用来分析大脑或脊髓的患病状态而不直接进入这些组织。然而, 小鼠由于与血管的亲近而难以从大池获得, 这通常会污染样本。小鼠的脑脊液采集面积也很难解剖, 而且通常只有小样本 (最多5-7 µL 或更少)。该协议详细描述了一种技术, 改进现有的收集方法, 以尽量减少血液污染, 并允许大量收集脑脊液 (平均10-15 µL 可以收集)。这种技术可以与其他解剖方法, 从小鼠组织收集, 因为它不会影响任何组织在脑脊液提取。因此, 大脑和脊髓不受这种技术的影响, 并保持不变。随着脑脊液样品的收集和纯度的增加, 更多的分析可以用来进一步帮助神经科学研究, 更好地了解影响大脑和脊髓的疾病。

引言

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脑脊液是一种有价值的体液, 用于分析神经科学研究。脑脊液主要由血浆组成, 含有少量细胞 (没有红细胞, 只有少数白细胞), 几乎无蛋白质。它是与中枢神经系统 (CNS) 紧密接触的液体之一, 它可以将许多电解质从大脑和脊髓传给外围系统。在人类中, 可以收集脑脊液样本以帮助诊断疾病或临床试验中的研究目的, 因为脊椎穿刺 (或腰椎穿孔) 是一种轻微的侵入性手术: 脑脊液可以反映中枢神经系统的变化, 而无需直接访问这些组织.因此, 近年来, 为临床研究目的, 脑脊液样本已获得从神经退行性疾病的患者, 如阿尔茨海默病和其他痴呆1,2,3。有许多生物标志物的研究已经开发使用脑脊液样本, 以潜在的帮助诊断疾病的诊所2,3。然而, 对于这些化验的可靠性, 有很多争论, 以产生一致的, 敏感的结果, 专门诊断疾病4,5。因此, 有必要发展更好的检测和指标, 可以在脑脊液中找到, 以帮助生产一种标准技术, 以更大的灵敏度和特异性诊断神经变性疾病。由于人体脑脊液样本在疾病中的潜在重要性, 在神经科学研究中采集啮齿目动物的脑脊液也很有兴....

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方案

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所有动物实验都是按照神经科学学会 (美国) 和复旦大学 (中国上海) 伦理委员会的政策进行的。这个程序是为非生存手术。

1. 脑脊液采集装置的设置

  1. 使用微拉拔玻璃毛细管 (内径为0.75 毫米, 外径1.0 毫米) (如刘et所示)。10;锐毛毛细管显示在图 1中)。
  2. 将锐尖的玻璃毛细管放入牢固安装在机器人上的毛细管支架上 (图 1A)。
  3. 在解剖显微镜下用直钳折断锐毛毛细管的尖端, 使断尖的内径约为10-20 µm (图 1C)。
  4. 将细管和注射器连接到毛细管支架的另一端, 并用三通阀将薄壁管与注射器相连。
  5. 将三路阀门打开, 然后将注射器从注射器中吹出空气, 通过油管向玻璃毛细管排放, 以排出任何污染物, 并在毛细管管内产生正压。
  6. 重复这几次通过不连接和重新连接注射器到三路阀门, 并提请注射器100-200 µL 之前, 注射器的最后重新连接与三通阀 (图 1B)。
  7. 将机器人与玻璃毛细管移动到侧面以防止在小鼠解剖过程中造成损伤。
    8. ....

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结果

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使用此处概述的过程 (图 1和图 2), 立即在毛细管中收集的 CSF 应该是清晰的 (图 2E), 而不是粉红色或红色。如果在毛细管中收集的液体中有粉红色到红色的色调, 那么就会有血液污染。

以该方法采集的脑脊液样品的应用为例, 用 ELISA 法测定了蛋白质淀粉样蛋白β (Aβ) 的含量。Aβ在脑脊液中的含量在阿尔茨海默氏病研究中通常被测量为7。脑脊液主要是无蛋白的。在小鼠阿尔茨海默病 (APP/PS1 小鼠) 模型中, 人类 Aβ42的水平显著增加, 这些小鼠过度表达 tshr 人类应用。这可以观察到从12月大的老鼠收集的脑脊液样本使用这里描述的方法 (野生型 (小鼠) 脑脊液中的 0 pg/毫升与 .......

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讨论

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本协议详细描述了一种技术, 它改进了现有方法10脑脊液收集, 以最大限度地减少血液污染, 并允许大量收集脑脊液 (平均约10-15 µL 可获得) 从小鼠。当打破毛细管尖端, 毛细管的尖端不应该太小 (因为然后脑脊液将被提取非常缓慢) 或太大 (将不够罚款, 以收集脑脊液和组织可以成为在毛细管)。在解剖脑脊液收集区域时应注意: 应停止任何出血, 并将玻璃毛细管的插入区域与 dH20 一起清除, 以避免样品污染。每只老鼠的解剖是不同的, 但大多数老鼠有1-2 主要的血管运行通过毛细血管需要插入的地方脑脊液收集。选择正确的插入毛细管的地方是很重要的, 因为插入太靠近主要血管会污染脑脊液与血液。如图 2所示, 一个区域明显的血管, 如在主血管的两边或两侧, 是最佳的毛细管插入, 以避免污染。如果脑脊液不以稳定的速度流出, 并在一段时间后停止, 抽取注射器少许 (~ 50 µL) 可以帮助重新启动脑脊液流向毛细血管。或者, 毛细管本身可以轻轻地和缓慢地移动或离开鼠标与机器人重新启动脑脊液提取流。在做这些步骤时必须小心.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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这项工作得到了中国国家自然科学基金 (81650110527、81371400) 和中国国家重点基础研究项目 (2013CB530900) 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
水合氯醛（用作麻醉剂）国药化工 Reagen Co. Ltd.30037517CAS 号 302-17-0。
解剖剪刀66 视觉技术54002
解剖弯曲镊子66 视觉技术53072
解剖直镊子66 视觉技术53070
鼠标适配器（带耳杆）内部制造。N/A可从 World Precision Instruments 获得类似设备。
解剖显微镜明治LabaxModel 15381
显微作器World Precision InstrumentsM3301
显微作器磁性底座KanetecMB-K
玻璃毛细管World Precision Instruments1B100-4
微量移液器拉拔器Sutter InstrumentsModel P-1000
注射器 （1ml）Tansoole020246921ml 用。
微管 （1.5ml）AxygenMCT-150-C
蛋白酶抑制剂 鸡尾酒套装 III 不含 EDTA钙生化学539134
人 A&β;42 ELISA 试剂盒InvitrogenKHB3441
管道（特氟龙管）World Precision InstrumentsMMP-KIT从显微注射试剂盒中获得，并连接到毛细管支架和注射器上。
迷你离心机Tiangen BiotechOSE-MC8
棉签从任何家庭商店/药房获得。不适用
的

参考文献

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  1. Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
  2. Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol....

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