本方案描述了一种改进的技术，可用于大量采集无血液污染的脑脊液（CSF）。通过获取更多且更纯净的样本，可利用脑脊液开展更多分析，从而加深对影响脑和脊髓疾病的认知。
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摘要
摘要
脑脊液（CSF）是神经科学研究中一种有价值的体液，因其与中枢神经系统接触最为密切，故可用于分析脑或脊髓的病变状态，而无需直接获取这些组织。然而，在小鼠中，由于延髓池靠近血管，采集脑脊液时常受到血液污染，导致样本质量受限。此外，小鼠脑脊液采集区域解剖难度较大，通常仅能获得少量样本（最多5–7 µL或更少）。本方案详细描述了一种改进现有采集方法的技术，可最大限度减少血液污染，并实现脑脊液的充分采集（平均可采集10–15 µL）。该技术可与其他小鼠组织取材的解剖方法联合使用，因为在脑脊液提取过程中不会影响任何组织。因此，采用该技术后，脑和脊髓未受干扰，保持完整。通过获得更大量且更纯净的脑脊液样本，可对该体液开展更多分析，进一步推动神经科学研究，加深对影响脑和脊髓疾病的理解。
引言
脑脊液（CSF）是神经科学研究中一种有价值的体液，主要用于分析。脑脊液主要由血浆生成，细胞含量极少（无红细胞，仅有少量白细胞），几乎不含蛋白质。它是与中枢神经系统（CNS）密切接触的体液之一，能够将多种电解质从脑和脊髓转运至外周系统。在人类中，可通过腰椎穿刺（又称脊椎穿刺）这一轻微的侵入性操作采集脑脊液样本，用于临床诊断疾病或参与临床试验的研究。由于脑脊液能够反映中枢神经系统的改变，而无需直接获取这些组织，因此近年来在临床研究中，已从阿尔茨海默病及其他类型痴呆等神经退行性疾病患者中获取脑脊液样本1,2,3。目前已有多种基于脑脊液样本开发的生物标志物检测方法，有望辅助临床疾病的诊断2,3。然而，这些检测方法在产生一致且敏感的结果以特异性诊断疾病方面的可靠性仍存在广泛争议4,5。因此，迫切需要开发更优的检测方法和靶点，这些靶点可存在于脑脊液中，以助于建立一种具有更高敏感性和特异性的标准技术，用于诊断神经退行性疾病。鉴于人脑脊液样本在疾病研究中的潜在重要性，在神经科学研究中，从啮齿类动物中采集脑脊液也受到广泛关注。
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方案
所有动物实验均按照美国神经科学学会（Society for Neuroscience, USA）和复旦大学（中国上海）伦理委员会的政策进行。本操作适用于非存活手术。
1. 脑脊液采集装置的设置
- 使用显微拉针仪将玻璃毛细管（内径 0.75 mm，外径 1.0 mm）拉制成细针（如 Liu et al.10 所示；锐化的毛细管见图 1）。
- 将锐化的玻璃毛细管牢固地插入安装在显微操作器上的毛细管固定器中（图 1A）。
- 在解剖显微镜下，用直头镊子折断锐化毛细管的尖端，使断裂后的尖端内径约为 10–20 µm（图 1C）。
- 将一根细管和一个注射器连接到毛细管固定器的另一端，并通过三通阀连接细管与注射器。
- 转动三通阀至开放位置，推动注射器活塞，使空气从注射器经管道吹入玻璃毛细管，以清除任何污染物并在毛细管内形成正压。
- 在最后一次将注射器重新连接至三通阀前，重复数次断开和重新连接注射器的操作，并在每次连接前将注射器抽吸约 100–200 µL（图 1B）。 ....
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结果
采用此处所述方法（图1 和 图2），毛细管中立即采集的脑脊液应为无色透明（图2E），不得呈粉红色或红色。若毛细管中采集的液体出现粉红至红色，则提示存在血液污染。
作为应用本方法采集的脑脊液样本的一个示例，采用ELISA检测了蛋白质β-淀粉样蛋白（Aβ）的水平。在阿尔茨海默病研究中，通常需要检测脑脊液中Aβ的含量7。脑脊液几乎不含蛋白质。在阿尔茨海默病小鼠模型（APP/PS1小鼠）中，由于这些小鼠过表达人源APP，其脑脊液中人源Aβ42的水平显著升高。通过本方案采集的12月龄小鼠脑脊液样本可观察到这一差异（野生型（WT）小鼠脑脊液中为0 pg/mL，而APP/PS1小鼠脑脊液中为1,303 pg/mL，
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讨论
本方案详细描述了一种改进现有脑脊液（CSF）采集方法的技术10，旨在最大限度减少血液污染，并实现从小鼠中大量采集脑脊液（平均可获得约 10–15 µL）。在折断毛细管尖端时，其尖端 不宜过小（否则脑脊液提取速度会非常缓慢），也不宜过大（否则无法精细采集脑脊液，且组织可能堵塞毛细管）。进行脑脊液采集区域的解剖时应格外小心：任何出血都应予以止住，并用 dH2O 将玻璃毛细管插入区域的血液清洗干净，以避免样本污染。每只小鼠的解剖结构存在差异，但大多数小鼠在毛细管需插入的区域均有一至两条主要血管穿过。选择正确的插入位置至关重要，若插入位置过于靠近主要血管，则会导致脑脊液被血液污染。如图2所示，应优先选择无血管区域（例如主要血管之间或两侧）进行毛细管插入，以避免污染。若脑脊液未能持续稳定流出并在一段时间后停止，可轻微回抽注射器（约 50 µL）以帮助恢复脑脊液流入毛细管。或者，也可使用显微操作仪缓慢、轻柔地将毛细管略微进出移动，以重新启动脑脊液的提取流程。执行这些操作时必须谨慎，以防血液流入毛细管内。该技术之.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到中国国家自然科学基金（81650110527，81371400）和中国国家重点基础研究发展计划（2013CB530900）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 水合氯醛（用作麻醉剂） | 国药集团化学试剂有限公司 | 30037517 | CAS 编号 302-17-0。 |
| 解剖剪 | 66 视界科技 | 54002 | |
| 解剖弯头镊 | 66 视界科技 | 53072 | |
| 解剖直头镊 | 66 视界科技 | 53070 | |
| 小鼠适配器（带耳杆） | 自制。 | N/A | World Precision Instruments 公司提供类似设备。 |
| 解剖显微镜 | Meiji Labax | 型号 15381 | |
| 显微操作器 | World Precision Instruments | M3301 | |
| 显微操作器磁力底座 | Kanetec | MB-K | |
| 玻璃毛细管 | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| 微量移液器拉制仪 | Sutter Instruments | 型号 P-1000 | |
| 注射器（1 ml） | Tansoole | 02024692 | 适用于 1 ml。 |
| 微量离心管（1.5 ml） | Axygen | MCT-150-C | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 III（无 EDTA） | Calbiochem | 539134 | |
| 人 Aβ42 ELISA 试剂盒 | Invitrogen | KHB3441 | |
| 管道（聚四氟乙烯管） | World Precision Instruments | MMP-KIT | 取自显微注射套件，并连接至毛细管固定器和注射器。 |
| 小型离心机 | 天根生化科技 | OSE-MC8 | |
| 棉签 | 可从任意日用品商店或药店获取。 | N/A |
参考文献
- Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol....
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